技术领域
本发明属于细胞基因工程领域，尤其涉及一种人蛋白基因Notch3胞内片段克隆载体及其制备方法和应用。
背景技术
Notch基因于1917年在果蝇体内被发现，因其基因的部分缺失会在果蝇翅膀的边缘造成缺口(Notch)而得名。Notch信号通路在大部分脊椎和非脊椎动物中都存在，有较高程度的保守性。既往研究表明，Notch受体与配体可以在相邻细胞间结合，传递Notch信号，从而对器官形成和形态产生影响。研究表明，Notch信号通路的改变与肿瘤、遗传性疾病、神经退行性疾病以及心血管病变等的发生、发展密切相关。
在人体中，Notch基因存在四种亚型分别是Notch 1、2、3、4。成熟的Notch受体蛋白由胞外结构域(extracellularnotch，ECN)、跨膜结构域(notch transmembrane，NTM)和胞内结构域组成。胞外结构域通过其具有的3个串联Lin/Notch重复序列(Lin/Notch repeats，LNR)以非共价键的形式与跨膜结构域相互结合形成异二聚体。此外，胞外结构域中还包含一个表皮生长因子样重复序列(epidermal growth factor-like repeats，EGF-R)，通常作为配体结合位点发挥相关生理作用。
在信号传导过程中，激活后的Notch受体蛋白会发生多次剪接切，此时Notch胞内区域(notch intra cellular domain，NICD))会从细胞膜上被剪切下来，进入细胞核与核转录因子结合，激活下游靶基因转录而发挥一系列生物学作用。
Notch3主要表达于平滑肌细胞中，经证实与心肌重构、心动脉平滑肌细胞的分化与成熟等有关，是研究心血管相关发育缺陷和生理疾病的重要基因。Notch3基因胞内片段由于其碱基序列GC值含量较高，极易在分子克隆过程中形成二级结构或发卡结构而影响扩增过程，普通分子克隆酶无法获得目的片段。此外，目前市场上已有的N3ICD载体价格昂贵，这些现状都为Notch3信号通路的研究带来了巨大阻碍，影响了研究工作的开展。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种人蛋白基因Notch3胞内片段克隆载体及其制备方法和应用，为子心肌系统疾病的相关研究提供巨大便利。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
人蛋白基因NOTCH3胞内片段克隆载体，在pcDNA3.1载体的KpnI和XbaI酶切位点之间构建有人蛋白基因NOTCH3胞内片段(N3ICD蛋白片段)序列。
人蛋白基因NOTCH3胞内片段来自Notch3基因(人细胞系hela)，其具有序列表SEQ.ID.NO.1的碱基序列，其编码的蛋白具有序列表SEQ.ID.NO.2的氨基酸序列。
碱基序列在第533位和1820位碱基存在氨基酸同义突变。
上述蛋白基因NOTCH3胞内片段克隆载体的制备方法，将人蛋白基因NOTCH3胞内片段碱基序列克隆到pcDNA3.1载体的KpnI和XbaI酶切位点之间，KpnI酶切位点位于碱基序列的上游，XbaI酶切位点位于碱基序列的下游，从而构建成为可以完成细胞瞬转过表达的N3ICD-pcDNA3.1过表达载体。
人蛋白基因NOTCH3胞内片段碱基序列属于Notch3基因，其具有序列表SEQ.ID.NO.1的碱基序列。
上述蛋白基因NOTCH3胞内片段克隆载体的制备方法，按以下步骤操作进行：
<1>根据NCBI上Notch3基因核苷酸序列(基因登录号：NM 000435.2的5063-7042)，以Hela细胞总RNA反转录为cDNA为模板，克隆Notch3胞内碱基序列；
<2>所克隆得到的Notch3胞内碱基序列(N3ICD序列)插入到pcDNA3.1载体KpnI和XbaI酶切位点之间。
蛋白基因NOTCH3胞内片段克隆载体的制备方法，克隆使用巢式PCR技术配合高GC buffer进行，克隆所用引物为：
巢式外部引物：
O-N3ICD-F1：5’-gtcattctcgtcctgggtgtcatg-3’(序列表SEQ.ID.NO.3)，
O-N3ICD-R1：5’-gtctcaggccaacacttgcctc-3’(序列表SEQ.ID.NO.4)；
内部引物：
