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1、(10)申请公布号 CN 102703344 A (43)申请公布日 2012.10.03 CN 102703344 A *CN102703344A* (21)申请号 201210144682.4 (22)申请日 2012.05.10 CGMCC No.5706 2012.01.09 C12N 1/20(2006.01) C12P 19/00(2006.01) C12R 1/465(2006.01) (71)申请人 上海交通大学 地址 200240 上海市闵行区东川路 800 号 (72)发明人 支月娥 周培 冯海玮 毛亮 (74)专利代理机构 上海汉声知识产权代理有限 公司 31236 代理。
2、人 胡晶 (54) 发明名称 一株秸秆降解放线菌及其应用 (57) 摘要 本发明涉及秸秆降解技术领域， 特别涉及 一株秸秆降解放线菌及其应用。本发明的秸秆 降解放线菌， 属于灰略红链霉菌 (Streptomyces griseorubens)， 保藏编号为CGMCC No.5706。 与现 有技术相比， 本发明有以下优点 ： 1、 本发明的灰 略红链霉菌具有较强的纤维素酶、 半纤维素酶、 果 胶酶和木质素酶产生能力， 不会对自然界的碳循 环产生负面影响， 不会对环境造成危害 ； 2、 本发 明的灰略红链霉菌具有较强的秸秆降解能力， 在 秸秆降解培养基中30天可使秸秆失重率达76， 且培养成本低。
3、， 操作方便， 易于产业化实施 ； 3、 本 发明的灰略红链霉菌对土壤中的植物病害微生物 有一定拮抗作用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页 1/1 页 2 1.一株秸秆降解放线菌， 属于灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)， 保藏编号 为 CGMCC No.5706。 2. 如权利要求 1 所述的秸秆降解放线菌在秸秆降解方面的应用。 权 利 要 求 书 CN 102703344 A 2 1/3。
4、 页 3 一株秸秆降解放线菌及其应用 技术领域 0001 本发明涉及秸秆降解技术领域， 特别涉及一株秸秆降解放线菌及其应用。 背景技术 0002 我国是农业大国， 每年各类农作物秸秆产量在7亿吨左右。 20世纪90年代后期以 来， 随着农作物产量提高， 秸秆总量迅速增加， 广大农民为赶农时、 抢播种、 图省事， 多数地 区就开始出现秸秆焚烧现象。大面积秸秆焚烧不仅造成了极大的环境污染， 而且浪费了宝 贵的生物资源。 0003 秸秆露天焚烧已受到社会的广泛关注， 其危害主要体现在以下三个方面 ： (1) 焚 烧后产生大量的烟雾、 烟尘、 一氧化碳、 二氧化碳、 二氧化硫等污染物， 使局部大气环境。
5、质量 恶化， 并诱发呼吸道、 肺部疾病 ； (2) 露天焚烧秸秆影响交通安全， 焚烧秸秆产生的大量烟 雾， 使空气可见度下降， 影响车辆行驶和飞机正常起降， 易诱发交通事故 ； (3) 露天焚烧秸 秆还威胁公共设施安全， 如在通讯线路、 高压输电线路附近焚烧秸秆， 容易损坏线路且易诱 发火灾事故。 0004 秸秆主要组分是纤维素、 木质素、 果胶、 半纤维素、 粗蛋白和灰分等， 在常温下性质 十分稳定， 因此降解非常缓慢。环境中的微生物具有增殖速度快、 功能丰富多样、 适应性强 等特点， 应用微生物学方法腐解处理秸秆具有许多其他物理化学方法不可替代的优点， 应 用前景广阔， 因此， 从自然界筛。
6、选到具有高效秸秆降解能力的菌株十分重要。目前， 秸秆降 解微生物的研究主要集中在细菌和真菌上， 如芽孢杆菌、 青霉、 木霉、 黑曲霉、 镰刀菌等， 但 是对放线菌的研究和应用还很少。 发明内容 0005 本发明目的在于提供一株秸秆降解放线菌及其应用。 0006 本发明目的通过以下技术方案实现 ： 0007 一株秸秆降解放线菌， 属于灰略红链霉菌 (Streptomyces griseorubens)， 保藏编 号为 CGMCC No.5706。 0008 秸秆降解放线菌在秸秆降解方面的应用。 0009 本发明的灰略红链霉菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 地址。
