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1、(10)授权公告号 CN 102703348 B (45)授权公告日 2013.08.21 CN 102703348 B *CN102703348B* (21)申请号 201210165944.5 (22)申请日 2012.05.25 CCTCC NO:M2012089 2012.03.23 C12N 1/20(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (73)专利权人 武汉科技大学 地址 430081 湖北省武汉市青山区建设一路 (72)发明人 颜家保 姚嫚 王巧凤 魏鑫 游海 许龙龙 (74)专利代理机构 武汉科皓知识产权代理事务 所 ( 特殊普通合伙 ) 42222 代理人。
2、 张火春 CN 101186890 A,2008.05.28, 全文 . CN 102250795 A,2011.11.23, 全文 . Yao,M.JQ806393.GenBank .2012, 第 1-2 页 . 姚嫚等 . 一株烷烃降解菌的筛选、 降解特性 及动力学研究 .石油炼制与化工 .2012, 第 43 卷 ( 第 2 期 ),28-32. (54) 发明名称 一株烷烃降解菌及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一株烷烃降解菌及其应用。本 发明所提供的一株烷烃降解菌 C20 属于冢村氏菌 （Tsukamurellasp.） ， 保藏于中国典型培养物保藏 中心， 保藏日期为 201。
3、2 年 3 月 23 日， 保藏编号为 CCTCC NO:M2012089， 菌株 16SrDNA 的 GenBank 登 录号为 JQ806393。该菌为革兰氏阳性菌， 菌落呈 菊黄色， 边缘整齐， 呈圆形， 表面干燥， 中心凸起， 显微镜下观察其菌体形态为短杆状， 呈链状排列， 没有荚膜。该菌 48h 内对浓度为 1000mg/L 的正 十六烷降解率高达 98%， 能高效降解柴油中的中 长链烷烃 （C12-C24） ， 并代谢产生能促进油类溶解 的生物乳化剂。 该菌应用于炼油废水、 受石油类污 染水体和土壤的生物强化处理与修复， 应用前景 良好。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl。
4、. (56)对比文件 审查员 武雪梅 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 1 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图2页 (10)授权公告号 CN 102703348 B CN 102703348 B *CN102703348B* 1/1 页 2 1. 一株烷烃降解菌， 经鉴定为冢村氏菌 （Tsukamurella sp.） ， 编号为 C20， 保藏于中国 典型培养物保藏中心， 保藏日期 2012 年 3 月 23 日， 保藏编号为 CCTCC NO: M2012089， 菌株 16S rDNA 的 Ge。
5、nBank 登录号为 JQ806393， 其特征在于 ： 冢村氏菌 （Tsukamurella sp.） C20 为革兰氏阳性菌， 菌落呈菊黄色， 边缘整齐， 呈圆形， 表面干燥， 中心凸起， 显微镜下观察其 菌体形态为短杆状， 呈链状排列， 没有荚膜 ； 该菌的过氧化氢酶实验、 V-P 实验和吲哚实验 均为阳性， 能利用正十六烷作为唯一碳源和能源进行生长繁殖。 2. 如权利要求 1 所述烷烃降解菌的应用， 其特征在于所述冢村氏菌 （Tsukamurella sp.） C20 以正十六烷为唯一碳源和能源进行生长， 用于炼油废水、 受石油类污染水体和土壤 的治理与修复。 3. 根据权利要求 2 。
6、所述烷烃降解菌的应用， 其特征在于所述的石油类为烷烃中的 C12-C24组分。 权 利 要 求 书 CN 102703348 B 2 1/5 页 3 一株烷烃降解菌及其应用 技术领域 0001 本发明属于环境污染物生物强化技术领域， 具体涉及一株烷烃降解菌及其应用。 背景技术 0002 随着石油工业的发展， 石油开采、 运输及炼制加工过程中， 大量石油通过各种途径 进入大气、 水体及土壤， 已造成严重的环境污染。据美国环境保护署 (EPA) 估计， 在美国约 有 35 百万个地下化学物质和石油储存仓库， 每年平均约有 1的仓库会发生泄漏， 严重影 响地表水和地下水的质量， 对人的身体健康带来极。
