氨基酸二氢青蒿素衍生物及其制备方法与应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201510285082.3	申请日：	20150529
公开号：	CN104892627B	公开日：	20170329
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	C07D493/20,A61P35/00	主分类号：	C07D493/20,A61P35/00
申请人：	石家庄学院
发明人：	张宝华,史兰香,郭瑞霞,刘斯婕
地址：	050035 河北省石家庄市高新技术开发区长江大道6号
优先权：	CN201510285082A
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内容摘要

一类氨基酸二氢青蒿素衍生物或其药学可接受的盐、水合物（I），包括其立体异构体或互变异构体。式中，R1，R2，R3为各自独立的H、烃基，所述烃基可以被氨基、取代氨基、羧基、羟基、巯基、酯基、芳基、取代芳基、芳杂环、取代芳杂环的取代基任意取代；n为0‑10的整数。本发明还涉及该类化合物的制备方法及在肿瘤治疗中的用途。

权利要求书

1.一类氨基酸二氢青蒿素衍生物，其特征在于：它具有如下通式：式（I）所述的化合物具体选自：（3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR）-八氢-3-（甘氨酸）亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4,3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇（1）；（3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR）-八氢-3-（苯丙氨酸）亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4,3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇（2）；（3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR）-八氢-3-（半胱氨酸）亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4,3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇（3）；（3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR）-八氢-3-（苯丙氨酸甲酯）亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4,3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇（4）；（3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR）-八氢-3-（丙氨酰苯丙氨酸）亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4,3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇（5）；（3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR）-八氢-3-（谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4,3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇（6）。 2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于：该方法的反应式如下所示：；式中，X为Cl，Br；其中，所述反应溶剂选自DMF、乙腈、THF；所述碱选自KCO，NaCO。 3.权利要求1所述的化合物在制备抗癌药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及氨基酸二氢青蒿素衍生物及其制备方法与作为抗癌药的应用。

背景技术

近年来，研究发现双氢青蒿素是青篙素类衍生物在体内的主要活性代谢产物，对癌细胞的杀伤作用很强，为了寻找稳定性更好、抗癌作用更强的青蒿素类药物，化学家们在保留过氧桥键的基础上，主要在双氢青蒿素10位碳上的羟基键引入一些亲水、亲脂基团进行结构修饰，合成了烷基醚、芳香醚、酯类、杂原子取代、二聚体化合物等几百种新的青蒿素衍生物,并发现部分烷基醚、芳香醚类和双活性二聚体化合物比青蒿素具有更强的抗肿瘤活性。例如，最具有代表性的青蒿琥酯的钠盐,被发现具有强的抗白血病与抗乳腺癌、卵巢癌等作用。

肿瘤细胞组织为了蛋白质合成和细胞增生，比正常细胞组织更加需要不断摄取多种必需氨基酸和非必需氨基酸为肿瘤细胞增殖所必需的营养物质。氨基酸具有对生物体的特殊的渗透性和酶催化专一性，而青蒿素类药物对癌细胞选择性较差，本发明将氨基酸作为载体，将有抗癌作用的二氢青蒿素分子引入机体，增强药物在机体内的溶解和吸收，即抑制了癌细胞，又降低了药物的毒性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种氨基酸二氢青蒿素衍生物，其具有良好的抗癌活性，并且毒性较低。

本发明的另一目的在于提供上述氨基酸二氢青蒿素衍生物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述氨基酸二氢青蒿素衍生物的用途。

以下对本发明进行详细描述。

本发明提供以下式（I）的氨基酸二氢青蒿素衍生物或其药学可接受的盐。结构如下图所示。

R1，R2，R3为各自独立的H、烃基，所述烃基可以被氨基、取代氨基、羧基、羟基、巯基、酯基、芳基、取代芳基、芳杂环、取代芳杂环的取代基任意取代；n 为0-10的整数。

本发明通式（I）化合物包括其立体异构体和互变异构体。

本发明还提供了式（I）的化合物的制备方法，如下图所示：

式中，X为 Cl，Br；R1，R2，R3为各自独立的H、烃基；n 为0-10的整数。

本发明的氨基酸二氢青蒿素衍生物的制备方法，所述反应溶剂为DMF、乙腈、THF、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、四氯化碳，优选DMF、乙腈、THF。