7、是北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学微生物研究所。保存日期为 2012 年 1 月 9 日， 保藏编号为 CGMCC No.5706。命名该放线菌为 JSD-1， 分类属名为灰略红 链霉菌 (Streptomyces griseorubens)。 0010 菌种保藏 ： 采用 4斜面冷冻保藏法， 使微生物处于较低温度中， 以降低其代谢作 用速度从而达到保藏菌种的目的。 0011 菌种活化 ： 将冷冻保藏状态的菌种接种于高氏 1 号液体培养基中， 待菌种逐渐适 应培养环境进行繁殖， 以获得数量足够、 活力旺盛的培养物。 0012 菌种培养 ： 采用高氏 1 号液体培养基， 配方为。
8、 ： 可溶性淀粉 20.0g、 KNO31.0g、 K2HPO4 说 明 书 CN 102703344 A 3 2/3 页 4 0.5g、 MgSO4 7H2O 0.5g、 NaCl 0.5g、 FeSO4 7H2O 0.01g、 蒸馏水1000ml， 调节pH至7.2-7.4。 配制时， 先用少量冷水， 将淀粉调成糊状， 倒入一定量的热水中， 在火上加热， 边搅拌边依次 溶化其他成分， 待溶化后， 补足水分到 1000ml， 调 pH， 121灭菌 20min。将待活化的菌株接 种到高氏 1 号液体培养基中， 30、 150rpm 培养 4 天。 0013 本发明用微生物处理农业秸秆废弃物，。
9、 微生物可降解秸秆中难以利用的大分子物 质。经过微生物作用， 秸秆转化为生物可利用的还原糖或同化为生物体内各组分。 0014 与现有技术相比， 本发明有以下优点 ： 0015 1、 本发明的灰略红链霉菌具有较强的纤维素酶、 半纤维素酶、 果胶酶、 木质素酶 ( 包括漆酶 Lac、 木质素过氧化物酶 Lip 和锰过氧化物酶 Mnp) 产生能力， 不会对自然界碳循 环产生负面影响， 不会对环境造成危害 ； 0016 2、 本发明的灰略红链霉菌具有较强的秸秆降解能力， 在秸秆降解培养基中 30 天 可使秸秆失重率达 76， 且培养成本低， 操作方便， 易于产业化实施 ； 0017 3、 本发明的灰略。
10、红链霉菌对土壤中的植物病害微生物有一定拮抗作用。 附图说明 0018 图 1 为本发明的灰略红链霉菌的高氏 1 号平板菌落形态图 ； 0019 图 2 为本发明的灰略红链霉菌的 CMC- 刚果红平板示意图 ； 0020 图 3 为本发明的灰略红链霉菌在光学显微镜下的菌体形态图 ； 0021 图 4 为本发明的灰略红链霉菌的秸秆降解率曲线图 ； 0022 图 5 为本发明的灰略红链霉菌对植物病原菌 ( 甜瓜菌核病 ) 的拮抗作用示意图。 具体实施方式 0023 以下举例说明本发明， 但是并不用于限定本发明。 0024 实施例 1 灰略红链霉菌 (Streptomyces griseorubens。
11、) 的分离、 纯化和保藏 0025 取上海市闵行区浦江镇交大浦江基地水稻田的腐烂秸秆和土壤为样品， 采用摇瓶 富集培养的方法， 不同样本磨碎混均后取10g， 置于100mL富集养基中， 30、 150rpm恒温培 养。之后每隔 5 天， 以 10接种量接入另一富集养基中， 如此反复驯化 4 次。富集培养基采 用以 CMC-Na 为唯一碳源的培养基。 0026 取 100L 富集液在 CMC- 刚果红培养基平板上涂布， 如图 2 所示， 置于 30恒 温恒湿培养箱中倒置培养， 待 5 天后出现透明水解圈。挑取少量菌体， 在高氏 1 号琼脂平 板上划线， 直至获得单菌落， 如图 1 所示， 再将获。
12、得的单菌落， 在以 CMC-Na 为唯一碳源的 无机盐固体培养基上连续传 6 代， 待菌落形态稳定后， 即得纯培养。即得灰略红链霉菌 (Streptomyces griseorubens) 菌株。 0027 灰略红链霉菌 (Streptomyces griseorubens) 菌株的保藏方法 ： 4斜面冷冻保 藏。 0028 实施例 2 灰略红链霉菌 (Streptomyces griseorubens) 的鉴定 0029 中国工业微生物菌种保藏中心于 2011 年 11 月 28 日对 JSD-1 菌运用国际放线 菌公认鉴定方法 - 多相鉴定， 进行属水平的鉴定。鉴定包括微生物形态特征观察、。