7、大危害。我国约有 11 万座加油站， 加油 站如此密布在城市的大街小巷， 一旦出现问题， 对地下水将会造成巨大的危害。 0003 生物强化技术因其针对性强、 效率高和成本低等优点， 被认为是目前最有生命力 的治理环境污染的新技术， 已广泛应用于废水与土壤的治理和修复， 成为近年来的研究重 点和热点。高效菌技术的核心是针对目标污染物筛选出具有优异降解能力的菌种。石油及 其产品是由正构烷烃、 直链烷烃、 芳烃、 脂环烃及少量的其他有机物组成的混合物， 其中以 烷烃的含量最高。目前， 已报道降解石油的菌种多为细菌类， 其中主要有假单胞菌属、 黄杆 菌属、 棒状菌属、 无色杆菌属、 节杆菌属和不动杆菌。
8、属等， 真菌类对石油类具有良好降解效 果的主要为白腐真菌， 放线菌中的红球菌对石油也有很好的降解能力。 0004 迄今为止， 国内外将冢村氏菌用于处理水体中的烷烃或用于修复土壤中石油类污 染则更是未见报道。 发明内容 0005 本发明旨在克服现有石油类污染物存在的问题， 目的是提供一种烷烃降解菌及其 应用， 该菌种能高效地降解石油类污染物中的烷烃组分。 0006 本发明所提供的冢村氏菌 （Tsukamurella sp.） C20来源于中国石油化工股份有限 公司武汉分公司污水处理站内受污染的土壤， 经人工富集、 平板划线分离纯化所得到。 该菌 为冢村氏菌 （Tsukamurella sp.） 。
9、编号为C20， 革兰氏阳性菌， 菌落呈菊黄色， 边缘整齐， 呈圆 形， 表面干燥， 中心凸起， 显微镜下观察其菌体形态为短杆状， 呈链状排列， 没有荚膜。过氧 化氢酶实验、 V-P 实验和吲哚实验均为阳性。该降解菌 16S rDNA 的 GeneBank 的登录号为 JQ806393， 于 2012 年 3 月 23 日在中国典型培养物保藏中心 （武汉大学） 保藏， 保藏编号为 CCTCC NO: M2012089。 0007 该菌能以正十六烷为唯一碳源和能源进行生长繁殖， 能在 48 h 内将浓度为 1000mg/L 的正十六烷降解至 20mg/L， 降解率达 98.0%。该菌对石油类中的烷。
10、烃具有高效降 解能力， 当以柴油为唯一碳源时， 该菌能对柴油中的中长链烷烃 （C12 C24） 高效地降解， 用 于炼油废水、 受石油类污染水体和受石油类污染土壤的治理与修复。 0008 本发明提供的冢村氏菌 （Tsukamurella sp.） C20 为放线菌， 不仅对石油中的烷烃 具有良好的降解作用， 而且在降解过程中还会产生生物乳化剂， 由于生物乳化剂属于表面 活性物质， 分子由疏水和亲水两部分构成， 同时具有亲脂和亲水的性质， 因此可增加油水的 说 明 书 CN 102703348 B 3 2/5 页 4 接触面积， 从而促进微生物对石油类污染物的生物降解效果。 0009 与现有技术。
11、相比， 本发明的冢村氏菌 （Tsukamurella sp.） C20 能以正十六烷为唯 一碳源和能源进行生长繁殖， 对石油类污染物有较强的降解能力， 并且在降解烷烃组分的 同时还可产生生物乳化剂， 能够提高烷烃和石油类污染物在水中的溶解度， 更有利于炼油 废水的生物强化处理， 亦利于水体和土壤中石油类污染物的治理与生物修复。 附图说明 0010 图 1 为冢村氏菌 （Tsukamurella sp.） C20 降解正十六烷的效果图 ； 0011 图 2 为冢村氏菌 （Tsukamurella sp.） C20 对柴油降解前后的气相色谱图 ； 0012 图 3 为冢村氏菌 （Tsukamure。
12、lla sp.） C20 对添加较高浓度正十六烷的炼油废水强 化处理效果图。 具体实施方式 0013 下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步描述， 并非对其保护范围的限 制。 0014 实施例 1 ： 冢村氏菌 （Tsukamurella sp.） C20 的分离、 鉴定及其对烷烃的降解性能 0015 菌源采自中国石油化工股份公司武汉分公司污水处理站内受污染的土壤， 距表层 2 4 cm 油泥混合物， 呈黑褐色。 0016 将采集的土样 2g 加入到 100 mL 含 200 mg/L 正十六烷的 LB 培养基 （蛋白胨 1wt %， 氯化钠 1wt %， 酵母抽提物 0.5 wt%） 中。
