漆酶基因及工程菌与用途.pdf

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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201210059360.X (22)申请日 2012.03.08 C12N 15/53(2006.01) C12N 9/02(2006.01) C12N 15/10(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C02F 3/34(2006.01) C12R 1/125(2006.01) C12R 1/84(2006.01) C02F 103/28(2006.01) (73)专利权人 浙江商达环保有限公司 地址 310000 浙江省杭州市西湖区文二路 164 号杭州商学院内 (72)发明人 郑展望 杨瑾 (74)专利代理机构 。

2、杭州裕阳专利事务所 ( 普通 合伙 ) 33221 代理人 应圣义 王松等 . 漆酶去除造纸废水中木素及多酚类 化合物应用 .环境科学与技术 .2008, 第 31 卷 ( 第 7 期 ), 第 53 页第 2 栏最后 1 段， 第 56 页第 2 栏第 2 段 . Kasahara Y et al.GenBank Accession AB007638.1.GenBank .1999, 第 5-10 页 . 刘朔 . 纳豆激酶基因密码子优化设计与合成 及在毕赤酵母中的高效表达 .中国博士学位论 文全文数据库基础科学辑 .2009,( 第 2 期 ), 第 17-18 页表 1-3 及其表注 .。

3、 (54) 发明名称 漆酶基因及工程菌与用途 (57) 摘要 本发明涉及环境生物领域， 公开了一种漆酶 基因及漆酶基因工程菌与其在微生物法水解处理 造纸废水中的应用。漆酶基因， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO:2 所示， 漆酶基因编码的蛋白质， 其氨 基酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。本发明提供的按 毕赤酵母偏爱密码子优化的漆酶基因， 能够在酵 母菌中高效组成型表达， 可提高漆酶的表达活力， 对于促进漆酶在造纸废水生物处理中的应用具有 重要意义。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 许慧娜 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书。

4、5页 序列表2页 附图1页 CN 103305536 B 2016.03.30 CN 103305536 B 1/1 页 2 1.一种漆酶基因， 其特征在于 ： 其核苷酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。 2.根据权利要求 1 所述的漆酶基因， 其特征在于 ： 所述的漆酶基因编码的蛋白质的氨 基酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。 3.漆酶基因工程菌， 其特征在于 ： 为含有权利要求 1 或 2 所述漆酶基因的工程菌。 4.权利要求 3 所述的漆酶基因工程菌的用途， 其特征在于 ： 用于水解处理造纸废水。 5.根据权利要求 4 所述的漆酶基因工程菌的用途， 其特征在于 ： 将漆酶基因工。

5、程菌进 行扩大培养后， 按 0.05的添加量添加到废水池中进行处理。 权 利 要 求 书 CN 103305536 B 2 1/5 页 3 漆酶基因及工程菌与用途 技术领域 0001 本发明涉及环境生物领域， 特别涉及一种漆酶基因及漆酶基因工程菌与其在微生 物法水解处理造纸废水中的应用。 背景技术 0002 漆酶是一种结合多个铜原子的蛋白质， 属于铜蓝氧化酶。 漆酶作用底物相当广泛， 能够对多种污染物如各种酚类染料、 取代酚、 氯酚、 硫酚、 双酚、 芳香胺等。漆酶是近年发现 在造纸工业中最具潜力的生物酶， 具有催化氧化木素的能力。漆酶能选择性地催化木质素 降解， 不会产生有毒物质， 并且生产。

6、在常温、 常压的温和条件下进行， 节约设备和能耗。 因此 漆酶在造纸工业废水处理等方面有着非常巨大的应用前景。 0003 分泌漆酶的真菌主要有担子菌、 多孔菌、 半知菌、 子囊菌、 脉胞菌、 柄孢壳菌和曲霉 菌等属种， 其中绝大部分分布于担子菌， 其次是子囊菌， 研究最多的是担子菌亚门的白腐 菌， 但是目前还没有在酵母中发现内源性漆酶的存在。 （SUZUKI T, et al, 2003） 0004 随着研究的不断深入， 人们发现一些原核生物也产漆酶， 如 1993 年从稻草根上第 一次分离出产漆酶的细菌生脂固氮螺菌 （G ivaudan,et al.1993） 。 随后人们陆续在许 多细菌中。

