本发明涉及一种能用于包装重组腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus,AAV)的Ⅰ 型单纯疱疹病毒载体(HSV-1)及其用途,特别涉及将AAV全基因组但不包含其两端反 向重复(Inverted terminal repeats,ITR)的191--4484核苷酸共约4.3kb序列,克隆于以HSV-1 病毒的复制起点区及包装位点序列元件为基础的质粒型HSV-1载体而产生的HSV-AAV嵌 合质粒,当它转染细胞后,在HSV-1病毒存在时,可产生一种混合毒株,其中含有野生型 的HSV-1病毒和复制缺陷含多拷贝HSV-1复制元件和AAV基因组连结体的HSV-1假型病 毒。此混合毒株中,野生型HSV-1病毒充当重组AAV包装的辅助病毒,复制缺陷的HSV-1 假型病毒表达AAV基因组编码的蛋白以提供反式功能,两者结合起来可用于包装携带外源 基因的重组腺病毒伴随病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)。或转到携带rAAV 原病毒的培养人传代细胞系用于拯救出rAAV。
AAV属于微小病毒科,它的基因组是单链DNA,由4682个核苷酸组成,两端各有 145个核苷酸的反向重复序列,是与AAV基因组的复制起点和与复制及整合染色体相关的 顺式序列元件的所在,病毒基因组的编码信息从蛋白的功能可分成两部分,左端编码与病 毒复制、转录必需的蛋白,右端编码的是病毒的结构蛋白。
AAV是非自主复制的病毒,它的产毒性复制需要有辅助病毒如腺病毒ADV或单纯疱 疹病毒HSV的协助才能进行。当辅助病毒不存在时,AAV感染人细胞后,病毒DNA整 合于宿主染色体的特定位置,会建立了一种隐性感染的状态,不会产生子代病毒;但当宿 主细胞被腺病毒或单纯疱疹病毒感染时,可将AAV从整合于染色体的原病毒状态激活并从 中拯救出来,从而破坏了AAV的隐性感染,复制产生子代AAV毒粒。
AAV分子生物学的一个重要特点是被克隆化于大肠杆菌质粒的AAV全基因组,转染 进细胞的时候,当存在腺病毒或单纯疱疹病毒的感染,质粒中的AAV基因也可被拯救出 来,进行产毒性复制,产生野生型的AAV毒粒。这一特性构成了制备重组AAV病毒载体 的理论基础。
克隆了AAV全基因组的质粒,通过遗传工程的方法,去除了基因组中用于编码病毒蛋 白的部分或全部序列元件,但保留AAV基因组中两端的ITR,插入了相当于被删去AAV 基因片段大小的外源DNA,可得到含外源基因的重组AAV病毒表达载体质粒(Ⅰ);同 时,除去克隆化AAV全基因组两端的ITR,保留其编码病毒蛋白的全部基因序列,可得 到用于辅助重组AAV载体包装的助手包装质粒(Ⅱ),它转染细胞后,在辅助病毒如ADV 或HSV存在下,可表达与AAV辅助和包装必需的病毒蛋白,但由于缺失了复制必需的顺 式元件,不能进行复制和包装出野生型AAV毒粒。而当感染了辅助病毒的细胞共转染Ⅰ和 Ⅱ这两种质粒时,(转染方法可以是磷酸钙共沉淀发或脂质体介导的转染),助手包装质 粒Ⅱ表达的反式蛋白,识别重组AAV病毒表达载体质粒Ⅰ中AAV的ITR顺式作用元件, 将重组AAV两端的ITR连同外源基因一起从质粒Ⅰ中拯救出来,进行复制和包装出重组 AAV病毒颗粒。采用化学或物理手段除去和灭活辅助病毒,得到的重组AAV毒粒可作为 一种转导性载体,通过病毒感染的方式将外源基因导入到细胞中,并可整合于宿主染色体 得到稳定的表达。与逆转录病毒载体相比,重组AAV载体能转导有丝分裂后细胞和分化终 端细胞,AAV具有超感染的特性,可进行重复感染,同时在人类至今还为发现于AAV直 接相关的疾病,这些特点使它具有在人类疾病的基因治疗的应用前景。
目前制备重组AAV毒粒的方法基本上是按上述原理进行,也就是采用两种不同的AAV 质粒共转染细胞,一种载体提供AAV的反式作用蛋白,另一种提供复制和包装必需的顺式 序列元件和外源基因,在辅助病毒的协助下,获得携带外源基因的AAV毒粒。
