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1、(10)授权公告号 CN 101988055 B (45)授权公告日 2013.04.10 CN 101988055 B *CN101988055B* (21)申请号 201010166122.X (22)申请日 2007.07.13 200710015295.X 2007.07.13 C12N 15/10(2006.01) C07H 21/04(2006.01) C07H 1/08(2006.01) (73)专利权人 中国科学院海洋研究所 地址 266071 山东省青岛市南海路 7 号 (72)发明人 崔朝霞 张姝 栾维莎 刘媛 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 2100。
2、2 代理人 许宗富 周秀梅 CN 1401782 A,2003.03.12, 全文 . (54) 发明名称 一种海蜇基因组 DNA 的提取方法 (57) 摘要 本发明涉及基因工程技术， 具体的说是一种 海蜇基因组 DNA 的提取方法。具体为将海蜇用 手术剪刀剪碎至无明显颗粒状组织， 加入 CTAB buffer、 蛋白酶 K， 在 55 56消化 24 26 小 时至溶液澄清 ； 或将海蜇置入 95的酒精中脱水 并加入 buffer、 SDS、 蛋白酶 K， 封口后 55 56 消化 0.8 1.0 小时 ； 而后混合苯酚、 氯仿和异戊 醇， 离心， 吸上清， 再加入氯仿和异戊醇混合液混 匀，。
3、 离心， 吸上清 ； 再在上清液中加异丙醇， 沉淀 10 15 分钟， 沉淀后取出， 离心， 弃去液体， 并用 乙醇， 离心洗涤， 将多余液体倒去室温自然凉干， 即得到海蜇基因组 DNA。采用本发明可提取高质 量的海蜇全基因组 DNA， 且方法简单、 经济、 易于 操作， 适合在普通生物实验室中进行。 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张颖慧 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种海蜇基因组 DNA 提取方法， 。
4、其特征在于 ： 1) 将海蜇有性世代的海蜇碟状体置入体积浓度为 95的酒精中脱水并保存 ； 2) 将保存的蝶状体样品放入离心管中并直接加入 buffer300 400l 匀浆、 加入 30 40l 质量浓度为 10的 SDS、 3 5l 浓度为 20mg/ml 的蛋白酶 K， 封口后 55 56消化 0.8 1.0 小时， 待用 ； 所述 buffer 溶液含有 0.01M Tris-Hcl 和 0.1M EDTA ； 3)将步骤2)中消化后的溶液取出加入6M NaCl， 振荡浑匀2030S， 1000012000rpm 离心 20-30 分钟， 吸上清， 而后加入上清液的 0.7 1 倍体积。
5、的异丙醇， -20 -18沉淀 1015分钟， 沉淀后取出， 以1000012000rpm离心15-20分钟， 弃去液体， 并用体积浓度 为 70的乙醇， 离心洗 1 2 次， 自然室温凉干， 即得到海蜇碟状体的 DNA。 2. 按权利要求 1 所述的海蜇基因组 DNA 提取方法， 其特征在于 ： 所述海蜇为新鲜或酒 精保存的样品。 权 利 要 求 书 CN 101988055 B 2 1/3 页 3 一种海蜇基因组 DNA 的提取方法 技术领域 0001 本发明涉及基因工程技术， 具体的说是一种海蜇基因组 DNA 的提取方法。 背景技术 0002 海蜇因其含水量高、 易分解和自溶等生物学特点。
6、， 限制了对它的基因组 DNA 的提 取。海蜇的生活史包括有性世代和无性世代。螅状体营固着生活、 属于海蜇无性世代， 碟状 体营浮游生活、 属于海蜇有性世代， 两者在外部形态以及生物学功能方面都有很大不同， 从 而导致两个阶段基因组 DNA 的提取方法不同。目前， 国内外对海蜇的研究并没有将不同的 生活世代分开研究基因组 DNA 的提取。报道的海蜇基因组 DNA 提取方法多为 Kit 法和 CTAB 法。 Kit法成本高而且产率低， 如要进行大规模的群体分析就不实际 ； CTAB法样品用液氮研 磨、 酚仿抽提， 方法烦琐且毒性大， 同时其并不适于海蜇碟状体基因组的提取， 不能保证后 期实验的进。
