用于核酸分子检测的方法、试剂和试剂盒.pdf

1、(10)授权公告号 CN 102007224 B (45)授权公告日 2013.10.30 CN 102007224 B *CN102007224B* (21)申请号 200980113709.X (22)申请日 2009.02.12 12/031,165 2008.02.14 US C12Q 1/68(2006.01) C07H 21/04(2006.01) (73)专利权人 吉尼斯菲尔有限责任公司 地址 美国宾夕法尼亚州 (72)发明人 RC格茨 J卡杜欣 J鲍尔斯 (74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公 司 72001 代理人 刘辛 郭文洁 US 2006094025 A1,2

2、006.05.04, US 5538872 A,1996.07.23, US 2006160098 A1,2006.07.20, 文思远等 ,1. 应用多重标记引物增强寡核苷 酸芯片的荧光信号强度 ( 英文 ).生物化学与生 物物理进展 .2005,( 第 08 期 ), (54) 发明名称 用于核酸分子检测的方法、 试剂和试剂盒 (57) 摘要 提供了生产并用于标记核酸分子检测法的方 法、 试剂和试剂盒， 其中所述核酸分子的 3 末端 直接连接标记分子。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2010.10.14 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2009/03391

3、7 2009.02.12 (87)PCT申请的公布数据 WO2009/102866 EN 2009.08.20 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李康琦 权利要求书 3 页 说明书 12 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书3页 说明书12页 序列表2页 附图2页 (10)授权公告号 CN 102007224 B CN 102007224 B *CN102007224B* 1/3 页 2 1. 一种多重标记的聚合骨架， 其与多个能够发射或产生可检测信号的标记分子连接， 其中所述多重标记的聚合骨架包含寡核苷酸延伸序列

4、， 所述延伸序列包含 5 磷酸基团并能 够与核酸序列杂交结合， 其中所述多重标记的聚合骨架为具有多个单链区域的线性树枝状 多核苷酸组合物， 所述多个单链区域与一个或多个标记寡核苷酸杂交， 所述树枝状多核苷 酸组合物包含以 5 -3 方向杂交结合在一起的第一、 第二和第三多核苷酸单体。 2. 根据权利要求 1 所述的多重标记的聚合骨架， 其总分子量约 50 到约 350kDa。 3. 根据权利要求 1 所述的多重标记的聚合骨架， 其中所述核酸序列为桥接寡核苷酸， 且其中所述延伸尾部与所述桥接寡核苷酸杂交结合。 4. 根据权利要求 3 所述的多重标记的聚合骨架， 其中所述桥接寡核苷酸能够与分离的

5、和完全不同于所述聚合骨架的核酸分子杂交结合。 5. 根据权利要求 4 所述的多重标记的聚合骨架， 其中所述分离的和完全不同于所述聚 合骨架的核酸分子为 poly(A) 加尾的 RNA 分子。 6. 根据权利要求 1 所述的多重标记的聚合骨架， 其中每个多核苷酸单体在相互杂交结 合之前， 具有第一、 第二和第三单链杂交区域 ； 并且在所述线性树枝状多核苷酸组合物中， 第一多核苷酸单体的第三单链杂交区域与第二多核苷酸单体的第一单链杂交区域杂交结 合， 第二多核苷酸单体的第三单链杂交区域与第三多核苷酸单体的第一单链杂交区域杂交 结合， 其中第一多核苷酸单体的第一单链区域能够与该核酸序列杂交结合， 并

6、且其中所述 线性树枝状多核苷酸组合物中的第二单链杂交区域与包含一个或多个标记分子的一个或 多个标记寡核苷酸杂交结合。 7. 一种产生标记目标 RNA 分子的方法， 其包含 a) 提供具有 5 和 3 末端的单链 RNA 分子 ； b) 在所述单链 RNA 分子的 3 末端上连接寡核苷酸尾部 ； c)提供与桥接寡核苷酸杂交的权利要求1所述的多重标记的聚合骨架， 其5 部分与延 伸序列互补， 并且 3 部分与单链 RNA 分子的 3 寡核苷酸尾部互补 ； d) 通过互补碱基配对将与桥接寡核苷酸杂交的多重标记的聚合骨架与所述寡核苷酸 尾部退火 ； 以及 e) 将所述延伸序列的 5 末端与所述寡核苷酸

