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背景技术
最近，一类非编码小RNA，称为microRNA(miRNA)，已被鉴定作用 于植物和动物基因表达的转录后调控(Carrington和Ambrose，Science 301：336(2003))。最初在C.elegans中鉴定，miRNA通过与其目标mRNA 的3’非翻译区(UTR)或编码序列的互补位点碱基配对并抑制其翻译而发挥 作用(Wang等人，Nucleic.Acids Res.32：1688(2004))。
虽然成熟miRNA长度仅～22核苷酸(nt)，但其通过Dicer复合物的作 用源于～70聚体前体(pre-miRNA)序列的发夹区(Lee等人，EMBO J. 21：4663(2002))。然后成熟miRNA合并入miRNP，即介导miRNA对基因 调控作用的核糖核蛋白复合物(Mourelatos等人，Genes Dev.16：720 (2002))。
生物信息学研究预测蠕虫和苍蝇基因组编码～100miRNA，脊椎动物基 因组编码～250miRNA(Lai等人，Genome Biol.4：R42(2003)；Lim等人， Genes Dev.17：991(2003)；Lim等人，Science 299：1540(2003))。这相当于每 种基因组中预测编码蛋白基因数量的～0.5-1％，表明了miRNA作为一类调控 基因产物的重要性(Brennecke和Cohen，Genome Biol.4：228(2003))。
miRNA已涉及多种生物学过程，包括植物的花和叶发育、蠕虫的幼虫 发育、苍蝇的细胞凋亡和脂肪代谢、以及哺乳动物的造血细胞分化和神经发 育(Bartel，Cell 116：281(2004))。另外，很多miRNA基因定位于与癌症相 关的人类染色体区域(例如脆性位点、断裂点、杂合性丢失区域、扩增区域) (Calin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：2999(2004))。多种miRNA也 已显示在体内与脆性X智力低下蛋白(FMRP)相互作用(Jin等人，Nat. Neurosci.7：113(2004))，提示这些微小RNA在人类健康和疾病中的作用。
由于不同的细胞类型和疾病状态与某些miRNA的表达相关，获得 miRNA的时间和空间表达谱是重要的。已使用Northern杂交确定miRNA的 表达水平(参见，例如Sempere等人，Genome Biol.5：R13(2004)；Aravin等 人，Dev.Cell 5：337(2003)；Grad等人，Mol.Cell 11：1253(2003)；Lim等人， Genes&Dev.17：991(2003))，但是该方法对于高通量分析工作量太大。已 使用基于PCR的方法监测miRNA的表达，但是这些方法也需要使用昂贵的 基因特异性引物(参见，例如Schmittgen等人，Nucleic Acids Res.32：e43 (2004))，或者低效的平末端连接以将引物结合连接子与miRNA分子连接 (参见，例如Miska等人，Genome Biol.5：R68(2004)；Grad等人，Mol.Cell 11：1253(2003)；Lim等人，Genes&Dev.17：991(2003))。另外，PCR可在 扩增目标miRNA分子群体中引入显著偏差。
最近已开发了高通量微阵列在多种组织和细胞类型中鉴定miRNA的表 达模式(参见，例如Babak等人，RNA 10：1813(2004)；Calin等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 101：11755(2004)；Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：9740(2004)；Miska等人，Genome Biol.5：R68(2004)；Sioud andBioTechniques 37：574(2004)；Krichevsky等人，RNA 9：1274(2003))。使用 微阵列检测miRNA表达具有多种优势，包括在单一时间点测定同一样品中 多个基因表达的能力，仅需要少量RNA，以及同时鉴定前体和成熟miRNA 分子表达的潜力。
但是，由于成熟miRNA长度仅～22nt，且在任何特定组织中含量极为 有限，这些小RNA对微阵列标记和检测提出了挑战(Sioud andBioTechniques 37：574(2004))。例如，可使用荧光团共价连接在微阵列分析 中直接标记miRNA分子(参见，例如Babak等人，RNA 10：1813(2004)； MICROMAX ASAP miRNA Chemical Labeling Kit，Perkin Elmer，Waltham， MA；LabelμArray Labeling Kit，Mirus Bio Corp.，Madison，WI)，但是该 方法缺少检测微量目标miRNA分子的灵敏度。直接标记还可导致随机加入 的荧光团的分子间猝灭，导致进一步降低灵敏度。已使用miRNA分子的随 机引物逆转录生产用于微阵列分析的标记cDNA分子(参见，例如Sioud and ，BioTechniques 37：574(2004)；Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：9740(2004))，但是该方法不能产生原始全长miRNA群体的准确表示。