7、发现了漆酶如链霉菌、 枯草芽孢杆菌、 水生细菌、 海洋细菌等。 0005 毕赤酵母 (Pichia pastoris) 表达系统是近十年发展起来的真核表达体系， 是目 前最为成功的外源蛋白表达系统之一， 与现有的其它表达系统相比， 毕赤酵母在表达产物 的加工、 外分秘、 翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势。 将漆酶基因按毕赤酵母 的密码子偏好性进行设计， 在毕赤酵母中进行组成型表达， 能大幅度提到基因的表达水平， 同时应用于造纸废水的生物处理中。 发明内容 0006 本发明的目的在于克服现有技术中的不足， 提供一种漆酶的核苷酸序列， 本发明 按毕赤酵母密码子偏好性对漆酶基因进行优化， 。

8、并将该基因在毕赤酵母中实现高效组成型 表达， 从而应用于造纸废水的生物处理中。 0007 为了解决上述技术问题， 本发明通过下述技术方案得以解决 ： 0008 本发明所述优化后的漆酶基因编码的蛋白质， 其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。 0009 本发明的漆酶基因按如下毕赤酵母偏爱密码子的优先结构设计见表 1 ： 0010 氨基酸 代码密码氨基酸 代码密码 LeuLTTGHisHCAT IleIATTGlnQCAA MetMATGAsnNAAC ValVGTTLysKAAG SerSTCTAspDGAT ProPCCAGluEGAA ThrTACTCysCTGT 说 明 书 CN 10。

9、3305536 B 3 2/5 页 4 AlaAGCTTrpWTGG PheFTTTTyrYTAC ArgRAGAGlyGGGT End TAA 0011 本发明的优化的漆酶基因采用连续延伸 PCR 方法制备而成， 使用的基因模板为枯 草芽孢杆菌的 cotA 基因序列 （GENE ID: 936023） 。 0012 本发明还涉及含有所述基因的重组载体， 将含有所述基因的重组载体转化至宿主 菌 （通常为毕赤酵母菌） 中， 进行表达， 即可获得本发明漆酶。 0013 本发明还涉及所述基因在制备重组漆酶中的应用。 0014 本发明还涉及所述的漆酶在造纸废水生物处理中的应用。 本发明的漆酶的最适温 。

10、度是 2535， 最适 pH 为 4.55.5。 0015 本发明由于采用了以上技术方案， 具有显著的技术效果 ： 0016 本发明提供了一种按毕赤酵母偏爱密码子优化的漆酶基因， 能够在酵母菌中高效 组成型表达， 可提高漆酶的表达活力， 对于促进漆酶在造纸废水生物处理中的应用具有重 要意义。 附图说明 0017 图 1 为漆酶的最适 pH 曲线 ； 0018 图 2 为漆酶的最适温度曲线。 具体实施方式 0019 下面结合附图 1 至附图 2 与实施例对本发明作进一步详细描述 ： 0020 实施例 1 0021 漆酶基因密码子的优化 0022 根据枯草芽孢杆菌的 cotA 基因序列 （GENE。

11、 ID: 936023） ， 同时结合毕赤酵母表 达的密码子偏好性， 对 cotA 基因序列进行密码子优化， 同时在基因全长上下游引入酶切位 点 ： EcoR 和 Not 。同时， 为了防止优化后的基因序列含有 EcoR 酶切位点及后续 DNA 线性化Bgl II酶切位点， 同时调整优化后基因的GC含量， 故将第855个碱基A突变为G， 第 1098 个碱基 T 突变为 C。基因全长 1542 个碱基， 编码 514 个氨基酸。优化后的漆酶基因命 名为 Tcot。 0023 设计基因两端酶切位点和保护碱基， 设计引物如下所示 ： 0024 P1:ACGGAATTCATGACTTTGGAAAAG。