7、尾部的 3 末端连接， 由此将所述多重标 记的聚合骨架连接到所述 RNA 分子的 3 末端， 由此产生标记目标 RNA 分子。 8. 根据权利要求 7 所述的方法， 其中所述单链 RNA 分子为 miRNA 分子。 9. 根据权利要求 8 所述的方法， 其中所述多重标记的聚合骨架总分子量约 50 到约 350kDa。 10. 根据权利要求 7 所述的方法， 其中每个多核苷酸单体在相互杂交结合之前， 具有第 一、 第二和第三单链杂交区域 ； 并且在所述线性树枝状多核苷酸组合物中， 第一多核苷酸单 体的第三单链杂交区域与第二多核苷酸单体的第一单链杂交区域杂交结合， 第二多核苷酸 单体的第三单链杂交

8、区域与第三多核苷酸单体的第一单链杂交区域杂交结合， 其中第一多 核苷酸单体的第一单链区域能够与所述桥接寡核苷酸杂交结合， 并且其中所述线性树枝状 多核苷酸组合物中的第二单链杂交区域与包含一个或多个标记分子的一个或多个标记寡 核苷酸杂交结合。 11. 根据权利要求 7 所述的方法， 其中所述桥接寡核苷酸的摩尔质量超过所述聚合骨 权 利 要 求 书 CN 102007224 B 2 2/3 页 3 架的寡核苷酸延伸约 1.8 到 2.6 倍。 12. 一种检测固体支持物上 RNA 反义探针的方法， 其包含 ： a) 使固体支持物与根据权利要求 7 所述的方法生产的标记目标 RNA 分子接触， 所述

9、固 体支持物上具有包含标记目标 RNA 分子互补核苷酸序列的反义探针 ； b) 将所述固体支持物与所述标记目标 RNA 分子温育， 其温育时间和温度足以使所述标 记目标 RNA 分子与所述 RNA 反义探针杂交 ； c) 洗涤所述固体支持物以去除未杂交的标记目标 mRNA ； 以及 d) 从杂交的标记目标 RNA 分子检测信号， 由此检测固体支持物上的 RNA 反义探针。 13. 根据权利要求 12 所述的方法， 其中所述标记目标 RNA 分子为 miRNA 分子。 14. 根据权利要求 12 所述的方法， 其中所述固体支持物为平面固体支持物或珠子。 15. 一种用于产生在 RNA 分析中使用

10、的标记目标 RNA 分子的试剂盒， 其包含 ： 与桥接寡 核苷酸杂交的权利要求 1 所述的多重标记的聚合骨架 ； 以及使用所述与桥接寡核苷酸杂交 的多重标记的聚合骨架产生标记目标 RNA 分子的使用说明材料。 16.根据权利要求15所述的试剂盒， 其中所述多重标记的聚合骨架总分子量约50到约 350kDa。 17. 根据权利要求 16 所述的试剂盒， 其中每个多核苷酸单体在相互杂交结合之前， 具 有第一、 第二和第三单链杂交区域 ； 并且在所述线性树枝状多核苷酸组合物中， 第一多核苷 酸单体的第三单链杂交区域与第二多核苷酸单体的第一单链杂交区域杂交结合， 第二多核 苷酸单体的第三单链杂交区域与

11、第三多核苷酸单体的第一单链杂交区域杂交结合， 其中第 一多核苷酸单体的第一单链区域与所述桥接寡核苷酸杂交结合， 并且其中所述线性树枝状 多核苷酸组合物中的第二单链杂交区域与包含一个或多个标记分子的一个或多个标记寡 核苷酸杂交结合。 18. 根据权利要求 17 所述的试剂盒， 其进一步包含至少一种用于在目标 RNA 分子 3 末 端连接寡核苷酸尾部的酶， 其中所述寡核苷酸尾部与所述桥接寡核苷酸的 3 末端互补 ； 以 及至少一种用于在所述目标 RNA 分子 3 末端连接所述第一多核苷酸单体的 5 末端的酶。 19. 一种产生标记目标 DNA 分子的方法， 其包含 a) 提供具有 5 和 3 末端

12、的单链 DNA 分子 ； b) 在所述单链 DNA 分子的 3 末端连接寡核苷酸尾部 ； c)提供与桥接寡核苷酸杂交的权利要求1所述的多重标记的聚合骨架， 其5 部分与延 伸序列互补， 并且 3 部分与单链 DNA 分子的 3 寡核苷酸尾部互补 ； d) 通过互补碱基配对将所述与桥接寡核苷酸杂交的多重标记的聚合骨架与所述寡核 苷酸尾部退火 ； 以及 e) 将所述延伸序列的 5 末端与所述寡核苷酸尾部的 3 末端连接， 由此将多重标记的 聚合骨架连接到所述 DNA 分子的 3 末端， 由此产生标记目标 DNA 分子。 20. 一种用于产生在 DNA 分析中使用的标记目标 DNA 分子的试剂盒，