已开发了显著提高miRNA分析准确性和灵敏度的新标记方法(参见， 例如同时待审的美国专利申请No.10/979,052，公布为美国专利公布No. 2006/0094025)。但是，这些方法使用间接标记连接并需要多个杂交步骤以 在测定中显现信号。此外，这些方法受制于大捕获试剂分子，其需要独立杂 交步骤以改善结合动力学。虽然提供良好的结果，但是这些方法不易适用于 高通量分析且需要非常多的时间得到预期结果。因此，急需快速、灵敏、且 有效的miRNA分子标记和检测方法用于微阵列和高通量分析。
发明内容
申请者已发明了标记目标miRNA分子的方法，其中一核酸标记分子直 接连接到miRNA分子的3’末端。申请者已发现，通过使用优化的核酸标记 分子无需PCR即可减少猝灭并增强信号强度，由此得到用于miRNA分析尤 其是高通量分析的改良方法和试剂。所述优化的核酸标记分子优选地为多重 标记的聚合骨架，其与多个能够发射或产生可检测信号的标记分子连接。所 述多重标记的聚合骨架可为其可连接标记分子的任何聚合物，例如蛋白质、 肽、糖类、多糖、脂类、脂肪酸、核酸等等。在优选的实施方案中，所述多 重标记的聚合骨架包含一种小DNA树枝状聚合物，其包含20-1000个碱基， 更优选地300-750个碱基的核酸，并包含一个可连接末端和10-15个能够发 射或产生可检测信号的标记分子。所述可连接末端具有可连接至miRNA分 子3’末端的5’磷酸基团。所述核酸标记分子尺寸足够小以允许在多种检测 平台上，例如微阵列和基于珠子的测定，与miRNA分子快速、有效杂交。
因此，本发明的一个方面指向多重标记的聚合骨架，其上连接多种能够 发射或产生可检测信号的标记分子，其中所述多重标记的聚合骨架包含寡核 苷酸尾部，其包含能够杂交结合核酸序列的5’磷酸基团。在优选的实施方案 中，所述多重标记的聚合骨架总分子量约50到约350kDa。在某些实施方案 中，所述标记分子包含一个或多个荧光团部分。在其它实施方案中，所述标 记分子包含一个或多个生物素部分。
在优选的实施方案中，延伸序列能够结合的核酸序列为桥接寡核苷酸， 也能够与分离的和不同于所述聚合骨架的核酸分子杂交。所述聚合骨架和桥 接寡核苷酸共同构成核酸分子标记系统。优选地，所述分离的和不同于聚合 骨架的核酸分子为RNA分子，更优选地为非编码或miRNA分子。5’磷酸基 团的存在允许所述聚合骨架连接到所述RNA分子的3’末端。
在一种优选的实施方案中，所述多重标记的聚合骨架为具有多个单链区 域的线性树枝状多核苷酸组合物，所述单链区域可与一个或多个标记寡核苷 酸杂交；所述线性树枝状多核苷酸组合物包含以5’-3’方向杂交结合在一起 的第一、第二、和第三多核苷酸单体；每个多核苷酸单体在相互杂交结合之 前，具有第一、第二、和第三单链杂交区域；并且在所述线性树枝状多核苷 酸组合物中，第一多核苷酸单体的第三单链杂交区域与第二多核苷酸单体的 第一单链杂交区域杂交结合，第二多核苷酸单体的第三单链杂交区域与第三 多核苷酸单体的第一单链杂交区域杂交结合，其中第一多核苷酸单体的第一 单链区域能够与核酸序列杂交结合，并且其中所述线性树枝状多核苷酸组合 物中的第二单链杂交区域与包含一个或多个标记分子的一个或多个标记寡 核苷酸杂交结合。
本发明的另一个方面指向产生标记目标miRNA分子的方法，其包含
a)提供具有5’和3’末端的单链miRNA分子；
b)在所述单链miRNA分子的3’末端连接寡核苷酸尾部；
c)提供具有有义链和反义链的部分双链核酸序列，其中所述 有义链包含核酸标记分子，该分子包含一个或多个能够在其3’末端发 射或产生可检测信号的标记分子，所述反义链包含单链3’突出端，其 包含与所述寡核苷酸尾部互补的序列；
d)通过与所述3’突出端序列的互补碱基配对将所述部分双链 核酸序列与所述寡核苷酸尾部退火；以及
e)将所述部分双链核酸序列有义链的5’末端与所述寡核苷酸 尾部的3’末端连接，由此将包含一个或多个能够发射或产生可检测信 号的标记分子的核酸标记分子连接到所述miRNA分子的3’末端，由 此产生标记目标miRNA分子。
在一些实施方案中，所述miRNA分子在总RNA来源中提供，而在其 它实施方案中，所述miRNA分子在富集低分子量RNA分子的RNA来源中 提供。所述寡核苷酸尾部优选地为使用poly(A)聚合酶连接的polydA尾部。 连接优选地使用T4DNA连接酶进行。在优选的实施方案中，所述部分双链 核酸序列包含所述多重标记的聚合骨架和桥接寡核苷酸，更优选地包含上述 线性树枝状多核苷酸组合物。
本发明的另一个方面指向检测固体支持物上miRNA反义探针的方法， 其包含：
a)使固体支持物与标记目标miRNA分子接触，所述固体支持物 上具有包含miRNA分子的互补核苷酸序列的反义探针，所述标记目 标miRNA分子由包含下列步骤的方法产生：
i)提供具有5’和3’末端的单链miRNA分子；
ii)在所述单链miRNA分子的3’末端连接寡核苷酸尾部；
iii)提供具有有义链和反义链的部分双链核酸序列，其中所 述有义链包含核酸标记分子，该分子包含一个或多个能够在其3’ 末端发射或产生可检测信号的标记，所述反义链包含单链3’突出 端，其包含与所述寡核苷酸尾部互补的序列；
iv)通过与所述3’突出端序列的互补碱基配对将所述部分 双链核酸序列与所述寡核苷酸尾部退火；以及
v)将所述部分双链核酸序列有义链的5’末端与所述寡核苷酸 尾部的3’末端连接，由此将包含一个或多个能够发射或产生可检 测信号的标记的核酸标记分子连接到所述miRNA分子的3’末端， 由此产生标记目标miRNA分子；以及
b)将所述固体支持物与所述标记目标miRNA分子温育，其温育 时间和温度足以使所述标记目标miRNA分子与所述miRNA反义探针 杂交；
c)洗涤所述固体支持物以去除未杂交的标记目标mRNA；以及
d)从杂交的标记目标miRNA分子检测信号，由此检测固体支持 物上的miRNA反义探针。