12、TTTGTTGATGCTTTGCCAATTCCAGATACTTTGAAGCCAGTT CAAC 0025 P2:TTGATGAGTACATTCTTCCATAGTAACTTCGTAGTAAGTCTTTTCCTTAGATTGTTGAACTGGCTT CAAAGTA 0026 P3:AGAATGTACTCATCAATTGCATAGAGATTTGCCACCAACTAGATTGTGGGGTTACAACGGTTTGTT TCCA 0027 P4:TGTTCATCCACTTAACGTAAACGTTTTCGTTTCTCTTAACTTCAATAGTTGGACCTGGAAACAAAC CGTT 0028 P5:G。

13、TTAAGTGGATGAACAACTTGCCATCTACTCATTTTTTGCCAATTGATCATACTATTCATCATTCT 说 明 书 CN 103305536 B 4 3/5 页 5 GATTCTCA 0029 P6:GGAGTAACACCACCATGCAAATGAACAACAGTCTTAACTTCTGGTTCTTCATGTTGAGAATCAGAA TGATGA 0030 P7:GCATGGTGGTGTTACTCCAGATGATTCTGATGGTTACCCAGAAGCTTGGTTTTCTAAGGATTTTGA ACAAACT 0031 P8:CACCTCTTTGTTGGTTTGGGT。

14、AATGGTAAACTTCTCTCTTAAAGTATGGACCAGTTTGTTCAAAAT CCT 0032 P9:ACCAACAAAGAGGTGCTATTTTGTGGTACCATGATCATGCTATGGCTTTGACTAGATTGAACGTTT ACGCTG 0033 P10:GCAACTTCAATCTCTTTTCCTTTGGATCATGAATAATGTAAGCACCAACCAAACCAGCGTAAACG TTCAAT 0034 P11:AGAGATTGAAGTTGCCATCTGATGAATACGATGTTCCATTGTTGATTACTGATAGAACTATTAAC GAAGAT 0035。

15、 P12:GGGTTTGGCAAAGATGGAGATGGGTTTTCTGGAGCAGATGGGTAAAACAAAGAACCATCTTCGTT AATAGTT 0036 P13:TCCATCTTTGCCAAACCCATCTATTGTTCCAGCTTTTTGTGGTGAAACTATTTTGGTTAACGGTA AGGTTTGG 0037 P14:AGAAGCGTTAATAACTCTAAATCTGTACTTTCTTGGTTCAACTTCCAAGTATGGCCAAACCTTAC CGTTAA 0038 P15:AGAGTTATTAACGCTTCTAACACTAGAACTTACAACTTGTCTTTGG。

16、ATAACGGTGGTGATTTTAT TCAAATTGG 0039 P16:AGCCAAAGAAAAAGAGTTCAACTTAACAGACCTTGGCAACAAACCACCATCAGAACCAATTTGAA TAAAATCACC 0040 P17:TGAACTCTTTTTCTTTGGCTCCAGCTGAAAGATACGATATTATTATTGATTTTACTGCTTACGAA GGTGAATCTAT 0041 P18:AGCATCAGTTTCTGGGTTAACATCACCACCACAACCAGCAGAGTTAGCCAAAATAATAGATTCAC CTTCGTAAGC 0042 P19:TT。

17、AACCCAGAAACTGATGCTAACATTATGCAATTTAGAGTTACTAAGCCATTGGCTCAAAAGGAT GAATCTAGAA 0043 P20:ATGTTTTGGATTCTTTCATGTTGAACAGATGGGTAAGAAGCCAAGTACTTTGGCTTTCTAGATTC ATCCTTTTGAG 0044 P21:ACATGAAAGAATCCAAAACATTAGAACTTTGAAGTTGGCTGGTACTCAAGATGAATACGGTAGAC CAGTTTTGTTGT 0045 P22:GTAGTACCAACCTTTGGAGTTTCAGTAACTGGATCATGCCA。