13、其包含 ： 与桥接寡 核苷酸杂交的权利要求 6 所述的多重标记的聚合骨架 ； 以及使用所述与桥接寡核苷酸杂交 的多重标记的聚合骨架产生标记目标 DNA 分子的使用说明材料。 21. 根据权利要求 20 所述的试剂盒， 进一步包含至少一种用于在目标 DNA 分子 3 末端 连接寡核苷酸尾部的酶， 其中所述寡核苷酸尾部与所述桥接寡核苷酸的 3 末端互补 ； 以及 权 利 要 求 书 CN 102007224 B 3 3/3 页 4 至少一种用于在所述目标 DNA 分子 3 末端连接所述第一多核苷酸单体的 5 末端的酶。 权 利 要 求 书 CN 102007224 B 4 1/12 页 5 用于核

14、酸分子检测的方法、 试剂和试剂盒 0001 序列表 0002 计算机可读形式的序列表其全部内容通过引用结合到本文中。 背景技术 0003 最近， 一类非编码小 RNA， 称为 microRNA(miRNA)， 已被鉴定作用于植物和动物基 因表达的转录后调控(Carrington和Ambrose， Science301 ： 336(2003)。 最初在C.elegans 中鉴定， miRNA 通过与其目标 mRNA 的 3 非翻译区 (UTR) 或编码序列的互补位点碱基配对 并抑制其翻译而发挥作用 (Wang 等人， Nucleic.Acids Res.32 ： 1688(2004)。 0004

15、 虽然成熟miRNA长度仅22核苷酸(nt)， 但其通过Dicer复合物的作用源于70 聚体前体(pre-miRNA)序列的发夹区(Lee等人， EMBO J.21 ： 4663(2002)。 然后成熟miRNA 合并入miRNP， 即介导miRNA对基因调控作用的核糖核蛋白复合物(Mourelatos等人， Genes Dev.16 ： 720(2002)。 0005 生物信息学研究预测蠕虫和苍蝇基因组编码 100miRNA， 脊椎动物基因组编码 250miRNA(Lai 等人， Genome Biol.4 ： R42(2003) ； Lim 等人， Genes Dev.17 ： 991(2

16、003) ； Lim 等人， Science 299 ： 1540(2003)。这相当于每种基因组中预测编码蛋白基因数量的 0.5-1， 表明了 miRNA 作为一类调控基因产物的重要性 (Brennecke 和 Cohen， Genome Biol.4 ： 228(2003)。 0006 miRNA 已涉及多种生物学过程， 包括植物的花和叶发育、 蠕虫的幼虫发育、 苍蝇 的细胞凋亡和脂肪代谢、 以及哺乳动物的造血细胞分化和神经发育 (Bartel， Cell 116 ： 281(2004)。另外， 很多 miRNA 基因定位于与癌症相关的人类染色体区域 ( 例如脆性位 点、 断裂点、 杂合性

17、丢失区域、 扩增区域 )(Calin 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101 ： 2999(2004)。多种 miRNA 也已显示在体内与脆性 X 智力低下蛋白 (FMRP) 相互作用 (Jin 等人， Nat.Neurosci.7 ： 113(2004)， 提示这些微小 RNA 在人类健康和疾病中的作用。 0007 由于不同的细胞类型和疾病状态与某些 miRNA 的表达相关， 获得 miRNA 的时间和 空间表达谱是重要的。 已使用Northern杂交确定miRNA的表达水平(参见， 例如Sempere等 人， Genome Biol.5 ： R13(2004) ； A

18、ravin等人， Dev.Cell 5 ： 337(2003) ； Grad等人， Mol.Cell 11 ： 1253(2003) ； Lim 等人， Genes&Dev.17 ： 991(2003)， 但是该方法对于高通量分析工作量 太大。 已使用基于PCR的方法监测miRNA的表达， 但是这些方法也需要使用昂贵的基因特异 性引物 ( 参见， 例如 Schmittgen 等人， Nucleic Acids Res.32 ： e43(2004)， 或者低效的平 末端连接以将引物结合连接子与 miRNA 分子连接 ( 参见， 例如 Miska 等人， Genome Biol.5 ： R68(2

19、004) ； Grad 等人， Mol.Cell11 ： 1253(2003) ； Lim 等人， Genes&Dev.17 ： 991(2003)。另 外， PCR 可在扩增目标 miRNA 分子群体中引入显著偏差。 0008 最近已开发了高通量微阵列在多种组织和细胞类型中鉴定miRNA的表达模式(参 见， 例如 Babak 等人， RNA 10 ： 1813(2004) ； Calin 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101 ： 11755(2004) ； Liu 等 人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA101 ： 9740(2004) ； Miska