在一些实施方案中，所述固体支持物为平面固体支持物，例如微阵列或 微量滴定板，而在其它实施方案中，所述固体支持物为珠子。所述miRNA 探针可对成熟或前体miRNA序列都有特异性，或者仅对前体miRNA序列 有特异性。
本发明的另一个方面指向试剂盒，其用于生产在miRNA分析中使用的 标记目标miRNA分子，其包含：具有有义链和反义链的部分双链核酸序列， 其中所述有义链包含核酸标记分子，该分子包含一个或多个能够在其3’末端 发射或产生可检测信号的标记，所述反义链包含单链3’突出端，其包含与寡 核苷酸尾部互补的序列；以及使用所述部分双链核酸序列产生标记目标 miRNA分子的使用说明材料。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含至少一种用于在目标miRNA分 子3’末端连接寡核苷酸尾部的酶，其中所述寡核苷酸尾部与所述部分双链核 酸序列的单链3’突出端序列互补；以及至少一种用于在所述目标miRNA分 子3’末端连接所述部分双链核酸序列有义链5’末端的酶。在其它实施方案 中，提供了多种能够发射或产生不同可检测信号的核酸标记分子，以允许进 行双重或多重颜色测定。在优选的实施方案中，所述部分双链核酸序列包含 上述多重标记的聚合骨架和桥接寡核苷酸。在更优选的实施方案中，所述多 重标记的聚合骨架为上述线性树枝状多核苷酸组合物。
附图说明
图1a-d共同描述了根据本发明的方法标记目标miRNA分子和miRNA 探针检测。
图2描述了本发明的优选的核酸标记分子。
详细说明
本发明涉及用于RNA微阵列分析的核酸分子、方法和试剂盒。术语 “RNA分子”、“miRNA分子”、“mRNA分子”、“DNA分子”、“cDNA 分子”、以及“核酸分子”各自意在包括单个分子、单个物种的多个分子、 以及不同物种的多个分子。术语“miRNA分子”还意在包括成熟和前体 miRNA分子。与微阵列术语一致，“目标miRNA”系指要标记的miRNA 或互补cDNA序列，而“miRNA探针”系指直接附于固体支持物的未标记 的有义或反义miRNA序列。术语“核酸标记分子”系指能够连接到miRNA 分子3’末端的任何非天然核苷酸序列，例如DNA树枝状聚合物，并包含一 个或多个能够发射或产生可检测信号的标记分子。
本发明的方法包含在至少一个miRNA分子的3’末端连接核酸标记分 子，该分子包含能够发射或产生可检测信号的标记。然后所得标记miRNA 分子用于检测附于固体支持物的miRNA探针，允许获得miRNA的表达谱。 通过使用适当标记的目标分子和适当设计的探针，可确定成熟和前体 miRNA的表达谱。
本发明的方法完全不同于现有的技术，现有的技术通过荧光团共价连接 直接标记目标miRNA分子，或者随机启动并逆转录目标miRNA分子以产 生标记cDNA分子，两者均缺少检测与miRNA探针杂交后微量目标miRNA 分子必需的灵敏度。本发明的方法也完全不同于基于PCR的标记技术，该 技术可在标记目标分子群体中引入扩增偏差。
本发明的方法使用分子生物学领域的常规技术。公开普通分子生物学方 法的基本文章包括Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual (第3版2001)和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1994)。
本发明的方法使用RNA分子来源。优选地，所述来源富集miRNA分 子。虽然始终提及“miRNA”和“富集”，但是应了解本文公开的方法可用 于标记具有3’末端的任何核酸分子，不论富集与否，包括具有修饰3’末端 的RNA分子，例如在植物和细菌中发现的此类分子。本发明的方法还可扩 展到标记DNA分子，其具有与酶结合的3’末端，该酶在脱氧核糖核苷酸存 在下在3’末端合成多聚尾。能够在脱氧核糖核苷酸存在下合成多聚尾的酶的 一个示例是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。多种方法和商业试剂盒可用于 从总RNA中富集miRNA分子。示例包括miRvanaTM miRNA分离试剂盒 (Ambion，Austin，TX)、PureLinkTM miRNA分离试剂盒(Invitrogen，Carlsbad， CA)、mirPremierTM microRNA分离试剂盒(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO) 和miRNeasy微小试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)，在变性PAGE胶上纯化(参 见，例如Miska等人，Genome Biol.5：R68(2004))、使用合适大小的分子量 截留过滤器(例如YM filter devices，Millipore，Billerica，MA)离 心、以及乙酸钠/乙醇沉淀(参见，例如Wang等人，Nucleic Acids Res.32：1688 (2004))。
miRNA可获自包含miRNA的任何组织或细胞来源，包括任何生物或环 境样品中发现的病毒体、植物、和动物来源。优选地，所述来源为动物组织， 更优选地为哺乳动物组织，最优选地的为人类组织。RNA还可从临床FFPE 样品中纯化，使用RNA提取试剂盒，例如RecoverAllTM总核酸分离试剂盒 (Ambion，Austin Tx)。
RNA可进行扩增过程。RNA扩增试剂盒的示例包括，但不限于， SenseAMP RNA扩增试剂盒(Genisphere，Hatfield，PA)、MessageAmpTMRNA扩增试剂盒(Ambion，Austin，TX)、OvationTM RNA扩增试剂盒 (NuGen Technologies，San Carlos，CA)等等。