18、TCTCTTGTTGTTCAACAACAAAAC TGGTCTACCGTAT 0046 P23:AAACTCCAAAGGTTGGTACTACTGAAATTTGGTCTATTATTAACCCAACTAGAGGTACTCATCCA ATTCATTTGCATT 0047 P24:TTCTTGGTATCTAGCAATATCAAATGGTCTTCTATCCAAAACTCTAAAAGAAACCAAATGCAAAT GAATTGGATGAGTA 说 明 书 CN 103305536 B 5 4/5 页 6 0048 P25:TTGATATTGCTAGATACCAAGAATCTGGTGAATTGTCTTACA。

19、CTGGTCCAGCTGTTCCACCACCA CCATCTGAAAAG 0049 P26:TAGCAGCAATTCTCAAAACTTCACCAGCATGAGCTTGAATAGTATCCTTCCAACCCTTTTCAGAT GGTGGTGGTGG 0050 P27:GAAGTTTTGAGAATTGCTGCTACTTTTGGTCCATACTCTGGTAGATACGTTTGGCATTGTCATAT TTTGGAACATGAAGATTACGATAT 0051 P28:ACTGCGGCCGCTTACTTATGTGGATCAGTAATATCCATTGGTCTCATCATATCGTAATCTTCATG T。

20、TCCAAAATATG 0052 PCR 反应条件 ： 0053 第一轮 ： 以所有引物为模板。 95 2min ； 95 30s， 54 20s， 72 30 s， 20个循 环 ； 72 5min。 0054 第二轮 ： 以第一轮产物为模板， 以 P1 和 P28 为引物。95 3min ； 95 1min， 58 30s， 72 1 min， 30 个循环 ； 72 5min。PCR 结束后， 通过 0.8% 琼脂糖电泳检测大小。 0055 实施例 2 0056 漆酶基因在酵母细胞中的表达 0057 1、 表达载体的构建 0058 密码子优化后的PCR产物用 EcoR/Not双酶切， 回。

21、收片段， 以正确的阅读框插 入到同样双酶切的毕赤酵母组成型表达载体 pGAPZaA（美国 invitrogen 公司） 连接， 转化 E.coli DH5， 获得重组质粒 pGAPZaA-Tcot。该重组质粒经 EcoR /Not 双酶切验证。 0059 2、 电转化感受态的制备 0060 在含 5 ml YPD 的 50 ml 离心管中， 培养酵母细胞， 30 度过夜 ； 取 3050 ul 过 夜培养物， 接种含 50 ml 新鲜培养基的 250 ml 摇瓶， 过夜生长至 OD6001.31.5 ； 在4 度， 1500 g离心 5 min收集细胞,用 50 ml预冷的灭菌水悬浮细胞 ； 。

22、如上离心， 用25 ml预 冷的灭菌水悬浮细胞 ； 如上离心， 用 2 ml 预冷的 1M 山梨醇悬浮细胞 ； 如上离心， 用 100 ul 预冷的 1M 山梨醇悬浮细胞。 0061 3、 电转化 0062 将 pGAPZaA-Tcot 用 Bgl II 酶切线性化， 将 510ug 线性化 DNA 与 80 uL 电转化 细胞混匀， 转移到 0.1 cm 电转化杯， 冰浴 5 min。电转化参数 ： 0.75kV， 25uF， 200。电击 后立即加入 1mL 预冷的 1M 山梨醇。复苏 1h 后取 150ul 涂布含有 Zeocin 抗性的 YPD 平板 上培养。在 30 度孵育平板至克隆。

