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1、(10)授权公告号 CN 103146819 B (45)授权公告日 2014.08.20 CN 103146819 B (21)申请号 201310055876.1 (22)申请日 2013.02.21 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (73)专利权人 安徽农业大学 地址 230036 安徽省合肥市长江西路 130 号 (72)发明人 张文明 胡明建 王晓波 姚大年 郑文寅 司红起 (74)专利代理机构 安徽汇朴律师事务所 34116 代理人 胡敏 LIU Nan-nan et al.Role of LOX3 Gene in Alleviatin。
2、g Adverse Effects of Drought and Pathogens in Rice.Rice Science .2008, 第 15 卷 ( 第 4 期 ), 第 276 282 页 . (54) 发明名称 鉴定大豆 Lox3 特异性引物及其方法 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 鉴 定 大 豆 Lox3 缺 失 体 的 特 异 性 引 物，包 括 以 下 引 物 对 ： Lox3F ： TAACCAGCGTTGGGGGAA ； Lox3R ： CATTTATAGACGTGCGTGCA。本发明还公开了鉴定大 豆 Lox3 缺失体的方法 ： 以待测缺失体的大豆基 。
3、因为 DNA 模板， 将上述引物对上述 DNA 模板进行 PCR 扩增 ； 若述 PCR 扩增产物中有 474bp 条带， 则 上述待测大豆基因含有Lox3， 若无474bp条带， 则 上述待测大豆基因缺失 Lox3。本发明的有益效果 在于， 不但节约时间和费用， 而且鉴定结果准确可 靠， 可显著提高对 Lox3 缺失体材料的筛选效率。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 黄琦 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 序列表4页 附图1页 (10)授权公告号 CN 103。
4、146819 B CN 103146819 B 1/1 页 2 1. 一种鉴定大豆 Lox3 缺失体的特异性引物， 其特征在于， 包括以下引物对 ： Lox3F ： TAACCAGCGTTGGGGGAA ； Lox3R ： CATTTATAGACGTGCGTGCA。 2. 一种使用权利要求 1 所述的特异性引物鉴定大豆 Lox3 缺失体的方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： （1） 以待测缺失体的大豆基因为 DNA 模板， 将所述引物对所述 DNA 模板进行 PCR 扩增 ； （2） 若述 PCR 扩增产物中有 474bp 条带， 则所述待测大豆基因含有 Lox3， 若无 474bp 条 带。
5、， 则所述待测大豆基因缺失 Lox3。 3.根据权利要求2所述的鉴定大豆Lox1缺失体的方法， 其特征在于， 所述Lox1缺失体 的大豆为五星 1 号、 五星 4 号、 鉴 31 中的任意一种。 权 利 要 求 书 CN 103146819 B 2 1/3 页 3 鉴定大豆 Lox3 特异性引物及其方法 技术领域 0001 本发明涉及鉴定大豆 Lox3 缺失体的特异性引物及其方法， 主要应用于分子标记 的技术领域。 背景技术 0002 大豆脂肪氧化酶 （Lox） 是一种含非血红素铁、 水溶性球蛋白质。Lox 通过催化不饱 和脂肪酸中顺， 顺 1,4- 戊二烯结构， 形成过氧化氢衍生物， 再继续。
6、转化成低级的醛和酮等 有害物质， 从而产生豆腥味和其他挥发性物质， 阻碍了大豆在食品中的广泛应用。Lox 催化 产生的过氧化氢物， 能直接与食品中的营养成分结合， 降低食品的食用品质和营养价值。 高 温处理可减轻大豆豆醒味 , 但会导致蛋白质变性 , 使蛋白质加工性能和利用率降低。此 外， 通过微波照射、 改变介质 pH、 有机溶剂萃取和醛水解酶水解等方法， 也可以降低或消除 大豆豆腥味。上述方法都会不同程度增加大豆产品成本， 且常常会导致大豆蛋白质溶解度 下降， 降低食品营养价值。因此， 通过遗传育种手段选育大豆 Lox 缺失体材料， 以降低或消 除 Lox 活性的影响具有重要意义。王若兰等。