参考图1，一单链寡核苷酸尾部连接到单链miRNA分子的3’末端(参 见图1a)。所述寡核苷酸尾部可通过向单链RNA连接核苷酸的任何方式加 入。优选地，所述寡核苷酸尾部使用poly(A)聚合酶(PAP)或其它合适的 酶在合适的缓冲液中在合适的核苷酸存在下连接到单链cDNA。优选地，所 述寡核苷酸尾部为同聚核苷酸尾部(即polyA、polyG、polyC、或polyT)。 优选地，所述寡核苷酸尾部为polyA尾部，通常长度在约3到大于500核苷 酸范围内，优选长度约20到约100核苷酸。当使用PAP时，优选的缓冲液 为Tris-HCl，pH 8.0(或其它合适的缓冲液)，包含镁和锰离子。例如，所 述缓冲液可包含1到100mM Tris-HCl，pH 8.0，1到20mM MgCl2和1到 20mM MnCl2，以及0.01到20mM ATP。加尾反应通常在37℃进行5到 60分钟。
为产生标记目标miRNA分子，包含有义链的部分双链脱氧核酸序列通 过连接反应连接至所述3’寡核苷酸尾部(参见图1b)，所述有义链包含核 酸标记分子，该分子包含一个或多个能够在其3’末端发射或产生可检测信号 的标记。通过所述3’寡核苷酸尾部与所述部分双链脱氧核酸序列反义链3’ 末端突出端序列之间的互补碱基配对可促进上述反应，所述序列包含与所述 寡核苷酸尾部互补的脱氧核苷酸序列。例如，如果所述寡核苷酸尾部为polyA 尾部，所述部分双链脱氧核酸序列的3’突出端将在其3’末端包含脱氧胸苷 序列，通常长度在约3到大于50核苷酸范围内，优选长度约10到约30核 苷酸。对于认为彼此互补的序列，所述3’突出端序列的具体核苷酸序列不需 与所述3’寡核苷酸尾部的具体核苷酸序列完全(即100％)互补，所述3’突 出端序列的长度也不需准确等于所述3’寡核苷酸尾部的长度。本领域技术人 员可认识到，所需要的是所述两种序列之间有足够的互补性，以使所述3’ 突出端可与所述3’寡核苷酸尾部退火，由此正确定位所述miRNA分子3’末 端的捕获序列。
一旦正确定位，所述核酸标记分子通过连接反应连接至所述3’寡核苷酸 尾部。此类突出或“交错”连接反应更加有效，且可在比平端连接反应更高 的温度下进行。另外，使用寡聚脱氧核苷酸尾部允许脱氧核酸标记分子DNA 连接DNA尾部，这比DNA直接连接miRNA更加有效。任何DNA连接酶 可用于所述连接反应。优选地，所述DNA连接酶为T4DNA连接酶。当使 用T4DNA连接酶时，优选的缓冲液为Roche Applied Science，Indianapolis， IN供应的10X连接缓冲液(660mM Tris-HCl，pH 7.5，50mM MgCl，10mM DTT，10mM ATP)的1/10稀释液。优选地通过加入EDTA终止所述反应。
用于所述连接反应的核酸标记分子优选地为多重标记的聚合骨架，其与 多个能够发射或产生可检测信号的标记分子连接。所述骨架还包含一寡核苷 酸延伸序列，其包含连接3’加尾的miRNA分子的5’磷酸基团(参见图1b)。 所述多重标记的聚合骨架可为其上可连接标记分子的任何聚合物，例如蛋白 质、肽、糖类、多糖、脂类、脂肪酸、核酸等等。所述多重标记的聚合骨架 的总分子量优选地为约50到约350kDa。所述聚合骨架优选地包含约2-100 个标记分子，所述标记分子相互间隔以减少或消除猝灭和/或允许接近大的 检测分子(例如链霉亲和素)。本领域技术人员可基于现有文献确定所述标 记分子的适当间隔。例如，美国专利6,762,292、6,072,043、和6,046,038描 述了确定荧光标记分子连接核酸骨架的最优间隔的方法。通常，核酸骨架中 的标记分子间隔至少10nt即可。其它类型骨架中的间隔可相应确定。
图2描述了本发明的优选的多重标记的聚合骨架。所述多重标记的聚合 骨架包含寡核苷酸延伸序列，其具有能够杂交结合核酸序列的5’磷酸基团。 在此实施方案中，所述核酸序列为图2所示的桥接寡核苷酸，其5’部分与所 述聚合骨架的寡核苷酸尾部互补，且其3’部分与miRNA分子的3’寡核苷酸 尾部互补。所述聚合骨架和所述桥接寡核苷酸共同构成标记miRNA分子的 系统。所述寡核苷酸尾部的5’磷酸基团允许所述聚合骨架连接至miRNA分 子。在所述连接反应中，所述桥接寡核苷酸的摩尔质量通常超过所述聚合骨 架的寡核苷酸尾部，优选地摩尔质量超过约1.8-2.6倍。杂交的桥接寡核苷 酸/聚合骨架寡核苷酸尾部共同形成上述部分双链脱氧核酸序列，由此构成 标记miRNA分子的系统。此外，应了解图2所述的序列仅作示例用，可使 用任何能够杂交的序列。
在优选的实施方案中，所述多重标记的聚合骨架为小线性树枝状多核苷 酸组合物，其包含20-100个碱基，更优选地包含300-750个核苷酸碱基， 并包含一个可连接末端和10-15个能够发射或产生可检测信号的标记分子。 如上所述，所述可连接末端具有可连接至加尾miRNA分子的5’磷酸基团。 在一些实施方案中，所述线性树枝状多核苷酸组合物为小3DNATMDendrimer Capture Reagent(Genisphere Inc.，Hatfield，Pa.)。树枝状聚合物 为高度分支的核酸分子，在其表面包含2种类型的单链杂交“臂”用于连接 标记分子和捕获序列。由于单个树枝状聚合物可具有每种类型的多个臂，杂 交时获得的信号大大增强。使用树枝状试剂增强信号描述于Nilsen等人，J. Theor.Biol.187：273(1997)；Stears等人，Physiol.Genomics 3：93(2000)；美 国专利5,175,270、5,484,904、5,487,973、6,072,043、6,110,687、和6,117,631； 以及美国专利公开2002/0051981。使用优化设计的树枝状聚合物允许放置标 记分子以减少或消除猝灭。此外，标记分子中的信号可放大或增强而无需目 标核酸分子自身的偏差引入扩增。