为提高重组AAV载体的包装效率,Samulski将克隆化野生型AAV基因组的两端ITR 以腺病毒5型基因组两端的重复序列所取代,获得的AAV包装质粒pAd8,(Samulski et al:Helper free stocks of recombinant adeno-associated virus:normal intergration does not require viral gene expression.J.Virology 63:3822-3828),虽然ADV的末端重复能允许被导入已感 染ADV的细胞中的pAd8按腺病毒复制的机制进行有限的扩增,但还未能离开上述的工作 模式,尽管这过程相对简单,但操作起来较为繁琐,表现为由于没有获得一种能支持重组 AAV复制和包装的细胞系的存在,每次操作都需要将两种载体共转染细胞,由于共转染两 种载体同时到大量的细胞个体的频率较低,因此也影响到产生高滴度重组AAV病毒的效 率。
Lebkowski等人(Applied Immune Science,Inc.),提出了一种改进,他们将缺失两端ITR 的AAV全基因组的序列重组于腺病毒E3区的重组腺病毒时,该重组腺病毒不仅能提供辅 助病毒的功能,同时也表达出AAV包装所必需的反式蛋白,用于rAAV的包装(US5173414, US5354678)。这过程看起来相当简化,免却了产生rAAV需要共转染两种载体的传统方法, 通过了工作效率。但需要用到细胞内同源重组,及重组病毒的筛选等繁琐的操作才能获得 可供应用重组腺病毒,用于产生rAAV载体。
本发明的目的是提供一种能用于组建重组腺病毒伴随病毒包装系统的复制缺陷型 HSV-1载体,它克隆了不含两端包装信号ITR的AAV全基因组编码序列,利用此载体可 以简单地产生用于包装rAAV载体的辅助病毒混合毒株。载体被导入细胞后,在野生性的 HSV-1病毒存在下,质粒DNA以其携带的HSV复制元件为基础,进行滚环复制,并以连 结体的形式被包装成含十多个AAV基因组拷贝的复制缺陷型HSV-1假型病毒,从而获得 一种HSV-1混合毒株,其中野生型的HSV-1病毒提供类似腺病毒功能的辅助病毒的作用, 假型病毒中携带的十几个拷贝的AAV基因组序列可表达以提供重组AAV的复制蛋白和结 蛋白的反式功能,以支持携带外源基因的重组AAV载体包装成重组AAV病毒颗粒。特别 是该载体转染细胞后,在野生型HSV-1的辅助下,一步就可获得混合毒株,不需进行同源 重组及重组病毒的分离,大大简化了工作步骤。当细胞转染进含外源基因的重组AAV载体 质粒,再以此混合毒株转导该细胞,就能从将重组AAV载体从质粒中拯救出来并包装成重 组病毒。
本发明的特点是采用HSV-1复制子载体荷载AAV的基因组序列,在野生型HSV-1存 在时可获得一种混合毒株,此混合毒株的产生不需进行同源重组、重组病毒的筛选和纯化, 其中,野生型HSV-1病毒充当重组AAV包装的辅助病毒,类似于传统方法中腺病毒的功 能;每个复制缺陷的HSV-1假型病毒携带了含十几个ITR缺失的AAV全基因组序列,可 表达AAV基因组编码的蛋白以提供反式功能。与传统方法细胞更为简便易行,可有效提高 rAAV的包装效率。
本发明的用于包装重组腺病毒伴随病毒的单疱病毒载体,由以下DNA元件组成:
1,AAV病毒蛋白编码序列:AAV基因组191-4484核苷酸。
2,HSV-1病毒复制起点区HSV Ori。
3,HSV-1病毒包装位点序列a’。
4,大肠杆菌质粒骨架(包括大肠杆菌复制子和氨苄青霉素抗性β内酰胺酶基因)。
本发明的用于包装重组腺病毒伴随病毒的单疱病毒载体,有两种,见附图1,都是将 AAV的全基因(除去两端ITR的191-4484)的序列,克隆于复制缺陷型的HSV复制子载体 中,一种是AAV的病毒蛋白编码序列的转录方向与质粒骨架上β内酰胺酶基因的转录方向 一致的pHSV-AAV(+),另一种是AAV的病毒蛋白编码序列的转录方向与质粒骨架上β内 酰胺酶基因的转录方向相反的pHSV-AAV(-)(两种质粒均寄存于大肠杆菌DH5α株,含 该质粒的菌种命名为Escherichia coli DH5 α/pHSV-AAV(+)和Escherichia coli DH5α /pHSV-AAV(-),已于1996年12月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心,登记入册的编号为CGMCC NO.0284)