20、等 人， Genome Biol.5 ： R68(2004) ； Sioud andBioTechniques 37 ： 574(2004) ； Krichevsky 等人， 说 明 书 CN 102007224 B 5 2/12 页 6 RNA 9 ： 1274(2003)。 使用微阵列检测miRNA表达具有多种优势， 包括在单一时间点测定同 一样品中多个基因表达的能力， 仅需要少量 RNA， 以及同时鉴定前体和成熟 miRNA 分子表达 的潜力。 0009 但是， 由于成熟 miRNA 长度仅 22nt， 且在任何特定组织中含量极为有限， 这些小 RNA对微阵列标记和检测提出了挑战(Sio

21、ud andBioTechniques 37 ： 574(2004)。 例如， 可使用荧光团共价连接在微阵列分析中直接标记 miRNA 分子 ( 参见， 例如 Babak 等 人， RNA 10 ： 1813(2004) ； MICROMAX ASAP miRNA Chemical Labeling Kit， Perkin Elmer， Waltham， MA ； LabelArray Labeling Kit， Mirus Bio Corp.， Madison， WI)， 但是该 方法缺少检测微量目标 miRNA 分子的灵敏度。直接标记还可导致随机加入的荧光团的分子 间猝灭， 导致进一步降低

22、灵敏度。已使用 miRNA 分子的随机引物逆转录生产用于微阵列分 析的标记cDNA分子(参见， 例如Sioud and， BioTechniques 37 ： 574(2004) ； Liu等 人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA101 ： 9740(2004)， 但是该方法不能产生原始全长 miRNA 群体 的准确表示。 0010 已开发了显著提高 miRNA 分析准确性和灵敏度的新标记方法 ( 参见， 例如同时待 审的美国专利申请 No.10/979,052， 公布为美国专利公布 No.2006/0094025)。但是， 这些方 法使用间接标记连接并需要多个杂交步骤以在测定中

23、显现信号。此外， 这些方法受制于大 捕获试剂分子， 其需要独立杂交步骤以改善结合动力学。 虽然提供良好的结果， 但是这些方 法不易适用于高通量分析且需要非常多的时间得到预期结果。因此， 急需快速、 灵敏、 且有 效的 miRNA 分子标记和检测方法用于微阵列和高通量分析。 发明内容 0011 申请者已发明了标记目标 miRNA 分子的方法， 其中一核酸标记分子直接连接到 miRNA 分子的 3 末端。申请者已发现， 通过使用优化的核酸标记分子无需 PCR 即可减少猝 灭并增强信号强度， 由此得到用于 miRNA 分析尤其是高通量分析的改良方法和试剂。所述 优化的核酸标记分子优选地为多重标记的聚

24、合骨架， 其与多个能够发射或产生可检测信号 的标记分子连接。所述多重标记的聚合骨架可为其可连接标记分子的任何聚合物， 例如蛋 白质、 肽、 糖类、 多糖、 脂类、 脂肪酸、 核酸等等。在优选的实施方案中， 所述多重标记的聚合 骨架包含一种小 DNA 树枝状聚合物， 其包含 20-1000 个碱基， 更优选地 300-750 个碱基的核 酸， 并包含一个可连接末端和 10-15 个能够发射或产生可检测信号的标记分子。所述可连 接末端具有可连接至 miRNA 分子 3 末端的 5 磷酸基团。所述核酸标记分子尺寸足够小以 允许在多种检测平台上， 例如微阵列和基于珠子的测定， 与 miRNA 分子快速

25、、 有效杂交。 0012 因此， 本发明的一个方面指向多重标记的聚合骨架， 其上连接多种能够发射或产 生可检测信号的标记分子， 其中所述多重标记的聚合骨架包含寡核苷酸尾部， 其包含能够 杂交结合核酸序列的 5 磷酸基团。在优选的实施方案中， 所述多重标记的聚合骨架总分子 量约 50 到约 350kDa。在某些实施方案中， 所述标记分子包含一个或多个荧光团部分。在其 它实施方案中， 所述标记分子包含一个或多个生物素部分。 0013 在优选的实施方案中， 延伸序列能够结合的核酸序列为桥接寡核苷酸， 也能够与 分离的和不同于所述聚合骨架的核酸分子杂交。 所述聚合骨架和桥接寡核苷酸共同构成核 酸分子标