本发明的氨基酸二氢青蒿素衍生物的制备方法，所述碱为有机碱和无机碱，优选无水K2CO3，Na2CO3。

本发明的氨基酸二氢青蒿素衍生物有显著的抗癌作用和较低毒性。

通过以下实施例进一步举例说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。

具体实施方式

实施例1

（3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR）-八氢-3-（甘氨酸）亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4, 3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇（1）的制备

化合物（1）的结构如下所示：

将1.50g (0.012mol)甘氨酸甲酯盐酸盐和3.45g (0.025mol)无水K2CO3粉末悬浮于20mLTHF中，加入3.62g (0.01mol)（3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR）-八氢-3-溴亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4, 3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇，剧烈搅拌，反应24小时，减压蒸出溶剂，加入20mL水和20mL二氯甲烷搅拌10分钟，分层，水层用二氯甲烷提取15mLX2，合并有机相，有机层脱水、浓缩，柱层析纯化，得到甘氨酸甲酯二氢青蒿素。

向3.71g (0.01mol)甘氨酸甲酯二氢青蒿素中加入10mL甲醇和12mL 1mol·L-1的NaOH溶液，室温反应1小时，蒸出甲醇，残液用2-3mL的1mol·L-1的HCl溶液调pH=6，析出固体，过滤，干燥，得到化合物（1），收率81%。

实施例2

（3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR）-八氢-3-（苯丙氨酸）亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4, 3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇（2）的制备

化合物（2）的结构如下所示：

用2.58g (0.012mol)苯丙氨酸甲酯盐酸盐代替1.50g (0.012mol)甘氨酸甲酯盐酸盐，用2-3mL的1mol·L-1的HCl溶液调pH=5.5，其它操作按实施例1，得到化合物（2），收率84%。

实施例3

（3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR）-八氢-3-（半胱氨酸）亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4, 3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇（3）的制备

化合物（3）的结构如下所示：

将4.04g (0.012mol)S-苄基半胱氨酸苄酯盐酸盐和3.45g (0.025mol)无水K2CO3粉末悬浮于20mLDMF中，加入3.62g (0.01mol)（3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR）-八氢-3-溴亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4, 3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇，剧烈搅拌，反应24小时，减压蒸出溶剂，加入20mL水和20mL二氯甲烷搅拌10分钟，分层，水层用二氯甲烷提取15mLX2，合并有机相，有机层脱水、浓缩，残渣加入10mL甲醇和0.5g 5%的Pd-C,通入氢气，反应2小时，过滤，浓缩，柱层析纯化，得到化合物（3），收率72%。

实施例4

（3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR）-八氢-3-（苯丙氨酸甲酯）亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4, 3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇（4）的制备

化合物（4）的结构如下所示：

将2.58g (0.012mol)苯丙氨酸甲酯盐酸盐和2.65g (0.025mol)无水Na2CO3粉末悬浮于20mLTHF中，加入3.62g (0.01mol)（3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR）-八氢-3-溴亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4, 3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇，剧烈搅拌，反应24小时，减压蒸出溶剂，加入20mL水和20mL二氯甲烷搅拌10分钟，分层，水层用二氯甲烷提取15mLX2，合并有机相，有机层脱水、浓缩，柱层析纯化，得到化合物（4），收率89%。

实施例5

（3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR）-八氢-3-（丙氨酰苯丙氨酸）亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4, 3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇（5）的制备

化合物（5）的结构如下所示：

将3.43g (0.012mol)丙氨酰苯丙氨酸甲酯盐酸盐和3.45g (0.025mol)无水K2CO3粉末悬浮于20mLTHF中，加入3.62g (0.01mol)（3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR）-八氢-3-溴亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4, 3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇，剧烈搅拌，反应24小时，减压蒸出溶剂，加入20mL水和20mL二氯甲烷搅拌10分钟，分层，水层用二氯甲烷提取15mLX2，合并有机相，有机层脱水、浓缩，柱层析纯化，得到丙氨酰苯丙氨酸甲酯二氢青蒿素。

向5.32g (0.01mol)丙氨酰苯丙氨酸甲酯二氢青蒿素中加入12mL甲醇和12mL 1mol·L-1的NaOH溶液，室温反应1小时，蒸出甲醇，残液用2-3mL的1mol·L-1的HCl溶液调pH=5.5，析出固体，过滤，干燥，得到化合物（5），收率64%。