本发明用于构建可组建重组腺病毒伴随病毒包装系统的自主复制载体pHSV-AAV(+) 和pHSV-AAV(-)的原始质粒有:
pSub201:Samulski et al,A recombinant plasmid from which an infectious adeno- associated virus genome can be excited in vitro and its use to study viral replication。
pHSV-apl:杨天忠、颜子颖等,中国专利申请号:96 104958.8,中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心,登记入册的编号为CGMCC NO.0263)。
从pSub201中以XbalⅠ酶切,回收4.293bp的AAV基因组191-4484核苷酸片段,插 入pHSV-apl质粒的多克隆位点的XbalⅠ处,通过限制酶切分析,得到AAV转录方向与 pHSV-apl载体上β内酰胺酶基因的转录方向相同或相反的pHSV-AAV(+)和pHSV- AAV(-)。
本发明提出的用于包装重组腺病毒伴随病毒的Ⅰ型单纯疱疹病毒载体pHSV-AAV(+)和 pHSV-AAV(-),可转染到培养细胞系中,在野生型HSV-l存在时,产生一种包括野生型 HSV-1和携带含十几个拷贝的AAV基因组的DNA连结体的HSV-1假型病毒的混合毒株; 此毒株转导转染了重组AAV载体的细胞后,野生型HSV-1提供AAV复制的辅助功能,而 假型病毒表达AAV基因组编码的蛋白以提供反式功能,从而包装出携带外源基因的AAV 病毒颗粒。
本发明提出的用于包装重组腺病毒伴随病毒的Ⅰ型单纯疱疹病毒载体pHSV-AAV(+)和 pHSV-AAV(-),可寄存在大肠杆菌DH5α株,含pHSV-AAV(+)质粒的菌株命名为大肠杆 菌DH5α/pHSV-AAV(+)(Escherichia coliDH5α/pHSV-AAV(+);含pHSV-AAV(-)质粒 的菌株命名为大肠杆菌DH5α/pHSV-AAV(-)(Escherichia coi DH5α/pHSV-AAV(-), 上述两菌种均可在含50-100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(1%tryptone,0.5%yeast extract,1%NaCl)传代培养。
以下实施例对本发明的用于包装重组腺病毒伴随病毒的Ⅰ型单纯疱疹病毒载体pHSV- AAV(+)和pHSV-AAV(-)的制备和用途作了详细说明,但不意味着限制本发明的内容。在实 施例中,所用的重组AAV载体质粒pAAVlac是pSub201质粒中AAV编码病毒蛋白部分 4.3kb XbalⅠ片段为一片段大小相同的β半乳糖苷酶的表达单位所取代,BHK-21细胞是金 黄地鼠肾细胞系(ATCC CCL10),A549是人肺癌上皮细胞系(ATCC CCL185)。野生型 HSV-1ts株来自英国病毒研究所(Genetic studies with HSV-1.the isolation of temperature- sensitive mutants,their arrangement into complementation groups and recombination analysis leadingtolinkage map.J.Gen.Virol.1973,63:2260~2269)
实施例1:质粒的制备。
大肠杆菌DH5α/pHSV-AAV(+)或大肠杆菌DH5α/pHSV-AAV(-)接种于200ml LB 培养液,37℃培养24小时,离心收菌体,加5ml溶液Ⅰ(50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris-HCl,10mmol/L EDTA,pH8.0)重悬菌体,冰浴下加10ml溶液Ⅱ(0.2mol/L NaOH, 1%SDS),5分钟后加7.5ml溶液Ⅲ(100ml中含5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml,水 28.5ml〕混匀,15000rpm离心15分钟,上清加0.6倍体积异丙醇沉淀。沉淀以2ml TE溶 液(10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA,pH5.0)溶解,等体积酚-氯仿-异戊醇(24∶24∶1,v/v) 抽提除蛋白质,然后在Sepharose 4B柱(15.0×1.0cm)凝胶过滤,收集流出的质粒峰。
