利用昆虫细胞高效表达人尿激酶原及其它有用蛋白质的方法属于 生物基因工程领域，本发明涉及生产人尿激酶原及其它有用蛋白质的 方法。现在心脑血管血栓并发症严重影响临床患者心肌梗塞、脑血栓 的预后从而造成高死亡率。因此，国内外近年来尝试用溶栓疗法溶解 血栓，防治心脑血管血栓并发症的临床报导越来越多。特别是进入八 九十年代后，溶栓疗法成为急性心肌梗塞的常规疗法；溶栓疗法所用 的溶栓药物为纤溶酶原激活物(plasminogen activator，简写为PA)， 单链尿激酶型PA即人尿激酶原(prourokinase，简写为pro-UK)是一种 新型溶栓剂，优于尿激酶(urokinase，简写为UK)，具有血纤维蛋白( 血栓)作用特异性。但是，pro-UK不象UK那样易于制备获得，只有基 因工程生产才能解决这一难题。
大肠杆菌、酵母等微生物系统已用于表达外原基因进行生产，并 形成了一些基因工程产品 但由于大肠杆菌的表达产物形成一种不溶 解的包涵体需通过变性剂溶解和复性以恢复天然结构，使pro-UK一类 具有多对二硫键的蛋白质表达产物的生物活性大受影响。哺乳动物细 胞的表达产物保持天然的三维结构，能将蛋白质侧链糖基化，翻译后 修饰加工与分泌，但是哺乳动物细胞培养价格昂贵，设备技术条件要 求严格而且表达效率不高。近年来人们试图用昆虫细胞作为外源基因 的表达系统，其特点是既可以单层贴壁生长又可以大量悬浮培养，培 养基中不含胎牛血清细胞仍生长良好，具有表达产物侧链糖基化、后 加工修饰与分泌功能。已经应用此系统表达的有几十种外源基因，多 为病毒外壳蛋白，例如：
1.戴维·H·L·毕晓普，康赐永：发明申请号CN 87106266A， 发明名称：重组体杆状病毒载体中乙型肝炎病毒抗原的表达，1987年 9月8日。该发明是用昆虫表达系统表达人体乙型肝炎病毒抗原及与乙 型肝炎表面抗原有关的pre-S2蛋白。类似的发明譬如表达reta病毒及 其疫苗、日本脑炎病毒、狗细小病毒疫苗、爱滋病病毒，见于欧洲专 利、日本专利等。
2.Summers，M.D etal：United Staes Pateat 5023328， Title：Lepidopteran AKH signal sequeace，Jun.11，1991。该发明 是将鳞翅目昆虫的脂肪动用激素分泌肽DNA编码序列插到转移载体质 粒多角体蛋白启动子下游，使不带分泌肽编码序列的外源基因在昆虫 表达系统表达并分泌成为可能。
3.Wang，N.P.etal：Cell Growfh & Differentiation.1990， 1：429-437，文中所述，采用昆虫表达系统表达网织细胞瘤表达产物 pp110RB蛋白质，约为10mg/liter培养基上清。类似的表达产物有集 落刺激因子，α-半孔糖甘酶A、人神经生长因子等，见于世界专利、 欧洲专利等。但是，其共性是表达产量不够高。即表达产物具备天然 性质与活性，但表达效率不够高，不利于形成基因工程产品。表达效 率高否最关键的是用于构建重组病毒、供外源基因插入的转移载体质 粒的结构，转移载体质粒中多角体蛋白启动子基因愈完整，表达效率 愈高。
本发明的目的是通过构建更好的(1)转移载体质粒，得到一种(2) 高效表达人尿激酶原蛋白质及其它有用蛋白质的基因工程方法。人尿 激酶原为一种新型溶栓剂，但从自然界很难获得，只有基因工程生产 才能解决这一难题。本发明表达效率远高于哺乳细胞培养上清的表达 量，并优于大肠杆菌生产表达产物(变性复性大大降低了回收人尿激 酶原的生物活性)，具有广泛的应用前景。
本发明的内容及方案：构建高效表达的转移载体质粒pAcYT，克 隆人尿激酶原cDNA到转移载体质粒上。将带有人尿激酶原基因(含分 泌肽编码序列)的转移载体质粒与野生型核多粒包埋型多角体病毒 DNA共转染昆虫Sf细胞。空斑法筛选纯化重组病毒。用重组病毒感染 昆虫Sf细胞收获分泌表达的人尿激酶原蛋白质。本方法适合于利用同 样方法表达其它有用蛋白质。
实施例：