23、产生。 0063 4、 产漆酶转化子的筛选 0064 将转化子平板上的单菌落分别培养保存， 进行阳性克隆子和高效产漆酶转化子的 筛选。 0065 初筛培养基 0066 Bavendamm 氏反应培养基 : 在 PDA 固体培养基中加入鞣酸使其终浓度为 0. 4 mmo l/ L; 0067 氧化带测定培养基 : 在 PDA 固体培养基中加入愈创木酚使其终浓度为 0. 04%。 0068 复筛培养基 0069 马铃薯 200 g , 葡萄糖 20 g , 磷酸二氢钾 3 g , 七水硫酸镁 1. 5 g, 酵母浸 说 明 书 CN 103305536 B 6 5/5 页 7 膏 1 g , 蒸馏。

24、水 1 000 mL, 煮沸过滤 , 冷却后分装至 250 mL 三角瓶 , 每瓶装入 50 mL 培养基。 0070 产酶基础培养基 0071 葡萄糖 30 g , 硝酸钠 2 g, 七水硫酸镁 0. 5 g , 三水磷酸氢二钾 1 g , 七水 硫酸亚铁 0. 01 g , 氯化钾 0. 5 g , 蒸馏水 1 000 mL, 自然 pH。 0072 高产菌株的初筛。Bavendamm 氏反应培养基常规灭菌倒平板 , 取培养好的直径 12 mm、 7 d 菌龄待测菌塞2 片接种于初筛平板, 28 生化培养箱培养, 挑选菌丝生长良 好, 使鞣酸、 愈创木酚二者变色能力强、 变色速度快的平板,。

25、 并接种于PDA 斜面, 一并于 4 保存。 0073 高产菌株的复筛。在无菌条件下 , 用打孔器于初筛所得菌的平板上打孔 , 制成 直径 12 mm 菌塞 , 接入装有 50 mL 产酶培养基的 250 mL 三角瓶 , 每瓶接种 2 片， 3 个 平行， 28 、 120 r/ min 振荡培养， 每天取样测定漆酶活性， 持续 10 d， 选择漆酶活力高的 菌株。 0074 漆酶酶活力用愈创木酚法测定， 一个酶活单位定义为在 25条件下每分钟使 1mol 的底物转化所需的酶量。 0075 实施例 3 0076 漆酶的特性研究 0077 1、 pH 值对漆酶活性的影响 0078 将漆酶加入不。

26、同 pH 值的缓冲液体系中测定酶活力， pH 设置从 2.0 到 10.0， 每隔 0.5 取点测定。酶活性测定反应在 25进行， 反应时间为 15 min。结果如图 1 所示， 漆酶的 最适 pH 值为 4.55.5， 在 pH4.0 到 pH6.5 范围内， 漆酶酶活能保持在 50% 以上。 0079 2、 温度对漆酶活性的影响 0080 漆酶的最适反应温度测定在最适pH值下进行， 反应时间为15 min， 温度设置从15 到 75， 每隔 5取点测定。结果如图 2 示， 漆酶的最适温度为 2535， 2045 时的 酶活能保持 60% 以上。 0081 实施例 4 0082 漆酶基因工程。

27、菌在造纸废水处理中的应用 0083 由于基因工程菌中漆酶为组成型表达， 因此可将基因工程菌进行扩大培养后， 按 0.05% 的添加量添加到某造纸废水处理厂 SBR 工艺 （序列间歇式活性污泥法） 曝气池中进行 处理。与对照组相比， 漆酶基因工程菌可将造纸废水处理效率提高 10%， 在未来的造纸废水 处理中有重要的应用意义。 0084 总之， 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 凡依本发明申请专利范围所作的均等 变化与修饰， 皆应属本发明专利的涵盖范围。 说 明 书 CN 103305536 B 7 1/2 页 8 SEQUENCE LISTING 浙江商达环保有限公司 漆酶基因及工程菌与用途 2。

28、 PatentIn version 3.4 1 513 PRT 人工序列 1 MTLEKFVDALPIPDTLKPVQQSKEKTYYEVTMEECTHQLHRDLPPTRLWGYNGLFPGPTI 60 EVKRNENVYVKWMNNLPSTHFLPIDHTIHHSDSQHEEPEVKTVVHLHGGVTPDDSDGYPE 120 AWFSKDFEQTGPYFKREVYHYPNQQRGAILWYHDHAMALTRLNVYAGLVGAYIIHDPKEK 180 RLKLPSDEYDVPLLITDRTINEDGSLFYPSAPENPSPSLPNPSIVPAFCGETILVNGKVW 240 PY。