7、行。同时现有技术多采用试剂盒提取或酚 - 氯仿抽提法进行海洋动物基因组的 提取， 这两种方法用于海蜇基因组 DNA 的提取均无法保质、 保量满足实验的需要， 不能达到 满意效果。 0003 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种经济可行并且操作简便的海蜇基因组 DNA 的提取方 法。 0005 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案为 ： 0006 基因组 DNA 提取方法 ： 0007 1)将海蜇无性世代的海蜇螅状体用手术剪刀剪碎至无明显颗粒状组织， 加入CTAB buffer300 400ul， 待用 ； 0008 2)将步骤1)得到的原料内加入35ul浓度为20mg/ml的蛋白酶K。
8、， 在5556 消化 24 26 小时至溶液澄清， 待用 ； 0009 3) 在步骤 2) 澄清溶液中加入与其等体积的苯酚、 氯仿和异戊醇的混合溶液混匀， 离心， 吸上清， 再加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇混合液混匀， 离心， 吸上清 ； 而后向 上清液中加入上清液的 0.7 1 倍体积的异丙醇， -20 -18沉淀 10 15 分钟， 沉淀 后取出， 离心， 弃去液体， 并用体积浓度为 70的乙醇， 离心洗 1 2 次， 将多余液体倒去 室温自然凉干， 即得到海蜇螅状体的基因组 DNA ； 其中苯酚、 氯仿和异戊醇按体积份数比为 25 24 1， 氯仿和异戊醇按体积份数比为 24 1。 0。
9、010 所述步骤 1) 中 CTAB buffer 溶液含有 1.4M Nacl， 0.02M EDTA， 0.1MTris-Hcl 和 每 100ml 的 CTAB buffer 中加入 2g 质量浓度为 2的 CTAB。 0011 基因组 DNA 提取方法 ： 0012 1) 将海蜇有性世代的海蜇碟状体置入体积浓度为 95的酒精中脱水并保存 ； 0013 2) 将保存的蝶状体样品放入离心管中并直接加入 buffer300 400ul 匀浆、 30 40ul 质量浓度为 10的 SDS、 3 5ul 浓度为 20mg/ml 的蛋白酶 K， 封口后 55 56消化 0.8 1.0 小时， 待用。
10、 ； 说 明 书 CN 101988055 B 3 2/3 页 4 0014 3) 将 步 骤 2) 中 消 化 后 的 溶 液 取 出 加 入 6M NaCl， 振 荡 浑 匀 20 30S， 10000 12000rpm 离心 20-30 分钟， 吸上清， 而后加入上清液的 0.7 1 倍体积的异丙 醇， -20 -18沉淀 10 15 分钟， 沉淀后取出， 以 10000 12000rpm 离心 15-20 分钟， 弃 去液体， 并用体积浓度为70的乙醇， 离心洗12次， 自然室温凉干， 即得到海蜇碟状体的 DNA。 0015 所述步骤 1)buffer 溶液含有 0.01M Tris-。
11、Hcl 和 0.1M EDTA。 0016 所述得到海蜇 DNA 溶于灭菌纯水中 -20 -18保存 ； 所述异丙醇和体积浓度为 70的乙醇可在 4预冷 ； 所述海蜇为新鲜或酒精保存的样品。 0017 本发明所具有的优点 ： 0018 本发明海蜇基因组DNA的提取方法区别于现有技术中的Kit法和一般的酚氯仿抽 提法， 在于对材料的处理即蝶状体用无水乙醇保存， 可去除多余水分造成的对后期基因组 DNA提取的干扰。 而且蝶状体的提取采用改进的高盐法， 毒性小， 操作简单， 技术要求低。 螅 状体基因组DNA的提取我们采用改良的CTAB法， 其特征在于样品不用液氮研磨而采用手术 剪刀尽量剪碎， 长时。
12、间消化 (24 小时 )， 这样即简化了操作步骤又节约了成本。所得的高质 量的基因组 DNA 可广泛应用于群体遗传学、 分子标记辅助育种以及系统进化分析等方面。 附图说明 0019 图 1 为本发明与现有技术 CTAB 法提取的海蜇螅状体基因组电泳图谱， 其中 ： 1、 6 泳道为 MarkerDNA/HindIII ； 2、 3 泳道为本发明方法提取的海蜇螅状体基因组 DNA ； 4、 5 泳道为现有 CTAB 法提取的海蜇螅状体基因组 DNA。 0020 图2为本发明与现有技术高盐法、 现有技术CTAB法提取的海蜇蝶状体基因组电泳 图谱， 其中 1、 8 泳道为 MarkerDNA/Hin。