26、记系统。优选地， 所述分离的和不同于聚合骨架的核酸分子为 RNA 分子， 更优选地 说 明 书 CN 102007224 B 6 3/12 页 7 为非编码或 miRNA 分子。5 磷酸基团的存在允许所述聚合骨架连接到所述 RNA 分子的 3 末端。 0014 在一种优选的实施方案中， 所述多重标记的聚合骨架为具有多个单链区域的线性 树枝状多核苷酸组合物， 所述单链区域可与一个或多个标记寡核苷酸杂交 ； 所述线性树枝 状多核苷酸组合物包含以 5 -3 方向杂交结合在一起的第一、 第二、 和第三多核苷酸单体 ； 每个多核苷酸单体在相互杂交结合之前， 具有第一、 第二、 和第三单链杂交区域 ； 并

27、且在所 述线性树枝状多核苷酸组合物中， 第一多核苷酸单体的第三单链杂交区域与第二多核苷酸 单体的第一单链杂交区域杂交结合， 第二多核苷酸单体的第三单链杂交区域与第三多核苷 酸单体的第一单链杂交区域杂交结合， 其中第一多核苷酸单体的第一单链区域能够与核酸 序列杂交结合， 并且其中所述线性树枝状多核苷酸组合物中的第二单链杂交区域与包含一 个或多个标记分子的一个或多个标记寡核苷酸杂交结合。 0015 本发明的另一个方面指向产生标记目标 miRNA 分子的方法， 其包含 0016 a) 提供具有 5 和 3 末端的单链 miRNA 分子 ； 0017 b) 在所述单链 miRNA 分子的 3 末端连接

28、寡核苷酸尾部 ； 0018 c) 提供具有有义链和反义链的部分双链核酸序列， 其中所述有义链包含核酸标记 分子， 该分子包含一个或多个能够在其 3 末端发射或产生可检测信号的标记分子， 所述反 义链包含单链 3 突出端， 其包含与所述寡核苷酸尾部互补的序列 ； 0019 d) 通过与所述 3 突出端序列的互补碱基配对将所述部分双链核酸序列与所述寡 核苷酸尾部退火 ； 以及 0020 e) 将所述部分双链核酸序列有义链的 5 末端与所述寡核苷酸尾部的 3 末端连 接， 由此将包含一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记分子的核酸标记分子连接到 所述 miRNA 分子的 3 末端， 由此产生标记目

29、标 miRNA 分子。 0021 在一些实施方案中， 所述 miRNA 分子在总 RNA 来源中提供， 而在其它实施方案中， 所述 miRNA 分子在富集低分子量 RNA 分子的 RNA 来源中提供。所述寡核苷酸尾部优选地为 使用 poly(A) 聚合酶连接的 polydA 尾部。连接优选地使用 T4DNA 连接酶进行。在优选的 实施方案中， 所述部分双链核酸序列包含所述多重标记的聚合骨架和桥接寡核苷酸， 更优 选地包含上述线性树枝状多核苷酸组合物。 0022 本发明的另一个方面指向检测固体支持物上 miRNA 反义探针的方法， 其包含 ： 0023 a) 使固体支持物与标记目标 miRNA

30、分子接触， 所述固体支持物上具有包含 miRNA 分子的互补核苷酸序列的反义探针， 所述标记目标 miRNA 分子由包含下列步骤的方法产 生 ： 0024 i) 提供具有 5 和 3 末端的单链 miRNA 分子 ； 0025 ii) 在所述单链 miRNA 分子的 3 末端连接寡核苷酸尾部 ； 0026 iii) 提供具有有义链和反义链的部分双链核酸序列， 其中所述有义链包含核酸标 记分子， 该分子包含一个或多个能够在其 3 末端发射或产生可检测信号的标记， 所述反义 链包含单链 3 突出端， 其包含与所述寡核苷酸尾部互补的序列 ； 0027 iv) 通过与所述 3 突出端序列的互补碱基配对

31、将所述部分双链核酸序列与所述 寡核苷酸尾部退火 ； 以及 0028 v) 将所述部分双链核酸序列有义链的 5 末端与所述寡核苷酸尾部的 3 末端连 说 明 书 CN 102007224 B 7 4/12 页 8 接， 由此将包含一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记的核酸标记分子连接到所述 miRNA 分子的 3 末端， 由此产生标记目标 miRNA 分子 ； 以及 0029 b) 将所述固体支持物与所述标记目标 miRNA 分子温育， 其温育时间和温度足以使 所述标记目标 miRNA 分子与所述 miRNA 反义探针杂交 ； 0030 c) 洗涤所述固体支持物以去除未杂交的标记目标 mRN