1.构建高效表达的转移载体质粒pAcYT：用限制性内切酶酶切 去除质粒pAc373启动子基因的XhoI-BamHI片段(2，1Kb)，得到不含启 动子的pAc373′DNA XhoI-BamHI大片段(7.7Kb)。将3′-下游修饰过的 克隆野生型AcMNPV DNA多角体蛋白启动子基因片段(XhoI-BamHI片段， 2.1Kb)与7.7Kb的pAc373′DNA XhoI-BamHI大片段连接。再去除一段多 角体蛋白结构基因下游的DNA片段(BamHI-KpaI片段)，得到一个新的 具有添加的启动子下游DNA片段-7TATAAAT-1并缺失多角体蛋白结构基 因下游BamHI-KpnI片段的高效表达转移载体pAcYT。DNA序列测定表明： pAcYT启动子基因比pAc373多一段TATAAAT序列。即本发明所构建的高 效表达转移载体pAcYT启动子部分结构比pAc373更完整，使外源基因 在完整多角体蛋白启动子控制下被表达。
2.克隆人尿激酶原cDNA到转移载体pAcYT上：经二次分别分段 重组人尿激酶原cDNA到质粒Blae-script和pUC19上以得到BamHI、KpnI 末端，然后平头正向插入到转移载体质粒pAcYT的BamHI位点上(见图 1)将pAcYT/UK质粒扩增后，用氯化铯密度梯度离心或PBG8000沉 淀等常规DNA纯化方法进行纯化。
3.病毒和细胞及病毒DNA制备：昆虫细胞株Sf9细胞在TMN-FH或 IPL41培养基中培养：昆虫细胞株Sf21细胞在TC-100培养基中培养；用 核多粒包埋型多角体病毒感染Sf细胞以增殖病毒。高速离心(4℃， 30000转/分)沉淀培养基上清中的病毒粒子，低浓度Na2CO3裂解多角 体，蛋白酶K水解病毒蛋白质，酚氯仿抽提一次，乙醇沉淀病毒DNA。
4.昆虫细胞内同源重组病毒的筛选：将带有人尿激酶原cDNA( 含分泌肽编码序列)的pAcYT/UK DNA 1-5微克与野生型AcMNPV DNA 2-10微克悬浮于30微升蒸馏水中，与30-50微克脂质体混合后共转 染单层贴壁Sf细胞，25℃-28℃温育2-4小时。吸弃转染液，换新鲜 培养基，25℃-28℃培养4-7天，直至病毒多角体形成。根据重组病 毒无多角体(Occ-)这一形态学特征，用空斑法筛选纯化，重复三次。 获得重组病毒。
5.带有人尿激酶原基因的重组病毒感染Sf9细胞：每毫升Sf9细 胞用103PFU(空斑形成单位)的重组病毒感染，4-7天后收集培养基上 清(含有表达产物人尿激酶原)，并以野生病毒为对照。
6.纯化与回收表达产物人尿激酶原蛋白质：将溴化氰活化的 Sepharose 4B凝胶与抗人尿激酶单克隆抗体(4D1E8)偶联后装柱，柱 床体积2.5毫升，每次上样体积30-60毫升。用2mol/LKSCN洗脱，收 集人尿激酶原洗脱峰流出液，在Aprotinin(Sigma)存在下透折，低温 真空干燥。BLISA法确定人尿激酶原浓度，标准品人尿激酶原为GmbH产 品，浓度经氨基酸成分分析准确定量。纤维蛋白原平板法测定人尿激 酶原纤溶生物活性。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Weatera blot鉴定纯 化的人尿激酶原表达产物。重组病毒感染Sf细胞5-7天后，上清液中 人尿激酶原为96mg/liter(TMN-FH培养基)，60mg/liter(Sf900无血 清培养基)，16mg/liter(IPL11培养基)，依培养基不同而表达量亦 不同，溶纤活性为800000IU～1600000IU/liter。单克隆抗体亲和 层析一步法纯化表达产物，回收率达70％以上，比活约为60000IU/mg； 纯化的人尿激酶原蛋白质，无论非还原还是还原处理，其SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳图谱均为相同的单用条带，分子量约为50000；其West- era blot结果为单一条带，与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱吻合。
附图说明：
图1转移载体质粒pAcYT多角体蛋白启动子基因3′-端DNA序列
测定图谱