实施例6

（3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR）-八氢-3-（谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4, 3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇的制备

化合物（6）的结构如下所示：

用6.92g (0.012mol)谷氨酰（S-苄基）半胱氨酰甘氨酸二苄酯盐酸盐代替4.04g (0.012mol)S-苄基半胱氨酸苄酯盐酸盐，其它操作按实施例3，得到化合物（6），收率57%。

实施例7

选用人白血病 HL-60 细胞，应用细胞计数法对氨基酸二氢青蒿素衍生物的细胞生长抑制作用进行了研究。

一、材料与方法

1．材料

HL-60 细胞(美国组织培养中心ATCC, Rocksville, Maryland, USA)；牛血清（FCS,Gibco）；100IU/mL 青霉素（华北制药集团）；100mg/mL 链霉素（华北制药集团）；1mmol/L L–谷氨酸（石家庄冀荣氨基酸公司）；双氢青蒿素纯品（由广州新南方青蒿药业有限公司提供）。

2．抑制活性实验方法：

2.1 细胞培养

HL-60 细胞培养于含有 10%经加热灭活的胎牛血清、100IU/mL 青霉素、100mg/mL 链霉素及 1mmol/L L–谷氨酸的RPMIl640 培养基中，37℃、5%CO2饱和湿度孵箱中孵育。

2.2 试剂的配制

4%台盼蓝母液：称取 4g 台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至 100mL，用滤纸过滤，4℃保存，使用时用 PBS 稀释至 0.4％。

2.3 细胞存活率的测定收集对数生长期细胞以 5×104/mL 的浓度接种于 24 孔板中，按要求分别加入不同浓度的不同氨基酸二氢青蒿素衍生物，37℃继续培养72hr。

2.4 制备单个细胞悬液及染色：取 0.4％的台盼蓝溶液 50μL，单个细胞悬液 50μL 混匀后计数。

2.5计数：在 3 分钟，用血球计数板分别计活细胞数和死细胞数。

2.6结果：镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。

细胞存活率计算公式：

Viability％＝活细胞总数 /（活细胞数总数＋死细胞总数）х 100%

三结果

氨基酸二氢青蒿素衍生物对人白血病细胞HL-60 细胞抑制活性结果见表1。结果显示，制备的氨基酸二氢青蒿素衍生物对人白血病细胞HL-60 细胞有显著的抑制作用。

资源描述

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510285082.3 (22)申请日 2015.05.29 (65)同一申请的已公布的文献号申请公布号 CN 104892627 A (43)申请公布日 2015.09.09 (73)专利权人石家庄学院地址 050035 河北省石家庄市高新技术开发区长江大道6号 (72)发明人张宝华史兰香郭瑞霞刘斯婕 (51)Int.Cl. C07D 493/20(2006.01) A61P 35/00(2006.01) 审查员黄凯 (54)发明名称氨基酸二氢青蒿素衍生物及其制。

2、备方法与应用 (57)摘要一类氨基酸二氢青蒿素衍生物或其药学可接受的盐、水合物（I），包括其立体异构体或互变异构体。式中， R1， R2， R3为各自独立的H、烃基，所述烃基可以被氨基、取代氨基、羧基、羟基、巯基、酯基、芳基、取代芳基、芳杂环、取代芳杂环的取代基任意取代； n为0-10的整数。本发明还涉及该类化合物的制备方法及在肿瘤治疗中的用途。权利要求书1页说明书5页 CN 104892627 B 2017.03.29 CN 104892627 B 1.一类氨基酸二氢青蒿素衍生物，其特征在于：它具有如下通式：式（I）所述的化合物具。

3、体选自：（3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR） -八氢-3- （甘氨酸）亚甲基-6， 9-二甲基-3， 12-桥氧- 12H-吡喃并4,3-j-1,2-苯并二噻平-10 （3H）醇（1）；（3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR） -八氢-3- （苯丙氨酸）亚甲基-6， 9-二甲基-3， 12-桥氧- 12H-吡喃并4,3-j-1,2-苯并二噻平-10 （3H）醇（2）；（3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR） -八氢-3- （半胱氨酸）亚甲基-6， 9-二甲基-3， 12-桥氧- 12H-吡喃并4,3-j-1,2-苯并二噻平-。