32、A ； 以及 0031 d) 从杂交的标记目标 miRNA 分子检测信号， 由此检测固体支持物上的 miRNA 反义 探针。 0032 在一些实施方案中， 所述固体支持物为平面固体支持物， 例如微阵列或微量滴定 板， 而在其它实施方案中， 所述固体支持物为珠子。所述 miRNA 探针可对成熟或前体 miRNA 序列都有特异性， 或者仅对前体 miRNA 序列有特异性。 0033 本发明的另一个方面指向试剂盒， 其用于生产在 miRNA 分析中使用的标记目标 miRNA 分子， 其包含 ： 具有有义链和反义链的部分双链核酸序列， 其中所述有义链包含核酸 标记分子， 该分子包含一个或多个能够在其

33、3 末端发射或产生可检测信号的标记， 所述反 义链包含单链 3 突出端， 其包含与寡核苷酸尾部互补的序列 ； 以及使用所述部分双链核酸 序列产生标记目标 miRNA 分子的使用说明材料。 0034 在一些实施方案中， 所述试剂盒还包含至少一种用于在目标 miRNA 分子 3 末端连 接寡核苷酸尾部的酶， 其中所述寡核苷酸尾部与所述部分双链核酸序列的单链 3 突出端序 列互补 ； 以及至少一种用于在所述目标 miRNA 分子 3 末端连接所述部分双链核酸序列有义 链 5 末端的酶。在其它实施方案中， 提供了多种能够发射或产生不同可检测信号的核酸标 记分子， 以允许进行双重或多重颜色测定。 在优选

34、的实施方案中， 所述部分双链核酸序列包 含上述多重标记的聚合骨架和桥接寡核苷酸。在更优选的实施方案中， 所述多重标记的聚 合骨架为上述线性树枝状多核苷酸组合物。 附图说明 0035 图 1a-d 共同描述了根据本发明的方法标记目标 miRNA 分子和 miRNA 探针检测。 0036 图 2 描述了本发明的优选的核酸标记分子。 0037 详细说明 0038 本发明涉及用于 RNA 微阵列分析的核酸分子、 方法和试剂盒。术语 “RNA 分子” 、 “miRNA 分子” 、“mRNA 分子” 、“DNA 分子” 、“cDNA 分子” 、 以及 “核酸分子” 各自意在包括单个 分子、 单个物种的多个

35、分子、 以及不同物种的多个分子。术语 “miRNA 分子” 还意在包括成 熟和前体 miRNA 分子。与微阵列术语一致，“目标 miRNA” 系指要标记的 miRNA 或互补 cDNA 序列， 而 “miRNA 探针” 系指直接附于固体支持物的未标记的有义或反义 miRNA 序列。术语 “核酸标记分子” 系指能够连接到 miRNA 分子 3 末端的任何非天然核苷酸序列， 例如 DNA 树 枝状聚合物， 并包含一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记分子。 0039 本发明的方法包含在至少一个 miRNA 分子的 3 末端连接核酸标记分子， 该分子包 含能够发射或产生可检测信号的标记。然后所得标

36、记 miRNA 分子用于检测附于固体支持物 的 miRNA 探针， 允许获得 miRNA 的表达谱。通过使用适当标记的目标分子和适当设计的探 针， 可确定成熟和前体 miRNA 的表达谱。 0040 本发明的方法完全不同于现有的技术， 现有的技术通过荧光团共价连接直接标记 说 明 书 CN 102007224 B 8 5/12 页 9 目标 miRNA 分子， 或者随机启动并逆转录目标 miRNA 分子以产生标记 cDNA 分子， 两者均缺 少检测与 miRNA 探针杂交后微量目标 miRNA 分子必需的灵敏度。本发明的方法也完全不同 于基于 PCR 的标记技术， 该技术可在标记目标分子群体中

37、引入扩增偏差。 0041 本发明的方法使用分子生物学领域的常规技术。公开普通分子生物学方法的基 本文章包括 Sambrook 等人， Molecular Cloning， A Laboratory Manual( 第 3 版 2001) 和 Ausubel 等人， Current Protocols in Molecular Biology(1994)。 0042 本发明的方法使用 RNA 分子来源。优选地， 所述来源富集 miRNA 分子。虽然始终 提及 “miRNA” 和 “富集” ， 但是应了解本文公开的方法可用于标记具有 3 末端的任何核酸 分子， 不论富集与否， 包括具有修饰 3 末

38、端的 RNA 分子， 例如在植物和细菌中发现的此类分 子。 本发明的方法还可扩展到标记DNA分子， 其具有与酶结合的3 末端， 该酶在脱氧核糖核 苷酸存在下在3 末端合成多聚尾。 能够在脱氧核糖核苷酸存在下合成多聚尾的酶的一个示 例是末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT)。多种方法和商业试剂盒可用于从总 RNA 中富集 miRNA 分子。 示例包括miRvanaTM miRNA分离试剂盒(Ambion， Austin， TX)、 PureLinkTM miRNA分离 试剂盒 (Invitrogen， Carlsbad， CA)、 mirPremierTM microRNA 分离试剂盒 (Sigma-