13、dIII ； 2、 3 泳道为本发明方法提取的海蜇蝶状体基 因组 DNA ； 4、 5 泳道为现有高盐法提取的海蜇蝶状体基因组 DNA ； 6、 7 泳道为使用本发明中 螅状体基因组 DNA 提取法所提的海蜇蝶状体基因组 DNA。 具体实施方式 0021 下面结合说明书附图对本发明进行详细说明。 0022 实施例 1 0023 将海蜇螅状体用牙签从波纹板 ( 或其附着物 ) 上挑起， 收集到 1.5ml 的离心管中。 用手术剪刀仔细的剪碎至无明显颗粒状组织加入 400ul 的 CTABbuffer， 待用。加入 5ul 蛋 白酶 K， 55消化 24 小时至溶液澄清， 待用。 0024 而后再。
14、加入与澄清溶液等体积的苯酚、 氯仿和异戊醇的混合溶液， 混 合均匀 12000rpm 离心 30min 吸上清， 再加入与所得上清等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液， 上下 颠倒混匀 12000rpm 离心 30min 吸上清。所得上清液中加入其 0.7 倍体积的异丙醇 -20沉 淀10分钟， 12000rpm离心20min弃去液体。 并用500ul体积浓度为70的乙醇， 12000rpm， 5min 洗 2 次。将多余液体倒去室温自然凉干， 即得到海蜇螅状体的 DNA ； 海蜇螅状体的 DNA 灭菌纯水中 -20保存。 0025 将得到海蜇螅状体的 DNA 溶于 40ul 灭菌纯水中， 30mi。
15、n 后可用于琼脂糖凝胶电泳 检测 ( 参见图 1)。 说 明 书 CN 101988055 B 4 3/3 页 5 0026 其中苯酚、 氯仿和异戊醇按体积份数比为 25 24 1 ； 氯仿和异戊醇按体 积 份 数 比 为 24 1 ； CTAB buffer 溶 液 含 1.4M Nacl， 0.02M EDTA， 0.1MTris-Hcl， 2 CTAB(2g/100ml) ； 所述异丙醇和体积浓度为 70的乙醇在 4预冷。 0027 实施例 2 0028 将 95酒精保存的海蜇蝶状体收集到一个 1.5ml 的离心管中。加入 400ul 匀浆 buffer、 40ul10 SDS、 2ul。
16、 蛋白酶 K， 封口后在 55消化 1 小时。消化好后取出加入 400ul 6M NaCl， 振荡浑匀 30S 后 12000rpm 离心 30min。吸上清 800ul 加入 560ul 异丙醇， -20 沉淀 10 分钟， 然后 12000rpm 离心 20min， 去上清。在用 70乙醇离心洗两遍， 离心条件为 12000rpm 离心 5min， 自然室温凉干。即得到海蜇碟状体的 DNA ； 海蜇碟状体的 DNA 灭菌纯 水中 -20保存。 0029 将得到海蜇螅状体的 DNA 溶于 40ul 灭菌纯水中， 30min 后可用于琼脂糖凝胶电泳 检测 ( 参见图 2)。 0030 其中bu。
17、ffer溶液含0.01M Tris-Hcl和0.1M EDTA ； 所述异丙醇和体积浓度为70 的乙醇在 4预冷。 0031 实施例 3 0032 与实施例 1 不同之处在于 ： 0033 将海蜇螅状体用手术剪刀剪碎至无明显颗粒状组织， 加入 CTABbuffer300ul， 待 用 ； 0034 而后加入3ul浓度为20mg/ml的蛋白酶K， 在56消化26小时至溶液澄清， 待用 ； 0035 向用氯仿和异戊醇混合离心后的上清液中加入上清液的 1 倍体积的异丙 醇， -18沉淀15分钟， 沉淀后取出， 离心， 弃去液体， 并用体积浓度为70的乙醇， 离心洗1 次， 将多余液体倒去室温自然凉干。
18、， 即得到海蜇螅状体的基因组 DNA。 0036 实施例 4 0037 与实施例 2 不同之处在于 0038 将海蜇碟状体置入体积浓度为 95的酒精中脱水并保存 ； 0039 将保存的蝶状体样品放入离心管中并直接加入 buffer300ul、 30ul 质量浓度为 10的 SDS、 5ul 浓度为 20mg/ml 的蛋白酶 K， 封口后 56消化 0.8 小时， 待用 ； 0040 消化后的溶液取出加入6M NaCl， 振荡浑匀20S， 10000rpm离心30分钟， 吸上清， 而 后加入上清液的 1 倍体积的异丙醇， -18沉淀 15 分钟， 沉淀后取出， 以 10000rpm 离心 20 分钟， 弃去液体， 并用体积浓度为 70的乙醇， 离心洗 1 次， 自然室温凉干， 即得到海蜇碟状 体的 DNA。 说 明 书 CN 101988055 B 5 1/1 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101988055 B 6 。