实施例2:HSV-1病毒ts株的制备
HSV-1病毒ts株为温度敏感型毒株,其允许温度为31℃,高于此温度会影响其活性。病 毒的制备同常规病毒的制备,取0.5ml病毒液感染已长成单层的A549细或BHK-21细胞, 31℃吸附2小时,倒掉病毒液,加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,31℃培养至细胞出 现90-100%病变。将细胞反复冻融三次,离心,除去细胞残渣,所得上清液即为病毒液。 可用噬斑滴定法测定病毒液的滴度。
实施例3:HSV-AAV假型病毒混合毒株的产生。
pHSV-AAV(+)或pHSV-AAV(-)质粒用脂质体转染的方法转染A549细胞或BHK-21细 胞,48小时后倒掉培养液,加入0.5ml HSV-1病毒液,31℃吸附2小时,倒掉病毒液,加入 含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,31℃培养至细胞出现90-100%病变。将细胞反复冻 融三次,离心,除去细胞残渣,所得上清液即为混合病毒液。
实施例4:以混合毒株包装重组AAV质粒制备重组AAV病毒颗粒。
重组AAV质粒pAAVlac用脂质体转染的方法转染A549细胞或vero细胞,48小时后 倒掉培养液,加入0.5ml含有HSV-AAV假型病毒的混合病毒液,31℃吸附2小时,倒掉 病毒液,加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,37℃继续培养,2-3天后,当细胞出 现明显的细胞病变时,收获混有混合毒株HSV-AAV的重组AAV病毒。收毒时,细胞培养 液和细胞都回收,反复冻融或以超声处理使细胞完全裂解,离心去掉细胞碎片,65℃加热 1小时以灭活HSV-1病毒和HSV-AAV假病毒,再经0.22μm醋酸纤维膜过滤除菌,得到 可用与转导细胞的重组AAVlac病毒。
实施例5:重组AAVLac病毒颗粒感染培养人细胞系。
实施例4所获的带报道基因β半乳糖苷酶的重组腺病毒伴随病毒颗粒AAVlac可用于感 染人养细胞系。重组AAV-Lac病毒感染A549细胞,48小时后,以细胞化学的方法检测β 半乳糖苷酶的表达,(Somatic Cell Mol.Genet.,13(3),253-265,1987.),细胞以磷酸钠缓 冲液洗涤2遍,加入含X-Gal的染色液,30分钟或更长时间后观察,可见被感染细胞因外 源基因的表达而呈蓝色,其典型的转导效率为当病毒滴度为107时,感染培养有106个细胞 的培养皿,可见培养皿的细胞全部变蓝。
实施例6:用HSV-AAV混合毒株从AAVlac转导的细胞中拯救出重组AAV病毒颗粒。
重组AAV-Lac病毒感染A549细胞,48小时后可加入0.5ml含有HSV-AAV假型病 毒的混合病毒液,3l℃吸附2小时,倒掉病毒液,加入含10%胎牛血清的RPMIl640培养 液,37℃继续培养,2-3天后,当细胞出现明显的细胞病变时,收获混有混合毒株 HSV-AAV的重组AAV病毒。收毒时,细胞培养液和细胞都回收,反复冻融或以超声处理 使细胞完全裂解,离心去掉细胞碎片,65℃加热1小时以灭活HSV-1病毒和HSV-AAV 假病毒,再经0.22μm醋酸纤维膜过滤除菌,得到可用与转导细胞的重组AAVlac病毒。 经此过程,可使AAVlac的滴度进一步提高。
附图 pHSV-AAV(+/-)质粒简图 HSVorip表示HSV-1病毒复制起点区 a’表示HSV-1病毒包装位点序列 AAV表示AAV基因组191-4484核苷酸序列 AAV基因组方向Amp方向相同为pHSV-AAV(+) AAV基因组方向Amp方向相同为pHSV-AAV(-) Amp表示氨苄青霉素抗性β-内酰氨酶基因 orip表示大肠杆菌复制子