29、LEVEPRKYRFRVINASNTRTYNLSLDNGGDFIQIGSDGGLLPRSVKLNSFSLAPAERY 300 DIIIDFTAYEGESIILANSAGCGGDVNPETDANIMQFRVTKPLAQKDESRKPKYLASYPS 360 VQHERIQNIRTLKLAGTQDEYGRPVLLLNNKRWHDPVTETPKVGTTEIWSIINPTRGTHP 420 IHLHLVSFRVLDRRPFDIARYQESGELSYTGPAVPPPPSEKGWKDTIQAHAGEVLRIAAT 480 FGPYSGRYVWHCHILEHEDYDMMRPMDITDPHK 513 2 15。

30、42 DNA 人工序列 2 atgactttgg aaaagtttgt tgatgctttg ccaattccag atactttgaa gccagttcaa 60 caatctaagg aaaagactta ctacgaagtt actatggaag aatgtactca tcaattgcat 120 agagatttgc caccaactag attgtggggt tacaacggtt tgtttccagg tccaactatt 180 gaagttaaga gaaacgaaaa cgtttacgtt aagtggatga acaacttgcc atctactcat 240 tttttgc。

31、caa ttgatcatac tattcatcat tctgattctc aacatgaaga accagaagtt 300 aagactgttg ttcatttgca tggtggtgtt actccagatg attctgatgg ttacccagaa 360 gcttggtttt ctaaggattt tgaacaaact ggtccatact ttaagagaga agtttaccat 420 tacccaaacc aacaaagagg tgctattttg tggtaccatg atcatgctat ggctttgact 480 agattgaacg tttacgctgg tttgg。

32、ttggt gcttacatta ttcatgatcc aaaggaaaag 540 agattgaagt tgccatctga tgaatacgat gttccattgt tgattactga tagaactatt 600 aacgaagatg gttctttgtt ttacccatct gctccagaaa acccatctcc atctttgcca 660 aacccatcta ttgttccagc tttttgtggt gaaactattt tggttaacgg taaggtttgg 720 ccatacttgg aagttgaacc aagaaagtac agatttagag tta。

33、ttaacgc ttctaacact 780 agaacttaca acttgtcttt ggataacggt ggtgatttta ttcaaattgg ttctgatggt 840 序 列 表 CN 103305536 B 8 2/2 页 9 ggtttgttgc caaggtctgt taagttgaac tctttttctt tggctccagc tgaaagatac 900 gatattatta ttgattttac tgcttacgaa ggtgaatcta ttattttggc taactctgct 960 ggttgtggtg gtgatgttaa cccagaaact gat。

34、gctaaca ttatgcaatt tagagttact 1020 aagccattgg ctcaaaagga tgaatctaga aagccaaagt acttggcttc ttacccatct 1080 gttcaacatg aaagaatcca aaacattaga actttgaagt tggctggtac tcaagatgaa 1140 tacggtagac cagttttgtt gttgaacaac aagagatggc atgatccagt tactgaaact 1200 ccaaaggttg gtactactga aatttggtct attattaacc caactaga。

35、gg tactcatcca 1260 attcatttgc atttggtttc ttttagagtt ttggatagaa gaccatttga tattgctaga 1320 taccaagaat ctggtgaatt gtcttacact ggtccagctg ttccaccacc accatctgaa 1380 aagggttgga aggatactat tcaagctcat gctggtgaag ttttgagaat tgctgctact 1440 tttggtccat actctggtag atacgtttgg cattgtcata ttttggaaca tgaagattac 1500 gatatgatga gaccaatgga tattactgat ccacataagt aa 542 序 列 表 CN 103305536 B 9 1/1 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103305536 B 10 。