4、10 （3H）醇（3）；（3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR） -八氢-3- （苯丙氨酸甲酯）亚甲基-6， 9-二甲基-3， 12- 桥氧-12H-吡喃并4,3-j-1,2-苯并二噻平-10 （3H）醇（4）；（3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR） -八氢-3- （丙氨酰苯丙氨酸）亚甲基-6， 9-二甲基-3， 12-桥氧-12H-吡喃并4,3-j-1,2-苯并二噻平-10 （3H）醇（5）；（3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR） -八氢-3- （谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）亚甲基-6， 9-二甲基-3， 12-桥氧-1。

5、2H-吡喃并4,3-j-1,2-苯并二噻平-10 （3H）醇（6）。 2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于：该方法的反应式如下所示：；式中， X为 Cl， Br；其中，所述反应溶剂选自DMF、乙腈、 THF；所述碱选自K2CO3， Na2CO3。 3.权利要求1所述的化合物在制备抗癌药物中的应用。权利要求书 1/1 页 2 CN 104892627 B 2 氨基酸二氢青蒿素衍生物及其制备方法与应用技术领域 0001 本发明涉及氨基酸二氢青蒿素衍生物及其制备方法与作为抗癌药的应用。背景技术 0002 近年来，研究发现双氢青蒿素是青篙素类衍生物在体内的主要活。

6、性代谢产物，对癌细胞的杀伤作用很强，为了寻找稳定性更好、抗癌作用更强的青蒿素类药物，化学家们在保留过氧桥键的基础上，主要在双氢青蒿素10位碳上的羟基键引入一些亲水、亲脂基团进行结构修饰，合成了烷基醚、芳香醚、酯类、杂原子取代、二聚体化合物等几百种新的青蒿素衍生物,并发现部分烷基醚、芳香醚类和双活性二聚体化合物比青蒿素具有更强的抗肿瘤活性。例如，最具有代表性的青蒿琥酯的钠盐,被发现具有强的抗白血病与抗乳腺癌、卵巢癌等作用。 0003 肿瘤细胞组织为了蛋白质合成和细胞增生，比正常细胞组织更加需要不断摄取多种必需氨基酸和非必需氨基酸为肿瘤细胞增殖所必需的。

7、营养物质。氨基酸具有对生物体的特殊的渗透性和酶催化专一性，而青蒿素类药物对癌细胞选择性较差，本发明将氨基酸作为载体，将有抗癌作用的二氢青蒿素分子引入机体，增强药物在机体内的溶解和吸收，即抑制了癌细胞，又降低了药物的毒性。发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种氨基酸二氢青蒿素衍生物，其具有良好的抗癌活性，并且毒性较低。 0005 本发明的另一目的在于提供上述氨基酸二氢青蒿素衍生物的制备方法。 0006 本发明的再一目的在于提供上述氨基酸二氢青蒿素衍生物的用途。 0007 以下对本发明进行详细描述。 0008 本发明提供以下式（I）的氨基酸二氢青蒿素衍生物或其药。

8、学可接受的盐。结构如下图所示。 0009 0010 R1， R2， R3为各自独立的H、烃基，所述烃基可以被氨基、取代氨基、羧基、羟基、巯基、酯基、芳基、取代芳基、芳杂环、取代芳杂环的取代基任意取代； n 为0-10的整数。 0011 本发明通式（I）化合物包括其立体异构体和互变异构体。 0012 本发明还提供了式（I）的化合物的制备方法，如下图所示：说明书 1/5 页 3 CN 104892627 B 3 0013 0014 式中， X为 Cl， Br； R1， R2， R3为各自独立的H、烃基； n 为0-10的整数。 0015 本发明的氨基酸二氢青。

9、蒿素衍生物的制备方法，所述反应溶剂为DMF、乙腈、 THF、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、四氯化碳，优选DMF、乙腈、 THF。 0016 本发明的氨基酸二氢青蒿素衍生物的制备方法，所述碱为有机碱和无机碱，优选无水K2CO3， Na2CO3。 0017 本发明的氨基酸二氢青蒿素衍生物有显著的抗癌作用和较低毒性。 0018 通过以下实施例进一步举例说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。具体实施方式 0019 实施例1 0020 （3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR） -八氢-3- （甘氨酸）亚甲基-6， 9-二甲。

