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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310342863.2 (22)申请日 2013.08.07 C07K 16/18(2006.01) C07K 16/06(2006.01) (73)专利权人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路 866 号 专利权人 中国丝绸博物馆 (72)发明人 郑秦 沈运旺 吴小锋 郑海玲 周旸 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 陈昱彤 CN 102580232 A,2012.07.18, 全文 . CN 101066477 A,2007.11.07, 全文 . 刘春等 . 家蚕丝素轻。
2、链蛋白多克隆抗体的制 备及应用. 蚕学通讯 .2009,第29卷(第1期), 第 9-14 页 . (54) 发明名称 利用特征十二多肽制备家蚕丝素蛋白特异抗 体的方法 (57) 摘要 本发明公开一种利用特征十二多肽制备 家蚕丝素蛋白特异抗体的方法 ： 合成序列为 “CGYGAGAGAGYGA” 的多肽， 将多肽和匙孔血蓝蛋白 偶联起来得到完全抗原 ； 用生理盐水稀释完全抗 原， 将稀释后的完全抗原与完全弗氏佐剂混合， 然 后乳化处理得到初次免疫抗原乳化液 ； 使用初次 免疫抗原乳化液对兔子进行初次免疫， 然后对兔 子进行加强免疫， 加强免疫使用的是加强免疫抗 原乳化液 ； 加强免疫抗原乳化液。
3、是由稀释后的完 全抗原与不完全弗氏佐剂混合， 然后乳化处理得 到 ； 当兔子的抗血清效价达到 1/10000 时， 收集免 疫后的兔子的血液， 并使血块充分收缩及抗血清 完全析出， 收集抗血清并离心处理得到上清液。 本 发明方法制备的抗体具有很强的特异性， 能用于 纺织品等成分中的丝素蛋白的检测分析。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 蔡苗 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 序列表18页 (10)授权公告号 CN 103509108 B (45)授权公告日 2015.02.25 CN 103509108 B 1/1 页 2 1.。
4、 利用特征十二多肽制备家蚕丝素蛋白特异抗体的方法， 包括以下步骤 ： 步骤一 ： 合成序列为 “CGYGAGAGAGYGA” 的多肽， 将该多肽和匙孔血蓝蛋白偶联起来得 到完全抗原 ； 步骤二 ： 用生理盐水稀释所述完全抗原， 将稀释后的完全抗原与完全弗氏佐剂混合， 然后进行乳化处理得到初次免疫抗原乳化液 ； 使用初次免疫抗原乳化液对兔子进行初次免 疫， 然后对兔子进行加强免疫， 加强免疫使用的是加强免疫抗原乳化液 ； 所述加强免疫抗原 乳化液是由所述稀释后的完全抗原与不完全弗氏佐剂混合， 然后进行乳化处理得到 ； 当兔 子的抗血清效价达到 1/10000 时， 收集免疫后的兔子的血液， 并使。
5、血块充分收缩及抗血清 完全析出， 收集抗血清并离心处理得到上清液。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征是 ： 在所述步骤二中， 在配制初次免疫抗原乳化 液时， 稀释后的完全抗原与完全弗氏佐剂是按体积比 1:1 进行混合 ； 在配制加强免疫抗原 乳化液时， 稀释后的完全抗原与不完全弗氏佐剂是按体积比 1:1 进行混合。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征是 ： 在所述步骤二中， 对兔子进行初次免 疫的方法是 ： 使用初次免疫抗原乳化液对兔子的后大腿和皮下进行多点注射， 每只注射 100ul ； 对兔子进行加强免疫的方法是 ： 在初次免疫后的第 2、 4、 6 周分别进。