所述线性树枝状多核苷酸组合物可包含通过以5’-3’方向杂交结合在一 起的第一、第二和第三多核苷酸单体，每个多核苷酸单体在相互杂交结合之 前，具有第一、第二和第三单链杂交区域。第一多核苷酸单体的第三单链杂 交区域与第二多核苷酸单体的第一单链杂交区域杂交结合，第二多核苷酸单 体的第三单链杂交区域与第三多核苷酸单体的第一单链杂交区域杂交结合。 所述线性树枝状多核苷酸组合物的第一多核苷酸单体的第一单链区域经设 计用于杂交结合核酸序列。当用于本文描述的标记方法时，所述核酸序列为 图2所示的桥接寡核苷酸序列，用于将所述多重标记的聚合骨架连接至3’ 寡核苷酸加尾的miRNA分子。
用于组装所述线性树枝状多核苷酸组合物的各多核苷酸单体内的各第 二单链杂交区域经设计用于杂交结合一个或多个标记寡核苷酸。所述标记寡 核苷酸包含一个或多个标记分子。优选地，第三多核苷酸单体的第三单链杂 交区域也与一个或多个标记寡核苷酸杂交结合。所述标记的线性树枝状多核 苷酸组合物优选地在组装后使用例如补骨脂素化合物交联。
核酸标记分子上的标记分子可为任何能够发射或产生可检测信号的分 子。此类分子包括直接发射或产生可检测信号的分子，例如放射性分子、荧 光分子、和化学发光分子，以及用于比色测定的酶，例如辣根过氧化物酶、 碱性磷酸酶、和β-半乳糖苷酶。此类分子还包括不直接产生可检测信号，但 结合于产生可检测信号的系统的分子，例如生物素/链霉亲和素和抗原/抗体。 优选地，所述产生信号的分子是直接发射或产生可检测信号的分子，更优选 地是荧光团，最优选地是Cy3或Cy5染料(GE Healthcare，Piscataway，NJ)、 -550或-650染料(Denovo Biolabels，Münster，Germany)，或 者其它合适的染料，例如Alexa FluorTM 555或647染料(Molecular Probes， Eugene，OR)。使用标记分子制备标记寡核苷酸是本领域熟知的。
然后使标记miRNA分子与包含miRNA探针的固体支持物接触(参见 图1c)。当用于本文时，“固体支持物”意在包括任何包含核酸探针的固 体支持物，包括载玻片、芯片、膜、珠子、以及微量滴定板。miRNA探针 连接到固体支持物的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如Babak等 人，RNA 10：1813(2004)；Calin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：11755 (2004)；Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：9740(2004)；Miska等人， Genome Biol.5：R68(2004)；Sioud and，BioTechniques 37：574(2004)； Krichevsky等人，RNA 9：1274(2003))。备选地，平面和珠子形式的miRNA 微阵列都可购自例如Invitrogen，Carlsbad，CA(NCodeTM miRNA Microarray)、Exiqon，Woburn，MA(miRCURYTM miRNA Array)、CombiMatrix， Mukilteo，WA(miRNA CustomArrayTM)、以及Luminex，Austin，TX (FlexmiRTM miRNA Panel)。标记miRNA分子也可用于酶联寡核苷酸吸附试 验(ELOSA)。
对于标记目标miRNA分子，所述固体支持物将包含反义miRNA探针。 所述探针可设计用于检测成熟和前体miRNA序列，或者所述探针可对前体 miRNA序列具有特异性。比较可提供前体和成熟序列的概况。miRNA探针 可使用已知miRNA和前体miRNA序列设计，所述序列公开于例如The miRBase序列数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences)，The Wellcome Trust Sanger Institute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，UK (Griffiths-Jones等人，Nucleic Acids.Res.34：D140(2006)。新miRNA序列也 可用于设计miRNA探针，并可使用本领域技术人员熟知的计算方法(参见， 例如Ambros等人，Curr.Biol.13：807(2003)；Grad等人，Mol.Cell 11；1253 (2003)；Lai等人，Genome Biol.4：R42(2003)；Lim等人，Genes&Dev. 17：991(2003)；Lim等人，Science 299：1540(2003))或miRNA克隆策略(参 见，例如Wang等人，Nucleic Acids Res.32：1688(2004)；Lagos-Quintana等 人，Science 294：853(2001)；Lau等人，Science 294：858(2001)；Lee等人， Science 294：862(2001))鉴定。