13、 生理生 化特征实验、 16S rDNA 序列系统发育分析等， 经鉴定该菌为灰略红链霉菌 (Streptomyces 说 明 书 CN 102703344 A 4 3/3 页 5 griseorubens)。 0030 命名该灰略红链霉菌为 JSD-1， 已于 2012 年 1 月 9 日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学 微生物研究所， 保藏编号为 CGMCC No.5706。 0031 实施例 3 本发明的灰略红链霉菌的纤维素酶、 木质素酶、 果胶酶及半纤维素酶产 生能力的测试 0032 首先，。
14、 采用相应酶检测平板对该菌产酶进行测定， 纤维素、 半纤维素、 果胶用刚果 红平板检测即可， 而三种木质素降解酶则分别需要愈创木酚、 苯胺蓝等进行检测。 0033 待测试完成， 采用 DNS 法， 测定发酵液中两种纤维素酶 CMCase 和 FPase 的活性， 分 别为 55.69U/ml 和 21.23U/ml ； 同样采用 DNS 法测定果胶酶和木聚糖酶的活性为 3.66U/ml 和4.27U/ml。 其中， 一个酶活单位为每分钟每毫升酶液催化反应物生成1g单糖产物的酶 量。 0034 分别以 ABTS、 藜芦醇、 Mn2+为反应底物， 采用分光光度法， 测定发酵液中漆酶 (Lac)、 。
15、木质素过氧化物酶 (Lip) 和锰过氧化物酶 (Mnp) 活性。经测定， 三种酶的活性分别 为 50U/L、 16.12U/L、 13.23U/L。定义每分钟氧化 1mol 底物 (ABTS、 藜芦醇、 Mn2+) 为一个 酶活单位 (U)。 0035 可见， 本发明的灰略红链霉菌具有较强的纤维素酶、 半纤维素酶、 果胶酶、 木质素 酶(包括漆酶Lac、 木质素过氧化物酶Lip和锰过氧化物酶Mnp)产生能力， 不会对自然界碳 循环产生负面影响， 不会对环境造成危害。 0036 实施例 4 灰略红链霉菌 (Streptomyces griseorubens) 对秸秆降解能力的测试 0037 以 。
16、5接种量将灰略红链霉菌孢子液接入秸秆降解培养基中， 秸秆降解培养基的 配方 ： KH2PO4 1.0g、 MgSO4 0.5g、 NaCl 0.1g、 CaCl22H2O 0.2g、 FeCl30.01g、 蛋白胨 3g、 酵母 提取物 0.5g、 牛肉膏 1g、 蒸馏水 1L， 其中秸秆为 20g/L。于 30、 150rpm 振荡培养， 分别在 第 0、 5、 10、 15、 20、 25、 30 天， 测定培养基中剩余的秸秆重量， 计算秸秆失重率。 0038 请参阅图 4， 结果显示， 随着培养时间的延长， 培养基中秸秆重量逐渐降低， 在第 0-5 天秸秆降解速度最快， 15 天后降解速。
17、度明显减缓， 该灰略红链霉菌在 30 天内对秸秆的 降解率达 76。 0039 实施例 5 本发明的灰略红链霉菌对植物病原菌 ( 甜瓜菌核病 ) 的拮抗作用 0040 将灰略红链霉菌浓密划线接种于高氏 1 号琼脂培养基上， 第 3 天待平板长满菌落 时， 用无菌打孔器取下菌块 ； PDA平板中心接种植物病原菌(甜瓜菌核病)， 培养3d后， 四周 打孔。 在PDA平板上相隔一定距离同时接种两种菌块， 30培养4d， 观察菌落之间有无抑菌 带、 抑菌带的宽度以及拮抗方向等。结果如图 5 所示， 本发明的灰略红链霉菌对土壤中的植 物病害微生物有一定的拮抗作用。 0041 以上公开的仅为本申请的几个具体实施例， 但本申请并非局限于此， 任何本领域 的技术人员能思之的变化， 都应落在本申请的保护范围内。 说 明 书 CN 102703344 A 5 1/2 页 6 图 1图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102703344 A 6 2/2 页 7 图 5 说 明 书 附 图 CN 102703344 A 7 。