6、行一次加强免疫， 每次加强免疫是使用加强免疫抗原乳化液对兔子的后大腿和皮下进行多点注射， 每只注射 100ul。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征是 ： 在所述步骤二中， 使血块充分收缩及抗 血清完全析出的方法是 ： 将所收集的血液置室温下让其凝固， 然后将凝固血液置于 37温 箱内放置 30 min， 再置于 4冰箱过夜。 5. 根据权利要求 3 所述的方法， 其特征是 ： 在所述步骤二中， 使血块充分收缩及抗血清 完全析出的方法是 ： 将所收集的血液置室温下让其凝固， 然后将凝固血液置于 37温箱内 放置 30 min， 再置于 4冰箱过夜。 权 利 要 求 书 CN 。
7、103509108 B 2 1/3 页 3 利用特征十二多肽制备家蚕丝素蛋白特异抗体的方法 技术领域 0001 本发明涉及多克隆抗体制备技术， 尤其涉及一种制备家蚕丝蛋白特异抗体的技 术。 背景技术 0002 家蚕是我国重要的经济昆虫， 以产生蚕丝为目的。蚕丝主要由丝素和丝胶两种蛋 白质组成， 但丝胶蛋白在缫丝过程中脱落， 因此， 丝织品、 丝绸产品等中主要的成分是丝素 蛋白。 一方面， 目前在纺织品市场， 假冒丝绸产品较多， 侵犯了消费者权益， 严重影响了我国 丝绸长期以来的良好声誉， 因此， 有必要建立科学严谨的检测分析方法。另一方面， 在丝绸 起源研究领域， 也迫切需要更科学的分析方法，。
8、 因为古代埋入墓葬或遗址中的丝织品随着 时间的推移， 易受多种因素影响而遭到降解， 外界的光照、 酸、 碱、 微生物等环境因素， 都会 造成蚕丝蛋白质发生变性和大分子链的断裂， 使之降解成肽段或氨基酸， 因此利用传统由 天然蛋白质大分子制备的抗体很难来检测这样已经遭到破坏的抗原蛋白， 这样就很难来探 寻丝绸的起源， 且年代越早的证据越难寻觅。 因此如何采用自然科学的先进手段， 建立丝织 品微痕检测技术体系， 从印痕、 残留物、 土壤中提取古代丝绸的信息， 对丝绸起源研究非常 迫切。目前蛋白质检测的先进技术是基于抗体 - 抗原的 Western Blotting 或 ELISA 方法， 但制备抗。
9、体常采用天然蛋白质大分子， 因此， 无法满足上述研究。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种利用特征十二多肽制备家蚕丝蛋白特异抗体的方法。 0004 为了达到上述目的， 本发明采用的技术方案是 ： 本发明利用特征十二多肽制备家 蚕丝蛋白特异抗体的方法包括以下步骤 ： 0005 步骤一 ： 利用多肽合成仪合成序列为 “CGYGAGAGAGYGA” 的多肽， 将该多肽和匙 孔血蓝蛋白 （KLH） 偶联起来得到完全抗原 ； 0006 步骤二 ： 用生理盐水稀释所述完全抗原， 将稀释后的完全抗原与完全弗氏佐剂混 合， 然后进行乳化处理得到初次免疫抗原乳化液 ； 使用初次免疫抗原乳化液对兔子进行。
10、初 次免疫， 然后对兔子进行加强免疫， 加强免疫使用的是加强免疫抗原乳化液 ； 所述加强免疫 抗原乳化液是由所述稀释后的完全抗原与不完全弗氏佐剂混合， 然后进行乳化处理得到 ； 当兔子的抗血清效价达到 1/10000 后， 收集免疫后的兔子的血液， 并使血块充分收缩及抗 血清完全析出， 收集抗血清并离心处理得到上清液。 0007 进一步地， 本发明在所述步骤二中， 在配制初次免疫抗原乳化液时， 稀释后的完全 抗原与完全弗氏佐剂是按体积比 1:1 进行混合 ； 在配制加强免疫抗原乳化液时， 稀释后的 完全抗原与不完全弗氏佐剂是按体积比 1:1 进行混合。 0008 进一步地， 本发明在所述步骤二。