10、基-3， 12-桥氧-12H-吡喃并4, 3-j-1,2-苯并二噻平-10 （3H）醇（1）的制备 0021 化合物（1）的结构如下所示： 0022 0023 将1.50g (0.012mol)甘氨酸甲酯盐酸盐和3.45g (0.025mol)无水K2CO3粉末悬浮于20mLTHF中，加入3.62g (0.01mol) （3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR） -八氢-3-溴亚甲基-6， 9-二甲基-3， 12-桥氧-12H-吡喃并4, 3-j-1,2-苯并二噻平-10 （3H）醇，剧烈搅拌，反应24小时，减压蒸出溶剂，加入20mL水和20。

11、mL二氯甲烷搅拌10分钟，分层，水层用二氯甲烷提取15mLX2，合并有机相，有机层脱水、浓缩，柱层析纯化，得到甘氨酸甲酯二氢青蒿素。 0024 向3.71g (0.01mol)甘氨酸甲酯二氢青蒿素中加入10mL甲醇和12mL 1molL-1的 NaOH溶液，室温反应1小时，蒸出甲醇，残液用2-3mL的1molL-1的HCl溶液调pH=6，析出固体，过滤，干燥，得到化合物（1），收率81%。 0025 实施例2 0026 （3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR） -八氢-3- （苯丙氨酸）亚甲基-6， 9-二甲基- 3， 12-。

12、桥氧-12H-吡喃并4, 3-j-1,2-苯并二噻平-10 （3H）醇（2）的制备 0027 化合物（2）的结构如下所示：说明书 2/5 页 4 CN 104892627 B 4 0028 0029 用2.58g (0.012mol)苯丙氨酸甲酯盐酸盐代替1.50g (0.012mol)甘氨酸甲酯盐酸盐，用2-3mL的1molL-1的HCl溶液调pH=5.5，其它操作按实施例1，得到化合物（2），收率 84%。 0030 实施例3 0031 （3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR） -八氢-3- （半胱氨酸）亚甲基-6， 9-二甲基- 3，。

13、 12-桥氧-12H-吡喃并4, 3-j-1,2-苯并二噻平-10 （3H）醇（3）的制备 0032 化合物（3）的结构如下所示： 0033 0034 将4.04g (0.012mol)S-苄基半胱氨酸苄酯盐酸盐和3.45g (0.025mol)无水K2CO3 粉末悬浮于20mLDMF中，加入3.62g (0.01mol) （3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR） -八氢-3-溴亚甲基-6， 9-二甲基-3， 12-桥氧-12H-吡喃并4, 3-j-1,2-苯并二噻平-10 （3H）醇，剧烈搅拌，反应24小时，减压蒸出溶剂，加入20mL水和20。

14、mL二氯甲烷搅拌10分钟，分层，水层用二氯甲烷提取15mLX2，合并有机相，有机层脱水、浓缩，残渣加入10mL甲醇和0.5g 5% 的Pd-C,通入氢气，反应2小时，过滤，浓缩，柱层析纯化，得到化合物（3），收率72%。 0035 实施例4 0036 （3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR） -八氢-3- （苯丙氨酸甲酯）亚甲基-6， 9-二甲基-3， 12-桥氧-12H-吡喃并4, 3-j-1,2-苯并二噻平-10 （3H）醇（4）的制备 0037 化合物（4）的结构如下所示： 0038 0039 将2.58g (0.012。

15、mol)苯丙氨酸甲酯盐酸盐和2.65g (0.025mol)无水Na2CO3粉末悬浮于20mLTHF中，加入3.62g (0.01mol) （3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR） -八氢-3-溴亚甲基-6， 9-二甲基-3， 12-桥氧-12H-吡喃并4, 3-j-1,2-苯并二噻平-10 （3H）醇，剧烈搅拌，反应24小时，减压蒸出溶剂，加入20mL水和20mL二氯甲烷搅拌10分钟，分层，水层用二氯甲烷提取15mLX2，合并有机相，有机层脱水、浓缩，柱层析纯化，得到化合物（4），收率89%。 0040 实施例5 0041 （。