所述固体支持物和所述标记miRNA分子在杂交缓冲液中温育，其温育 时间和温度足以使所述标记miRNA分子与所述miRNA探针杂交。合适的 基于阵列的杂交缓冲液包括基于2x SDS的缓冲液(2x SSC，4x Denhardt’s 溶液，1％SDS，0.5M磷酸钠，2mM EDTA，pH 8.0)和使用不含核酸酶的 水稀释到75％的2x增强杂交缓冲液(ExpressHybTM，BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA)。合适的基于珠子的测定缓冲液包括4-4.5M TMAC，5-15％去离子甲酰胺，0.1-2％BSA，0.25-1mg/ml鲑鱼精子DNA。
优选地，所述固体支持物和捕获序列标记的核酸分子在约25-65°，优选 地45-65°温育约0.5-72小时，优选地18-24小时。剩余的未杂交的标记miRNA 分子可通过洗涤去除，在预热的2X SSC、0.2％SDS洗涤缓冲液中，在25-60° C，优选地在50-55℃下洗涤15分钟，在2X SSC中在室温下洗涤10-15，以 及在0.2X SSC中在室温洗涤10-15分钟。然后通常通过扫描分析所述固体 支持物(参见图1d)。基于微阵列的测定可使用合适的仪器分析，例如 4000B微阵列扫描仪，其带有Pro 3.0软件(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)或ScanArrayTM 5000(PerkinElmer，Waltham，MA)。 基于珠子的测定可使用Luminex Corporation(Austin，TX)提供的仪器和软 件以及本领域技术人员熟悉的相似设备分析。
本发明的方法和试剂可方便地以试剂盒形式包装。此类试剂盒可用于多 种研究和诊断应用。例如，本发明的方法和试剂盒可用于易化在不同细胞或 组织中、相同细胞或组织的不同亚群中、相同细胞或组织的不同生理状态、 相同细胞或组织的不同发育阶段、或者相同组织的不同细胞群中一种或多种 miRNA表达的比较分析。此类分析可揭示miRNA表达水平的统计学显著差 异，根据所分析的细胞或组织，该差异可用于促进多种疾病状态的诊断、疾 病进展的预测、以及疾病治疗靶点的鉴定。
根据本发明可制备多种试剂盒。例如，用于生产标记目标miRNA分子 的试剂盒可包括具有有义链和反义链的部分双链核酸序列，其中所述有义链 包含核酸标记分子，该分子包含一个或多个能够发射或产生可检测信号的标 记，以及所述反义链包含单链3’突出端，其包含与寡核苷酸尾部互补的序列； 以及使用所述部分双链核酸序列产生标记目标miRNA分子的使用说明材 料。在优选的实施方案中，所述部分双链核酸序列包含上述多重标记的聚合 骨架和桥接寡核苷酸。在其它优选的实施方案中，所述多重标记的聚合骨架 为上述线性树枝状多核苷酸组合物。
虽然使用说明材料通常包含手写或打印的材料，但并不限于此。任何能 够存储此类使用说明并将其传送到终端用户的媒介都是本发明预期的。此类 媒介包括，但不限于，电子存储媒介(例如磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、 光学媒介(例如CD ROM)等等。此类媒介可包括提供所述使用说明材料的 互联网站点地址。
所述试剂盒还可包括用于生产本发明的标记miRNA分子的一种或多种 下列成分或试剂：RNA酶抑制剂；将寡核苷酸尾部连接到单链RNA分子的 酶(例如poly(A)聚合酶)；将寡核苷酸尾部连接到单链RNA分子的酶(例 如TdT)；逆转录酶；以及将所述部分双链核酸序列连接到所述寡核苷酸尾 部的酶(例如T4DNA连接酶)。所述试剂盒可进一步包括在miRNA测定 中使用所述标记miRNA的成分和试剂以及使用说明材料，包括杂交和洗涤 溶液、温育容器、盖玻片、以及多种信号检测、信号产生、信号增强和信号 保留试剂。另外，所述试剂盒可包括与生产和使用本发明的标记miRNA分 子相容的缓冲液、核苷酸、盐、不含RNA酶的水、容器、小瓶、反应管等 等。所述成分和试剂可在带有合适的存储介质的编号容器中提供。
现在将在下述实施例中描述根据本发明的方法的具体实施方案。所述实 施例仅作说明用，无意以任何方式限制本公开的其余部分。
实施例
实施例1
标记总RNA中的miRNA分子以及与反义miRNA探针杂交 制备线性树枝状多核苷酸核酸标记分子
如上所述制备了三聚体线性树枝状多核苷酸核酸标记分子。所述标记分 子的分子量为165kDa，包含间隔10-15nt的15个荧光团部分，组装后在 UV-A存在下使用三甲沙林交联。所述标记分子包含图2所示的5’磷酸化寡 核苷酸尾部(5′-TTC AGT AAT ATG CC-3′；SEQ ID NO：1)。所述UV照射 制剂使用YM-30微型浓缩器根据销售商(Millipore，Billerica， MA)的说明纯化。
制备包含所述线性树枝状多核苷酸核酸标记分子的连接混合物
42μl所述纯化标记分子(2,380ng/μl)与12.3μl图2所示的桥接寡核 苷酸(904ng/μl)(5′-GGC ATA TTA CTG AAT TTT TTT TTT T-3′；SEQ ID NO：2)和35μl10X连接缓冲液(660mM Tris-HCl，pH 7.5，50mM MgCl，10 mM DTT，10mM ATP；Roche Applied Science，Indianapolis，IN)混合至终体 积210μl。所述桥接寡核苷酸经设计用于杂交结合图2所示的5’磷酸化寡核 苷酸尾部和下述3’poly(A)加尾的miRNA分子，允许所述标记分子和所述加 尾的miRNA分子连接在一起。所述混合物在1升烧杯中准备的0.30L水浴 中加热至60℃持续10分钟。然后将包含所述连接混合物的烧杯冷却到室 温。加入140μl10X连接缓冲液并涡流混合反应管。然后所述混合物存储在 -20℃直至使用。
miRNA分子加尾