11、中， 对兔子进行所述初次免疫的方法是 ： 使用初次 免疫抗原乳化液对兔子的后大腿和皮下进行多点注射， 每只注射 100ul ； 0009 对兔子进行所述加强免疫的方法是 ： 在初次免疫后的第 2、 4、 6 周分别进行一次加 说 明 书 CN 103509108 B 3 2/3 页 4 强免疫， 每次加强免疫是使用加强免疫抗原乳化液对兔子的后大腿和皮下进行多点注射， 每只注射 100ul。 0010 进一步地， 本发明在所述步骤二中， 使血块充分收缩及抗血清完全析出的方法是 ： 将所收集的血液置室温下让其凝固， 然后将凝固血液置于 37温箱内放置 30 min， 再置于 4冰箱过夜。 0011。
12、 与现有技术相比， 本发明具有的有益效果是 ： 0012 （1） 本发明方法实施的结果表明， 通过家蚕丝素蛋白特征十二多肽制备的多克隆 抗体具有很强的特异性， 经 ELISA 分析， 该抗体与家蚕丝素蛋白具有明显的免疫反应， 灵敏 度很高， 能够用于检测家蚕丝素蛋白， 特别适合用于不完整丝素蛋白的检测分析。 0013 （2） 与传统方法利用天然蛋白质的大分子制备的抗体不同， 本发明制备的抗体不 仅能够检测完整的丝素蛋白， 也能用于检测诸如古代丝织品中已经断裂的丝素蛋白分子， 在考古、 文物鉴定和其他科学研究中具有重要作用。 具体实施方式 0014 在 PubMeD（http:/www.ncbi。
13、.nlm.nih.gov/pubmed/） 上 下 载 家 蚕 （Bombyx mori ） 丝素蛋白的重链 (H-chain) 氨基酸序列 （如 SEQ No.1 所示） 。通过统计分析， 确定 “GYGAGAGAGYGA” 多肽片段出现频率很高， 合计 47 处， 是家蚕丝素的特征多肽， 故合成此片 段作为抗原来制备抗体。 0015 以下具体说明本发明的制备方法。 0016 完全抗原的合成 0017 利用多肽合成仪合成半抗原 （半胱氨酸使该多肽与 KLH 偶联。通过交联剂的作用， “CGYGAGAGAGYGA” 多肽的 N 端的半胱氨酸上的巯基和 KLH 伯胺形成共价键， 从而将多肽和 K。
14、LH 偶联起来， 得到完全抗原。 0018 用适量的生理盐水稀释完全抗原， 然后将稀释后的完全抗原与完全弗氏佐剂按体 积比 1:1 混合， 加入链霉素、 青霉素溶液进行乳化处理， 得到初次免疫时所使用的抗原乳化 液 （即初次免疫抗原乳化液） 。此外， 将以上稀释后的完全抗原与不完全弗氏佐剂按体积比 1:1 混合， 然后加入链霉素、 青霉素溶液进行乳化处理， 则得到加强免疫时所使用的抗原乳 化液 （即加强免疫抗原乳化液） 。 0019 抗体制备 ： 0020 选取 2 只大白兔 （14-16 周龄） 进行初次免疫和加强免疫。免疫前先抽取兔耳血样 做对照。初次免疫是用初次免疫抗原乳化液对兔子的后大。
15、腿和皮下进行多点注射， 每只注 射100 ul。 在初次免疫后的第2周、 4周、 6周各进行加强免疫一次， 每次加强免疫使用加强 免疫抗原乳化液对兔子的后大腿和皮下进行多点注射， 每只注射100 ul。 分别在第三次、 四 次免疫后的第 10 天静脉取血检测抗血清效价。 0021 当兔子血样中的抗血清的效价达到 1/10000 后， 杀死兔子收集血液置室温下让其 凝固 ； 将凝固血液置于 37温箱内放置 30 min， 再置于 4冰箱过夜， 使血块充分收缩及抗 血清完全析出 ； 收集抗血清， 4 3000 g 离心 10 min， 分装上清液， 放 -70储存备用。 0022 抗体纯化 ： 0。