13、， 加入 15 20 颗灭菌的玻璃珠， 在 30和 150 r/ min条件下活化培养24 h。 静置10 min， 取2 mL培养液转接至100 mL正十六烷无机盐培养 集中， 相同条件驯化培养 1 2 d， 梯度转接 4 次， 其中正十六烷浓度分别为 200、 500、 1000、 2000 mg/L。 将含正十六烷2000 mg/L的培养液梯度稀释， 并涂布于无机盐平板上， 30培养 24 h 后， 挑选边缘清晰的菌落， 经 LB 平板划线纯化至获得单菌落， 分别进行正十六烷降解 试验。正十六烷含量采用高压气相色谱方法测定。无机盐培养基的组成如下 （g/L） ：（NH4） 2SO4为 1。
14、g ； K2HPO43H2O 为 0.5g ； KH2PO4H2O 为 0.5g ； NaCl 为 1g ； MgSO47H2O 为 0.2g ； FeSO47H2O 为 0.03g ； CaCl22H2O 为 0.002g ； 去离子水为 1 L ； 自然 pH。 0017 烷烃降解菌 C20 为革兰氏阳性菌， 菌落呈橘黄色， 边缘整齐， 呈圆形， 表面干燥， 中 心凸起 ； 过氧化氢酶实验、 V-P 实验和吲哚实验均为阳性。 0018 将烷烃降解菌 C20 接种于 LB 培养集中， 于 37摇床 （150 r/min） 培养 14 h， 离心 收集菌体， 重悬， 加溶菌酶和 SDS 破壁，。
15、 用酚 - 氯仿法提取基因组 DNA， 并采用正向引物 27f （5 -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ） 和反向引物 1492R（5 -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3 ） ， 对其基因组进行PCR扩增， 将扩增引物进行测序。 16S rDNA 基因序列长为1419 bp， 然后在 GenBank中进行Blast比对。 结果显示， 与其序列相似性达到99%的均为Tsukamurella sp， 选取其中相似序列， 采用 Clustal X （1.83） 对所获得的核苷酸序列进行比对分析， 得到序列 之间的相似度值， 并用 MEGA 2.0 计算出序列的系统进化。
16、距离， 构建系统进化树。进化树显 示， 与其相似度最高的菌株都为Tsukamurella sp.菌株， 其 16S rDNA 序列如序列表所示。 结合菌株的生理生化特性和 16S rDNA 的测定结果， 将其归属为冢村氏菌属 (Tsukamurella sp.)， 编号为 C20。 说 明 书 CN 102703348 B 4 3/5 页 5 0019 将冢村氏菌(Tsukamurella sp.)C20的悬菌液接种到含正十六烷1000 mg/L的无 机盐培养基中， 分别测定不同时间剩余的正十六烷浓度， 测定结果如图 1 所示， 菌株在前 8 h内处于生长延滞期， 8 h后降解菌适应环境， 降。
17、解速率逐渐提升， 在824 h为快速降解期， 36 h 时剩余正十六烷的浓度降低到 200 mg/L。36 48 h 期间降解速率减慢， 在培养 48 h 时， 残留正十六烷浓度仅为 20 mg/L， 表现出很好的降解性能。 0020 实施例 2 ： pH 对冢村氏菌 （Tsukamurella sp.） C20 降解性能的影响 0021 向无机盐培养基接种 2vol% 的冢村氏菌 （Tsukamurella sp.） C20 菌悬液， 调节无 机盐培养基为不同的 pH 值 （5.0 8.0） ， 在起始正十六烷浓度为 1000mg/L 的条件下， 培养 36 h， 测定 pH 值对 C20 。
18、降解正十六烷的影响， 结果见表 1。由表 1 表明， 在 pH 为 5.0 7.0 范围内， 随着培养基中pH的升高， 菌株C20降解烷烃能力增加， pH为7时， 降解能力最强， 降 解率达79.4 % ； pH为8.0时， 降解率下降至54.2%， 而pH为6.0时的降解率却达到了65.1%， 说明菌株 C20 在中性或弱偏酸性环境中对烷烃的降解能力较强。 0022 表 1 pH 对菌株 C20 降解正十六烷性能的影响 0023 初始 pH 降解率 （%） 5.023.1% 5.545.7% 6.065.1% 6.578.9% 7.079.4% 7.577.2% 8.054.2% 0024 。