1.5μg大鼠脑总RNA和1.5μg大鼠肝总RNA(Ambion，Austin，TX)分 别使用不含核酸酶的水补至10μl。通过加入1.5μl10X反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，10mM MgCl2)、1.5μl 25mM MnCl2、1μl 0.02mM ATP 和1μl poly(A)聚合酶(5U/μl)并在37℃加热15分钟，使所述总RNA进 行poly(A)加尾。
连接miRNA
通过加入4μL所述连接混合物和2μl T4DNA连接酶(2U/μl)并在室 温下温育30分钟，连接所述poly(A)加尾的RNA分子。通过加入2.5μl终 止溶液(0.25M EDTA)终止反应。所述大鼠脑RNA连接到包含-550 标记分子的树枝状分子，所述大鼠肺RNA连接到包含-650标记分子 的树枝状分子。
标记miRNA微阵列杂交
制备微阵列杂交混合物之前，解冻并重悬2X增强杂交缓冲液 (ExpressHybTM缓冲液(BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA)使用不含 核酸酶的水稀释到75％)。所述标记RNA分子与5ul 10％BSA和2X增强 杂交缓冲液混合至终浓度1X。所述杂交混合物应用于NCodeTM微阵列 (Invitrogen，Carlsbad，CA)，使用玻璃盖玻片覆盖，并在52℃温育过夜。 对于单色测定，所选择的杂交混合物中仅包括一种标记miRNA群体，使用 不含核酸酶的水补足剩余体积。
通过在预热至52℃的2X SSC、0.2％SDS洗涤缓冲液中洗涤微阵列去 除盖玻片。该微阵列依次在52℃在预热的2X SSC、0.2％SDS洗涤缓冲液 中洗涤15分钟，在室温下在2X SSC中洗涤10-15分钟，和在室温下在0.2X SSC中洗涤10-15分钟。将该微阵列转移至干燥的50mL离心管，定位载玻 片使任何粘贴的条形码或标签在管下方。包含微阵列的管立即不加管盖以 800-1000RPM离心以干燥该微阵列。从管中移除微阵列，注意不要接触微 阵列表面。使用带有Pro 3.0软件的4000B微阵列扫描仪 (Molecular Devices，Sunnyvale，CA)扫描阵列，由此产生原始样品中miRNA 序列的表达谱。比较脑和肝的表达谱以建立多种miRNA的差异表达谱。观 察到miR122在肝中以优势存在，miR124a和miR9在脑中以优势存在。miR16 和miRlet7a-f，以及其它miRNA在脑和肝中都表达，但是显示组织特异性 的表达谱。
实施例2
标记富集RNA中的miRNA分子以及与反义miRNA探针杂交
按照实施例1的步骤，除了在微阵列杂交之前富集大鼠脑和大鼠肝的总 RNA中的低分子量RNA。1.5μg大鼠脑和大鼠肝总RNA分别用10mM Tris， pH 8.0稀释到100μl，加热到80℃持续3分钟，在冰上冷却。对每份RNA 样品，通过加入50μl10mM Tris，pH 8.0并以13,000RPM离心3分钟预先 湿润YM-100微型浓缩器(Millipore，Billerica，MA)。柱子置于 新收集管，各加入100μl样品并以13,000RPM离心7分钟。包含低分子量 RNA分子的各个流出(～95μl)用YM-3微型浓缩器(Millipore， Billerica，MA)通过以13,000RPM离心30分钟浓缩。然后向每份样品池加 入5μl10mM Tris-HCl，pH 8.0，并通过轻弹柱壁轻柔混合。然后每份样品池 倒置于新收集管并以13,000RPM离心3分钟以收集浓缩的富集RNA(回收 ～5-10μl)。然后每份富集RNA样品使用不含核酸酶的水补至10μl。
所富集的RNA分子如上所述进行poly(A)加尾、连接、并与NCodeTM微 阵列杂交。杂交之后，如上所述洗涤并扫描阵列，由此产生原始样品中 miRNA序列的表达谱。当比较来自实施例1(总RNA log2(肝/脑))和实 施例2(富集RNA log2(肝/脑))的数据时，观察到Pearson相关系数为 0.933。
实施例3
ELOSA
平板包被
通过每孔加入100μl 1XPBS中的1μg/mL人miR122反义DNA寡核苷 酸(5′-CAA ACA CCA TTG TCA CAC TCC A-3′；SEQ ID NO：3)包被(Corning，Lowell，MA)微量滴定板。使用微孔板按压密封盖(PerkinElmer， Waltham，MA)盖板并在室温下温育过夜。然后使用1X PBS，0.05％Tween-20 洗板2次并吸干。
板封闭和miRNA标记
每孔加入200μl 1XPBS中的4％BSA。盖板并在室温下温育1-2小时。 在板封闭温育时间内，标记总RNA和富集RNA中的miRNA分子。如上述 实施例2所述，使用YM-100微型浓缩器(Millipore，Billerica，MA) 从1μg、0.75μg、0.5μg、和0.25μg大鼠肝总RNA(Ambion，Austin，TX) 中富集低分子量RNA，然后使用YM-3微型浓缩器(Millipore， Billerica，MA)浓缩。所述富集的RNA样品以及1μg、0.75μg、0.5μg、和 0.25μg大鼠肝总RNA如上述实施例1进行poly(A)加尾。通过加入4μl连 接混合物和2μl T4DNA连接酶(2U/μl)并在室温温育30分钟连接所述加 尾RNA分子。所述连接混合物与实施例1中的连接混合物相似，除了所述 线性树枝状多核苷酸核酸标记分子包含生物素部分而不是荧光团部分。通过 加入2.5μl终止溶液(0.25M EDTA)终止反应以产生23.5μl生物素结合的 RNA。封闭完成后，使用1X PBS，0.05％Tween-20洗板2次并吸干。