N3ICD-KpnI-F2：5’-ccggtaccatggtggcccggcgcaagc-3’(序列表SEQ.ID.NO.5)，
N3ICD-XbaI-R2：5’-tttctagatcaggccaacacttgcctct-3’(序列表SEQ.ID.NO.6)。
PCR扩增产物长度为1980bp。
上述蛋白基因NOTCH3胞内片段克隆载体的制备方法，克隆的反应体系和条件以及反应程序分别为：
巢式第一轮PCR反应体系和条件为：
巢式第一轮PCR反应程序为：
接着，以第一轮PCR产物稀释100倍的溶液为模板，进行巢式PCR产物反应，反应体系及条件为：
上述蛋白基因NOTCH3胞内片段克隆载体在细胞系过表达N3ICD mRNA或蛋白方面的应用。
针对目前心肌系统疾病的相关研究存在问题，发明人设计并构建了一种人蛋白基因NOTCH3胞内片段克隆载体，在pcDNA3.1载体的KpnI和XbaI酶切位点之间构建有人蛋白基因NOTCH3胞内片段序列。据此，还建立了相应构建方法，即将人蛋白基因NOTCH3胞内片段碱基序列克隆到pcDNA3.1载体的KpnI和XbaI酶切位点之间，KpnI酶切位点位于碱基序列的上游，XbaI酶切位点位于碱基序列的下游，从而构建成为可以直接用于常规过表达载体亚克隆的N3ICD-pcDNA3.1过表达载体。实验结果显示，使用该测序验证后的过表达质粒转染的细胞经qPCR检测和蛋白质免疫印迹检测，均可在细胞中特异性高表达N3ICD的mRNA及蛋白，测定结果清晰准确，价格低廉，大幅缩减实验成本。因此，本发明构建的N3ICD过表达载体可以作为现成的亚克隆模板，参与到过表达载体构建和过表达慢病毒包装中，为心肌系统疾病的研究带来巨大便利。经验证，来源于该载体的片段在经过过表达慢病毒包装后可以在在细胞系中特异性高表达Notch3基因的胞内结构mRNA以及蛋白胞内结构域。可见，本发明有效解决了人源N3ICD片段克隆困难和在细胞系中高表达的问题，为notch3基因通路研究提供了实验基础。
与现有技术相比，本发明的突出优势在于：
(1)本发明的N3ICD-pcDNA3.1过表达载体可直接用于常规过表达载体亚克隆，并用于细胞系转化，获得瞬时转染的高表达N3ICD细胞株。
(2)本发明的N3ICD-pcDNA3.1过表达载体经转染之后效果经qPCR、蛋白质免疫印迹证实准确可靠。
附图说明
图1是琼脂糖凝胶电泳分析图，图中：M：marker。
图2是单克隆琼脂糖凝胶电泳分析图，图中：M：marker，1-9分别是9个单克隆的菌液PCR电泳结果。
图3是qPCR检测N3ICD表达柱状图。
图4是WB检测N3ICD过表达蛋白免疫印迹图。
图5是WB检测N3ICD过表达蛋白免疫印迹灰度图。
具体实施方式
实施例1 N3ICD克隆质粒用于慢病毒包装、细胞系转染过表达mRNA
一、基因克隆
(一)Hela细胞mRNA的提取
(1)样本的前期处理：500xg离心收集细胞(＜1x 107细胞)，去除培养液，涡旋或用手指弹打松散细胞团，加入1mL TRNzol，移液枪吸打3-5次，静置5分钟，让细胞充分裂解；
(2)分相：加入200μl体积的氯仿(为TRNzol总体积的1/5)，充分颠倒混匀，室温下静置3分钟，12000rpm 4℃离心15分钟，溶液分层，小心吸取含RNA的上清移到一新的离心管中。
(3)RNA沉淀：向吸取的上清中加入1μL RNA共沉淀剂，混匀，再加入异丙醇400μL，颠倒数次混匀，室温静置10min，12000rpm 4℃离心10分钟，在管底可见RNA沉淀，弃上清。
(4)RNA清洗：在离心管中加入1mL 75％乙醇(DEPC水新鲜配制)，颠倒混匀，12000rpm 4℃离心5分钟。小心地弃上清。
(5)RNA溶解：敞开离心管口，室温干燥5～10分钟使残留液体挥发，待RNA略干后，加30μL DEPC水溶解沉淀，取少量检测，其余可保存于-80℃或液氮中。
(二)去DNA
表1去DNA体系和条件
(三)逆转录(Thermo试剂盒逆转录)
表2逆转录体系和条件
接着加入以下试剂：
表3逆转录加入试剂
(四)PCR
以Hela细胞的cDNA为模板，以巢式PCR原理设计两对引物，分别为：
外围引物：
O-N3ICD-F1：5’-GTCATTCTCGTCCTGGGTGTCATG-3’
O-N3ICD-R1：5’-GTCTCAGGCCAACACTTGCCTC-3’
内部引物：