16、023 利用免疫亲和层析技术对抗血清进行纯化。先将合成的半抗原 （即多肽 说 明 书 CN 103509108 B 4 3/3 页 5 “CGYGAGAGAGYGA” ） 和层析填料Sulfo-link-gel进行交联， 用半胱氨酸封闭。 用20ml、 50mM、 pH7.4 的 PBS 对柱进行预处理， 预处理的流速为 60ml/h。用 50mM、 pH7.4 的 PBS 将 10ml 的 抗血清稀释至 20ml， 稀释后上样。重复上样一次。用 20ml、 50mM、 pH7.4 的 PBS 对柱进行清 洗， 清洗的流速为 60ml/h。用 pH3.0、 0.1M 的 glycine-HCL。
17、 对抗体进行洗脱。洗脱完成后 用含 50mM、 pH7.4， 含 0.02% 硫柳汞钠的 PBS 洗涤多肽柱， 4储存。 0024 抗体特异性效果测定 ： 抗原丝素蛋白以1ug/ml的浓度包被， 4包被过夜。 将抗体 分别稀释 20000 倍、 10000 倍、 5000 倍、 1000 倍、 200 倍， 50ul/ 孔的量上样， 37下温育 1h。 用 TBST 以 200ul/ 孔洗涤 2 遍。酶标二抗以 1:5000 稀释使用， 50ul/ 孔、 37下温育 1h。 用 TBST 以 200ul/ 孔洗涤 3 遍。以 100 ul/ 孔加入 TMB 显色液显色。显色反应 10min 后。
18、， 用 2M 的 H2SO4以 100ul/ 孔的量终止反应。用酶标仪测定 OD450值。根据 OD450值， 对抗原抗 体的结合等情况进行判断。当 OD450值达到阳性标准时就可以确定样品中含有丝素 ； 若样品 中不含丝素， 则 OD450值就会低于阳性标准， 据此就可以快速判断丝的存在。 0025 结果分析 ： 结果显示除空白对照呈无色外， 样品孔均呈现黄色。 用酶标仪测定OD450 值结果为 ： 对纯化后的抗体进行 20000 倍、 10000 倍、 5000 倍、 1000 倍、 200 倍稀释后得到的 OD450值分别为 0.847、 1.050、 1.606、 2.303、 2.3。
19、78。按照平台 OD450值达到 0.6 为阳性的要 求， 即使将制备的抗体稀释 20000 倍， 仍能够检测到丝素蛋白的阳性信号， 显色清晰， 结果 明确。 从以上结果可以说明， 由本发明方法制备的抗体对丝素的反应灵敏度极高， 所需的抗 原量极少， 且操作简便， 投入小， 宜大规模推广利用。 说 明 书 CN 103509108 B 5 1/18 页 6 0001 0002 序 列 表 CN 103509108 B 6 2/18 页 7 0003 序 列 表 CN 103509108 B 7 3/18 页 8 0004 序 列 表 CN 103509108 B 8 4/18 页 9 0005。
20、 序 列 表 CN 103509108 B 9 5/18 页 10 0006 序 列 表 CN 103509108 B 10 6/18 页 11 0007 序 列 表 CN 103509108 B 11 7/18 页 12 0008 序 列 表 CN 103509108 B 12 8/18 页 13 0009 序 列 表 CN 103509108 B 13 9/18 页 14 0010 序 列 表 CN 103509108 B 14 10/18 页 15 0011 序 列 表 CN 103509108 B 15 11/18 页 16 0012 序 列 表 CN 103509108 B 16 12/18 页 17 0013 序 列 表 CN 103509108 B 17 13/18 页 18 0014 序 列 表 CN 103509108 B 18 14/18 页 19 0015 序 列 表 CN 103509108 B 19 15/18 页 20 0016 序 列 表 CN 103509108 B 20 16/18 页 21 0017 序 列 表 CN 103509108 B 21 17/18 页 22 0018 序 列 表 CN 103509108 B 22 18/18 页 23 序 列 表 CN 103509108 B 23 。