样品杂交
向每份23.5μl生物素结合的RNA样品中加入19μl TMAC溶液(4.5M TMAC，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、75mM Tris，pH 8、0.15％肌氨酰 (Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、6mM EDTA(Ambion，Austin，TX)、26 μl去离子甲酰胺(EMD，Gibbstown，NJ)、5μl10％BSA、和1.5μl不含核 酸酶的水至终体积75μl。每份样品轻柔混合、离心、并应用于已包被封闭 的孔。样品在板中在室温下杂交3-4小时。杂交之后，先用预热至52℃的 2X SSC，0.2％SDS洗涤缓冲液洗板2次，再用2X SSC在室温下洗板2次， 再用0.2X SSC在室温下洗板2次。
链霉亲和素-HRP杂交
链霉亲和素-HRP(SA-HRP，R&D Systems，Minneapolis，MN)根据生产 商建议使用1X PBS中的4％BSA(Equitech-Bio，Kerrville，TX)稀释。每孔 加入50μl稀释的SA-HRP，板在室温下轻摇温育1小时。使用1X PBS，0.05％ Tween-20洗板2-4次并吸干。
信号产生
每孔加入100μl TMB底物(Pierce，Rockford，IL)，该板在室温下温育 1-15分钟。每孔加入100μl BioSourceTM终止缓冲液(Invitrogen，Carlsbad， CA)。在Victor3Multilabel Plate Reader(PerkinElmer，Waltham，MA)上在 450nm读取吸光度。对于富集RNA和总RNA，都观察到输入RNA和观察 信号之间的线性关系，相关系数分别等于0.985和0.973。无论作为富集 miRNA或总RNA，miR122的检测限确定为低于0.25μg总RNA。
实施例4
miRNA分子的Luminex Bead检测
来自大鼠脑和肝的总RNA样品(Ambion，Austin，TX)如上述实施例3 所述进行poly(A)加尾并连接生物素标记的树枝状多核苷酸核酸标记分子。 包含不同数量的两种荧光染料的多种Luminex品牌羧化微球制剂(Luminex， Austin，TX)使用Luminex程序共价结合代表所选成熟大鼠miRNA序列 (miRBase Sequence Database；http://microrna.sanger.ac.uk/sequences)的多种 胺化22具体反义miRNA探针(IDT technologies)，所述两种荧光染料能够 通过所述两种荧光染料的比例区分不同微球类型。对于设计用于同时检测多 种miRNA特异性的多重检测方法，向包含10％甲酰胺、4.5M TMAC、0.1％ BSA和25ng/μl鲑鱼精子DNA的33μl缓冲液中的多种不同Luminex微球 类型加入17μl连接RNA样品。微球-RNA混合物在500μl聚丙烯管中在 47℃以300RPM水平搅拌温育过夜。微球转移至过滤微孔板，并使用预热 至56℃的2X SSC，20％甲酰胺通过真空过滤洗涤，然后在室温下用2X SSC、 0.2X SSC和1X PBS洗涤。向每份微球混合物加入1X PBS中的100μl链霉 亲和素-藻红蛋白结合物(Invitrogen，Carlsbad，CA)(2ng/μl)并在37℃ 以300RPM搅拌温育30分钟。使用1X PBS洗涤微球3次，重悬于125μl1X PBS，并根据生产商建议在Luminex 100IS系统上分析。特异性miRNA探 针的平均荧光强度(MFI)值超过本底值2倍表明在连接RNA制剂中特异 性检测到miRNA分子。脑和肝的miRNA表达谱与实施例1和2中miRNA 阵列上观察到的表达谱比较。在Luminex平台上试验的所有miRNA在不同 平台之间观察到相似的肝/脑表达谱。
实施例5
用于直接标记与反义miRNA探针杂交的目标miRNA分子的试剂盒
使用下列成分组成用于标记目标miRNA分子生产和微阵列杂交的试剂 盒：
-550和650连接混合物(250ng/μl线性树枝状多核苷 酸组合物和31.7ng/μl桥接寡核苷酸)(Genisphere，Hatfield，PA)；
10X反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，10mM MgCl2)；
MnCl2(25mM)；
ATP混合物(10mM)；
Poly(A)聚合酶(5U/μl)；
2X基于SDS的杂交缓冲液(2X SSC，4x Denhardt′s溶液，1％ SDS，0.5M磷酸钠，2mM EDTA，pH 8.0)；
2X增强杂交缓冲液(ExpressHybTM缓冲液(BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA)使用不含核酸酶的水预先稀释到75％)；
T4DNA连接酶(2U/μl)；以及
不含核酸酶的水。
所述成分置于编号的小瓶内并置于容器中，所述容器中带有使用所述试 剂盒成分进行标记目标miRNA分子生产和微阵列杂交的印刷说明书。
本说明书中引用的所有出版物，包括专利出版物和非专利出版物，都表 明本发明所属领域技术人员的技术水平。所有这些出版物通过引用完全结合 到本文中，其范围与每个单独出版物特定并单独注明通过引用结合相同。
尽管本发明在此已参考具体实施方案描述，但应了解这些实施方案仅为 说明本发明的原理和应用。因此应了解可对所述说明性实施方案进行多种修 改，并且可设计其它方案，而不背离如下述权利要求书确定的本发明的精神 和范围。