7、 （2008） 研究认为， 大豆 Lox 缺失体样品在储藏 期间的品质变化比正常品种缓慢， Lox缺失可在一定程度上提高大豆储藏品质的稳定性。 王 金龙等 （2000） 研究认为， 大豆 Lox 缺失对蛋白质、 脂肪及脂肪酸含量没有影响， 但可能引起 种子中脯氨酸含量降低 , 而对其它氨基酸无影响。脯氨酸不属于人体必需氨基酸， 故 Lox 缺失不会引起大豆营养品质降低。Julian 等 （2010） 采用探针技术分别鉴定 Lox2 和 Lox3， 但该技术存在技术复杂、 费用较高等问题。通过分子标记技术筛选大豆 Lox 缺失体， 可以加 快无腥大豆品种选育进程， 进而从根本上改善大豆产品豆腥味。
8、， 提高大豆的储藏品质。 对目 前已有的 LOX 缺失体中 LOX 基因进行测序分析， 表明 Lox1 缺失体在其编码基因的第 8 个外 显子内缺失 1 个 74bp 的片段， 导致 Lox1 蛋白翻译过早终止 ； Lox3 缺失体在其编码基因的 第 1 个外显子内缺失 1 个单核苷酸 “G” ， 从而导致移码突变。 发明内容 0003 本发明要解决的技术问题是提供鉴定大豆 Lox3 缺失体的特异性引物及其方法。 0004 本发明是通过以下技术方案来实现的。 0005 一种鉴定大豆 Lox3 缺失体的特异性引物， 包括以下两组引物对 ： 0006 Lox3F ： TAACCAGCGTTGGGG。
9、GAA ； 0007 Lox3R ： CATTTATAGACGTGCGTGCA。 0008 一种上述的特异性引物鉴定大豆 Lox3 缺失体的方法， 包括以下步骤 ： 0009 （1） 以待测缺失体的大豆基因为 DNA 模板， 将上述两组引物对上述 DNA 模板进行 PCR 扩增 ； 0010 （2）若述 PCR 扩增产物中有 474bp 条带， 则上述待测大豆基因含有 Lox3， 若无 474bp 条带， 则上述待测大豆基因缺失 Lox3。 0011 进一步地， 上述 Lox3 缺失体的大豆为五星 1 号、 五星 4 号、 鉴 31 中的任意一种。 说 明 书 CN 103146819 B 3。
10、 2/3 页 4 0012 本发明的有益效果 ： 0013 本发明提供的特异性引物及其鉴定技术， 不但节约时间和费用， 而且鉴定结果准 确可靠， 可显著提高对 Lox3 缺失体材料的筛选效率。 附图说明 0014 图 1 为实施案例 1 琼脂糖凝胶电泳的示意图。 具体实施方式 0015 下面根据附图和实施例对本发明作进一步详细说明。 0016 在下述的实施案例 1 中， 一共选取七种大豆品种进行鉴定， 这七种大豆品种均由 河北省农林科学院提供的常用品种。 0017 1、 五星 1 号 0018 审定编号 : 冀审豆 2001002 号 0019 品种来源 : 河北省农林科学院粮油作物研究所 1。
11、997 年育成， 亲本组合为冀豆 9/ Century。 0020 2、 五星 2 号 0021 审定编号 ： 国审豆 2004005 0022 选育单位 ： 河北省农林科学院粮油作物研究所 0023 品种来源 ： 冀豆 9 号 Century 0024 3、 五星 3 号 0025 选育单位 ： 河北省农林科学院粮油作物研究所 0026 品种来源 ： 冀豆 9 号 Century 0027 4、 五星 4 号 0028 审定 ( 登记 ) 编号 ： 冀审豆 2009005 号 0029 选育单位 ： 河北省农林科学院粮油作物研究所 0030 品种来源 ： 冀豆 12Suzuyutaka 00。
12、31 5、 鉴 31 0032 由河北省农林科学院提供， 为推广品种 0033 6、 中黄 13 0034 品种审定编号 ： 国审豆 2001008 0035 品种来源 ： 豫豆 8 号 / 中 90052 76， 为推广品种 0036 选育单位 ： 中国农业科学院作物育种栽培研究所 0037 实施案例 1 ： 0038 1、 DNA 提取 ：（1） 0.1g 大豆粉加入 0.7mLSDS 提取液 （0.1M Tris-HCl（PH=8.5） ， 0.1M NaCl， 0.05M EDTA(PH=8.0)， 2% SDS） 在 65恒温下裂解 45min， 其间多次震荡。 0039 （2） 在。