19、本实施例说明冢村氏菌 （Tsukamurella sp.） C20 在中性和弱偏酸性的 pH 范围内 均具有较强的降解能力， 碱性条件下该降解菌的活性会受到一定的抑制。 0025 实施例 3 ： 冢村氏菌 （Tsukamurella sp.） C20 对柴油的降解 0026 将 2vol% 的冢村氏菌 （Tsukamurella sp.） C20 接种于添加有 800mg/L 柴油的无机 盐培养基中， 于 37和 150r/min 的摇床培养， 分别培养 8、 12、 18 和 23 h， 取样， 气相色谱法 分析菌株对柴油的降解率， 同时以不加菌的样品为对照。从表 2 和图 2 看出， 虽然。
20、在初始的 12 h 内， 柴油组分挥发损失达 14.2%， 但加入菌株Tsukamurella sp. C20 的降解率已达到 58.1%， 表明该菌能降解柴油中的大部分烷烃。从图 2 看出， 该菌对烷烃组分 （C12 C24） 有很 好的降解效果。 0027 表 2 菌株 C20 对柴油的降解效果 0028 说 明 书 CN 102703348 B 5 4/5 页 6 0029 本实施例说明冢村氏菌 （Tsukamurella sp.） C20 不仅可以降解正十六烷， 对柴油 中的 C12 C24中长链烷烃组分也具有很好的降解性能， 为该菌对炼油废水的生物强化处理 和对受石油类污染的土壤的生。
21、物修复提供了依据。 0030 实施例 4 ： 冢村氏菌 （Tsukamurella sp.） C20 所产生的生物乳化剂的提取 0031 将 2vol% 的冢村氏菌 （Tsukamurella sp.） C20 接种于含 500 mg/L 的正十六烷无 机盐培养基中， 37 摇床培养 （150 r/min） 3 d， 取出培养液， 用纱布脱脂棉过滤、 离心和去 菌体 （菌体于 45烘箱烘干） ， 取一定量上清液， 调 pH 为 2， 置于冰箱过夜， 将上清液加入等 体积的氯仿甲醇提取， 蒸干， 干燥后的晶体再用氯仿洗涤， 再蒸干， 得到白色生物表面活 性剂。 0032 将 5 mL 培养液与 。
22、5 mL 石蜡混合， 超声波震荡 20 min， 静置 1 h， 乳化指数达 63%， 表明冢村氏菌 （Tsukamurella sp.） C20 产生的乳化剂具有较好的乳化性能。 0033 本实施例说明冢村氏菌 （Tsukamurella sp.） C20不仅能利用正十六烷为唯一碳源 和能源进行生长繁殖， 而且在降解过程中还能产生具有表面活性作用的生物乳化剂， 为其 促进石油类污染物的生物修复提供了理论依据。 0034 实施例 5 冢村氏菌 （Tsukamurella sp.） C20 对添加较高浓度正十六烷的炼油废 水的强化处理 0035 在锥形瓶中， 将冢村氏菌 （Tsukamurell。
23、a sp.） C20投加到中石化的活性污泥中， 设 置 3 组实验考察其对正十六烷的去除效果。 0036 (a) 32 mL 的炼油废水 +33 mL 的无机盐培养基 +500 mg/L 的正十六烷 +30 mL 的 活性污泥 +5 vol % 的 C20 菌悬液 ； 0037 (b) 32 mL 的炼油废水 +33 mL 的无机盐培养基 +500 mg/L 的正十六烷 +30 mL 高 压灭菌后的活性污泥 +5 vol % 的 C20 菌悬液 ； 0038 (c) 32 mL 的炼油废水 +38 mL 的无机盐培养基 +500 mg/L 的正十六烷 +30 mL 活 性污泥。于 37摇床 （。
24、150 r/min） 培养。 0039 间隔一定时间， 取样测定培养液中正十六烷的残留浓度， 结果如图 3 所示 ： 冢村氏 菌 （Tsukamurella sp.） C20 起到了明显的生物强化作用， 并在 24 h 内将添加 500 mg/L 正 十六烷的炼油废水中的正十六烷完全去除。 0040 本具体实施方式为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简 化， 均应为等效的。 说 明 书 CN 102703348 B 6 5/5 页 7 0041 本具体实施方式的冢村氏菌 （Tsuk。