39、Aldrich， St.Louis， MO) 和 miRNeasy 微小试剂盒 (Qiagen， Valencia， CA)， 在变性 PAGE 胶上纯化 ( 参 见， 例如 Miska 等人， Genome Biol.5 ： R68(2004)、 使用合适大小的分子量截留过滤器 ( 例 如YM filter devices， Millipore， Billerica， MA) 离心、 以及乙酸钠 / 乙醇 沉淀 ( 参见， 例如 Wang 等人， Nucleic Acids Res.32 ： 1688(2004)。 0043 miRNA 可获自包含 miRNA 的任何组织或细胞来源， 包括任

40、何生物或环境样品中发 现的病毒体、 植物、 和动物来源。优选地， 所述来源为动物组织， 更优选地为哺乳动物组织， 最优选地的为人类组织。RNA 还可从临床 FFPE 样品中纯化， 使用 RNA 提取试剂盒， 例如 RecoverAllTM总核酸分离试剂盒 (Ambion， Austin Tx)。 0044 RNA 可进行扩增过程。RNA 扩增试剂盒的示例包括， 但不限于， SenseAMP RNA 扩增 试剂盒 (Genisphere， Hatfield， PA)、 MessageAmpTMRNA 扩增试剂盒 (Ambion， Austin， TX)、 OvationTM RNA 扩增试剂盒

41、(NuGen Technologies， San Carlos， CA) 等等。 0045 参考图 1， 一单链寡核苷酸尾部连接到单链 miRNA 分子的 3 末端 ( 参见图 1a)。所 述寡核苷酸尾部可通过向单链 RNA 连接核苷酸的任何方式加入。优选地， 所述寡核苷酸尾 部使用poly(A)聚合酶(PAP)或其它合适的酶在合适的缓冲液中在合适的核苷酸存在下连 接到单链 cDNA。优选地， 所述寡核苷酸尾部为同聚核苷酸尾部 ( 即 polyA、 polyG、 polyC、 或 polyT)。优选地， 所述寡核苷酸尾部为 polyA 尾部， 通常长度在约 3 到大于 500 核苷酸范围 内，

42、 优选长度约 20 到约 100 核苷酸。当使用 PAP 时， 优选的缓冲液为 Tris-HCl， pH 8.0( 或 其它合适的缓冲液 )， 包含镁和锰离子。例如， 所述缓冲液可包含 1 到 100mM Tris-HCl， pH 8.0， 1 到 20mM MgCl2 和 1 到 20mM MnCl2， 以及 0.01 到 20mM ATP。加尾反应通常在 37进 行 5 到 60 分钟。 0046 为产生标记目标 miRNA 分子， 包含有义链的部分双链脱氧核酸序列通过连接反应 连接至所述3 寡核苷酸尾部(参见图1b)， 所述有义链包含核酸标记分子， 该分子包含一个 或多个能够在其 3 末

43、端发射或产生可检测信号的标记。通过所述 3 寡核苷酸尾部与所述 部分双链脱氧核酸序列反义链 3 末端突出端序列之间的互补碱基配对可促进上述反应， 所 述序列包含与所述寡核苷酸尾部互补的脱氧核苷酸序列。例如， 如果所述寡核苷酸尾部为 说 明 书 CN 102007224 B 9 6/12 页 10 polyA 尾部， 所述部分双链脱氧核酸序列的 3 突出端将在其 3 末端包含脱氧胸苷序列， 通 常长度在约 3 到大于 50 核苷酸范围内， 优选长度约 10 到约 30 核苷酸。对于认为彼此互补 的序列， 所述 3 突出端序列的具体核苷酸序列不需与所述 3 寡核苷酸尾部的具体核苷酸 序列完全 (

44、即 100 ) 互补， 所述 3 突出端序列的长度也不需准确等于所述 3 寡核苷酸尾 部的长度。 本领域技术人员可认识到， 所需要的是所述两种序列之间有足够的互补性， 以使 所述 3 突出端可与所述 3 寡核苷酸尾部退火， 由此正确定位所述 miRNA 分子 3 末端的捕 获序列。 0047 一旦正确定位， 所述核酸标记分子通过连接反应连接至所述 3 寡核苷酸尾部。此 类突出或 “交错” 连接反应更加有效， 且可在比平端连接反应更高的温度下进行。另外， 使 用寡聚脱氧核苷酸尾部允许脱氧核酸标记分子DNA连接DNA尾部， 这比DNA直接连接miRNA 更加有效。任何 DNA 连接酶可用于所述连接