13、 4 12000rpm 条件下， 离心 10min。 0040 （3） 取上清液加入等体积的酚 ： 氯仿 ： 异戊醇 （25:24:1） 上下颠倒旋转至两相不很 快分层。 0041 （4） 在 4 12000rpm 条件下， 离心 10min。 说 明 书 CN 103146819 B 4 3/3 页 5 0042 （5） 取上清液加入等体积的酚 ： 氯仿 ： 异戊醇 （25:24:1） 上下颠倒旋转数次。 0043 （6） 在 4 12000rpm 条件下， 离心 10min。 0044 （7） 取上清液加入等体积的异丙醇于 -20冰箱静置 30min。 0045 （8） 在 4 12000。
14、rpm 条件下， 离心 10min。 0046 （9） 用 70% 的乙醇洗涤两次。 0047 （10） 在 4 12000rpm 条件下， 离心 10min。 0048 （11） 沉淀自然风干。 0049 2、 引物 Lox1F ： ATCTTAGCGTGCTTCACCCA LOX1R ： CATCAGCGGCATAAGGATAG。 0050 引物均有 Primer Premier 5 软件设计。 0051 3、 反 应 体 系 ： 2uL 2.5mM dNTP , 0.5uL 10uM 上 下 游 引 物， 2uL 10*Ex Tap Buffer, 1U TaKaRa Tap, 150n。
15、g DNA 模板， 用双蒸馏水补齐到 20uL。 0052 4、 PCR 反应程序 ： 变性 ： 94 5min， 94 45s， 退火 ： 65每个循环降 0.4 20 个 循环 50s， 延伸 ： 72 45s， 变性 ： 94 45s， 退火 ： 61.5 50s14 循环， 延伸 ： 72 45s， 延 伸 ： 72 8min。 0053 5、 琼脂糖凝胶电泳 ： 1.5% 琼脂糖凝胶， 缓冲体系为 1TAE 溶液， 在 100V 恒压下， 电泳 50min， 溴化乙锭 (EB) 染色， 凝胶成像系统扫描并保存。若述 PCR 扩增产物中有 474bp 条带， 则上述待测大豆基因含有 L。
16、ox3， 若无 474bp 条带， 则上述待测大豆基因缺失 Lox3。 0054 图 1 为实施案例 1 琼脂糖凝胶电泳的示意图， 参照图 1， 其中， M ： marker 1 ： 五星 1 号 （缺失 Lox2、 3） 2 ： 五星 2 号 （缺失 Lox2） 3 ： 五星 3 号 （缺失 Lox2） 4 ： 五星 4 号 （缺失 Lox1、 2、 3） 5 ： 鉴 31（缺失 Lox1、 2、 3） 6 ： 中黄 13 0055 图1清楚地说明了这七种不同品种的五星1号、 五星4号、 鉴31中为Lox1缺失体。 0056 具体实验结果参照图 1 所示的琼脂糖凝胶电泳的示意图。 0057 。
17、本发明， 提供的特异性引物及其鉴定技术， 不但节约时间和费用， 而且鉴定结果准 确可靠， 可显著提高对 Lox1 缺失体材料的筛选效率。 0058 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点， 其目的在于让熟悉此领域技术的 人士能够了解本发明内容并加以实施， 并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明 精神实质所作的等效变化或修饰， 都应涵盖在本发明的保护范围内。 说 明 书 CN 103146819 B 5 1/4 页 6 0001 0002 序 列 表 CN 103146819 B 6 2/4 页 7 0003 序 列 表 CN 103146819 B 7 3/4 页 8 0004 序 列 表 CN 103146819 B 8 4/4 页 9 序 列 表 CN 103146819 B 9 1/1 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 103146819 B 10 。