16、3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR） -八氢-3- （丙氨酰苯丙氨酸）亚甲基-6， 9- 说明书 3/5 页 5 CN 104892627 B 5 二甲基-3， 12-桥氧-12H-吡喃并4, 3-j-1,2-苯并二噻平-10 （3H）醇（5）的制备 0042 化合物（5）的结构如下所示： 0043 0044 将3.43g (0.012mol)丙氨酰苯丙氨酸甲酯盐酸盐和3.45g (0.025mol)无水K2CO3 粉末悬浮于20mLTHF中，加入3.62g (0.01mol) （3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR） -八。

17、氢-3-溴亚甲基-6， 9-二甲基-3， 12-桥氧-12H-吡喃并4, 3-j-1,2-苯并二噻平-10 （3H）醇，剧烈搅拌，反应24小时，减压蒸出溶剂，加入20mL水和20mL二氯甲烷搅拌10分钟，分层，水层用二氯甲烷提取15mLX2，合并有机相，有机层脱水、浓缩，柱层析纯化，得到丙氨酰苯丙氨酸甲酯二氢青蒿素。 0045 向5.32g (0.01mol)丙氨酰苯丙氨酸甲酯二氢青蒿素中加入12mL甲醇和12mL 1molL-1的NaOH溶液，室温反应1小时，蒸出甲醇，残液用2-3mL的1molL-1的HCl溶液调pH =5.5，析出固体，过滤，干燥，。

18、得到化合物（5），收率64%。 0046 实施例6 0047 （3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR） -八氢-3- （谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）亚甲基-6， 9-二甲基-3， 12-桥氧-12H-吡喃并4, 3-j-1,2-苯并二噻平-10 （3H）醇的制备 0048 化合物（6）的结构如下所示： 0049 0050 用6.92g (0.012mol)谷氨酰（S-苄基）半胱氨酰甘氨酸二苄酯盐酸盐代替4.04g (0.012mol)S-苄基半胱氨酸苄酯盐酸盐，其它操作按实施例3，得到化合物（6），收率57%。 0051 实施例7 0052 选。

19、用人白血病 HL-60 细胞，应用细胞计数法对氨基酸二氢青蒿素衍生物的细胞生长抑制作用进行了研究。 0053 一、材料与方法 0054 1 材料 0055 HL-60 细胞(美国组织培养中心ATCC, Rocksville, Maryland, USA)；牛血清（FCS,Gibco）； 100IU/mL 青霉素（华北制药集团）； 100mg/mL 链霉素（华北制药集团）； 1mmol/L L谷氨酸（石家庄冀荣氨基酸公司）；双氢青蒿素纯品（由广州新南方青蒿药业有限公司提供）。 0056 2 抑制活性实验方法：说明书 4/5 页 6 CN 104892627 B 。

20、6 0057 2.1 细胞培养 0058 HL-60 细胞培养于含有 10%经加热灭活的胎牛血清、 100IU/mL 青霉素、 100mg/mL 链霉素及 1mmol/L L谷氨酸的RPMIl640 培养基中， 37、 5%CO2饱和湿度孵箱中孵育。 0059 2.2 试剂的配制 0060 4%台盼蓝母液：称取 4g 台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至 100mL，用滤纸过滤， 4保存，使用时用 PBS 稀释至 0.4。 0061 2.3 细胞存活率的测定收集对数生长期细胞以 5104/mL 的浓度接种于 24 孔板中，按要求分别加入不同浓度的不同氨基酸二氢青蒿素衍生物， 3。

21、7继续培养72hr。 0062 2.4 制备单个细胞悬液及染色：取 0.4的台盼蓝溶液 50 L，单个细胞悬液 50 L 混匀后计数。 0063 2.5计数：在 3 分钟，用血球计数板分别计活细胞数和死细胞数。 0064 2.6结果：镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。 0065 细胞存活率计算公式： 0066 Viability活细胞总数 / （活细胞数总数死细胞总数） 100% 0067 三结果 0068 氨基酸二氢青蒿素衍生物对人白血病细胞HL-60 细胞抑制活性结果见表1。结果显示，制备的氨基酸二氢青蒿素衍生物对人白血病细胞HL-60 细胞有显著的抑制作用。 0069 说明书 5/5 页 7 CN 104892627 B 7 。

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