45、反应。优选地， 所述 DNA 连接酶为 T4DNA 连接 酶。当使用 T4DNA 连接酶时， 优选的缓冲液为 Roche Applied Science， Indianapolis， IN 供应的 10X 连接缓冲液 (660mM Tris-HCl， pH 7.5， 50mM MgCl， 10mMDTT， 10mM ATP) 的 1/10 稀释液。优选地通过加入 EDTA 终止所述反应。 0048 用于所述连接反应的核酸标记分子优选地为多重标记的聚合骨架， 其与多个能够 发射或产生可检测信号的标记分子连接。所述骨架还包含一寡核苷酸延伸序列， 其包含连 接 3 加尾的 miRNA 分子的 5 磷

46、酸基团 ( 参见图 1b)。所述多重标记的聚合骨架可为其上 可连接标记分子的任何聚合物， 例如蛋白质、 肽、 糖类、 多糖、 脂类、 脂肪酸、 核酸等等。所述 多重标记的聚合骨架的总分子量优选地为约 50 到约 350kDa。所述聚合骨架优选地包含约 2-100 个标记分子， 所述标记分子相互间隔以减少或消除猝灭和 / 或允许接近大的检测分 子 ( 例如链霉亲和素 )。本领域技术人员可基于现有文献确定所述标记分子的适当间隔。 例如， 美国专利 6,762,292、 6,072,043、 和 6,046,038 描述了确定荧光标记分子连接核酸骨 架的最优间隔的方法。通常， 核酸骨架中的标记分子间

47、隔至少 10nt 即可。其它类型骨架中 的间隔可相应确定。 0049 图 2 描述了本发明的优选的多重标记的聚合骨架。所述多重标记的聚合骨架包含 寡核苷酸延伸序列， 其具有能够杂交结合核酸序列的 5 磷酸基团。在此实施方案中， 所述 核酸序列为图 2 所示的桥接寡核苷酸， 其 5 部分与所述聚合骨架的寡核苷酸尾部互补， 且 其 3 部分与 miRNA 分子的 3 寡核苷酸尾部互补。所述聚合骨架和所述桥接寡核苷酸共同 构成标记 miRNA 分子的系统。所述寡核苷酸尾部的 5 磷酸基团允许所述聚合骨架连接至 miRNA分子。 在所述连接反应中， 所述桥接寡核苷酸的摩尔质量通常超过所述聚合骨架的寡

48、核苷酸尾部， 优选地摩尔质量超过约 1.8-2.6 倍。杂交的桥接寡核苷酸 / 聚合骨架寡核苷 酸尾部共同形成上述部分双链脱氧核酸序列， 由此构成标记 miRNA 分子的系统。此外， 应了 解图 2 所述的序列仅作示例用， 可使用任何能够杂交的序列。 0050 在优选的实施方案中， 所述多重标记的聚合骨架为小线性树枝状多核苷酸组合 物， 其包含20-100个碱基， 更优选地包含300-750个核苷酸碱基， 并包含一个可连接末端和 10-15 个能够发射或产生可检测信号的标记分子。如上所述， 所述可连接末端具有可连接 至加尾 miRNA 分子的 5 磷酸基团。在一些实施方案中， 所述线性树枝状多

49、核苷酸组合物为 小 3DNATMDendrimer Capture Reagent(Genisphere Inc.， Hatfield， Pa.)。树枝状聚合物 为高度分支的核酸分子， 在其表面包含 2 种类型的单链杂交 “臂” 用于连接标记分子和捕获 说 明 书 CN 102007224 B 10 7/12 页 11 序列。由于单个树枝状聚合物可具有每种类型的多个臂， 杂交时获得的信号大大增强。使 用树枝状试剂增强信号描述于 Nilsen 等人， J.Theor.Biol.187 ： 273(1997) ； Stears 等人， Physiol.Genomics 3 ： 93(2000) ； 美国专利 5,175,270、 5,484,904、 5,487,973、 6,072,043、 6,110,687、 和 6,117,631 ； 以及美国专利公开 2002/0051981。使用优化设计的树枝状聚合 物允许放置标记分子以减少或消除猝灭。此外， 标记分子中的信号可放大或增强而无需目 标核酸分子自身的偏差引入扩增。 0051 所述线性树枝状多核苷酸组合物可包含通过以 5 -3 方向杂交结合在一起的第 一、 第二和第三多核苷酸单体， 每个多核苷酸单体在相互杂交结合之前， 具有第一、 第二和 第三单链杂交区域。第一