25、amurella sp.） C20能以正十六烷为唯一碳源和 能源进行生长繁殖， 对石油类污染物有较强的降解能力， 并且在降解烷烃组分的同时还可 产生生物乳化剂， 能够提高烷烃和石油类污染物在水中的溶解度， 更有利于炼油废水的生 物强化处理， 亦利于水体和土壤中石油类污染物的治理与生物修复。 说 明 书 CN 102703348 B 7 1/1 页 8 序 列 表 CTATGGGTGC TTACACATGC AGTCGAACGG TAAGGCCCTT TCGGGGGTAC ACGAGTGGCG 60 AACGGGTGAG TAACACGTGG GTGACCTGCC CTGTACTTCG GGAT。
26、AAGCCT GGGAAACTGG 120 GTCTAATACC GGATATGACC TTCTCCTGCA TGGGGGTTGG TGGAAAGCTT TTGCGGTACA 180 GGATGGGCCC GCGGCCTATC AGCTTGTTGG TGGGGTAATG GCCTACCAAG GCGACGACGG 240 GTAGCCGGCC TGAGAGGGCG ACCGGCCACA CTGGGACTGA GACACGGCCC AGACTCCTAC 300 GGGAGGCAGC AGTGGGGAAT ATTGCACAAT GGGCGCAAGC CTGATGCAGC GACGCCGCGT 36。
27、0 GAGGGATGAC GGCCTTCGGG TTGTAAACCT CTTTCAGTAG GGACGAAGCG CAAGTGACGG 420 TACCTACAGA AGAAGCACCG GCCAACTACG TGCCAGCAGC CGCGGTAATA CGTAGGGTGC 480 GAGCGTTGTC CGGATTTACT GGGCGTAAAG AGCTCGTAGG CGGTTTGTCG CGTCGTCTGT 540 GAAAACCCGA GGCTTAACCT CGGGCCTGCA GGCGATACGG GCAGACTTGA GTACTGTAGG 600 GGAGACTGGA ATTCCTG。
28、GTG TAGCGGTGGA ATGCGCAGAT ATCAGGAGGA ACACCGGTGG 660 CGAAGGCGGG TCTCTGGGCA GTAACTGACG CTGAGGAGCG AAAGCGTGGG TAGCGAACAG 720 GATTAGATAC CCTGGTAGTC CACGCCGTAA ACGGTGGGTA CTAGGTGTGG GTTTCCTTCC 780 ACGGGATCCG TGCCGTAGCT AACGCATTAA GTACCCCGCC TGGGGAGTAC GGCCGCAAGG 840 CTAAAACTCA AAGGAATTGA CGGGGGCCCG CACAA。
29、GCGGC GGAGCATGTG GATTAATTCG 900 ATGCAACGCG AAGAACCTTA CCTGGGTTTG ACATATAGAG GATCGCCGCA GAGATGTGGT 960 TTGCCTTGTG CCTTCTATAC AGGTGGTGCA TGGCTGTCGT CAGCTCGTGT CGTGAGATGT 1020 TGGGTTAAGT CCCGCAACGA GCGCAACCCT TGTCTCATGT TGCCAGCACG TTATGGTGGG 1080 GACTCGTGAG AGACTGCCGG GGTCAACTCG GAGGAAGGTG GGGATGACGT C。
30、AAGTCATCA 1140 TGCCCCTTAT GTCCAGGGCT TCACACATGC TACAATGGCG CGTACAGAGG GCTGCGATAC 1200 CGTGAGGTGG AGCGAATCCC TTAAAGCGCG TCTCAGTTCG GATTGGGGTC TGCAACTCGA 1260 CCCCATGAAG TCGGAGTCGC TAGTAATCGC AGATCAGCAA CGCTGCGGTG AATACGTTCC 1320 CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCACGTCA TGAAAGTCGG TAACACCCGA AGCCGGTGGC 1380 CTAACCCCTT GTGGGAGGAG CTGTCGAAGG TGGATGGCT 1419 序 列 表 CN 102703348 B 8 1/2 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102703348 B 9 2/2 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 102703348 B 10 。