N3ICD-KpnI-F2：5’-CCGGTACCATGGTGGCCCGGCGCAAGC-3’
N3ICD-XbaI-R2：5’-TTTCTAGATCAGGCCAACACTTGCCTCT-3’
PCR扩增产物长度为1980bp。
以Hela细胞的cDNA为模板，反应体系及条件如下：
巢式第一轮PCR体系：
表4巢式第一轮PCR反应体系
表5巢式第一轮PCR反应程序
以第一轮PCR产物稀释100倍的溶液为模板，进行巢式PCR产物反应，反应体系及条件如下：
表6巢式PCR反应体系及条件
表7巢式PCR反应程序
PCR反应完取2μL PCR产物进行1％琼脂糖电泳分析，结果如图1，可见扩增出片段大小与理论大小相符。
(五)PCR产物加A尾
表8 PCR产物加A尾体系和程序
(六)产物的纯化回收
按照凝胶纯化试剂盒(AXYGEN，货号：AP-GX-250)说明书进行产物纯化。
(1)事先称量一只2.0mL的空EP管重量并记录于管壁；
(2)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μL体积)。
(3)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合(每2-3min)，直至凝胶块完全熔化(约6-8min)。
(4)加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。
(5)吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管(置于2ml离心管)中，12，000×g离心1min。弃滤液。
(6)将制备管置回2mL离心管，加500μl Buffer W1，12，000×g离心30s，弃滤液。
(7)将制备管置回2mL离心管，加700μl Buffer W2，12，000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次12，000×g离心1min。
(8)将制备管置回2mL离心管中，12，000×g离心1min。
(9)将制备管置于洁净的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加30μL Eluent或去离子水，室温静置1min。12，000×g离心1min洗脱DNA。
(10)取少量检测浓度，其余可保存于-20℃中。
(七)连接
连接反应体系如下：
表9连接反应体系和条件
(八)转化
(1)取连接产物加到50μL DH5α感受态细胞中，混匀，冰浴30分钟。
(2)将上述转化液置于42℃水浴90秒，取出后立即置于冰浴中放置2-3分钟。
(3)向其中加入800μL 37℃预热的LB(不含抗生素)培养基，200rpm、37℃振荡培养1小时。
(4)2500rpm离心5min，将上清液吸走，留100μ L混匀菌液，加到含Amp抗生素LB固体琼脂培养基上(抗生素浓度100μg/mL)，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。
(九)菌落PCR鉴定
随机挑取上述平板上的若干单菌落，于加有400μL AMP液体培养基1.5mL EP中，标好编号(共挑取9个单菌落)，200rpm、37℃振荡培养4小时。依据编号另取相等灭菌数量PCR管，反应体系及条件如下：
表10菌落PCR鉴定体系
表11菌落PCR鉴定程序
PCR反应完取2μL PCR产物进行1％琼脂糖电泳分析，结果如图2。由电泳图可知条带大小相符，取2、6、8号进行测序鉴定。将阳性的克隆送测序公司测序进一步鉴定确认得到N3ICD过表达载体。
二、qPCR检测
(一)细胞提取RNA
1、细胞来源
以本克隆载体序列为模板，构建到慢病毒载体pAd-EFla-GFP中进行病毒包装，以收获的病毒感染细胞进行N3ICD过表达。细胞感染分3组：空白+凝聚胺，AV-GFP，AV-N3ICD。2、提取步骤(TRIZOL法)
(1)从-80℃冰箱中拿出已用TRIZOL裂解的细胞，解冻15min，摇匀。
(2)加入100μl氯仿，大力摇15s，静置5min。
(3)4℃12000g离心15min。
(4)小心吸取上层水相(大概200μl)，加入等量异丙醇，轻轻混匀，静置10min。
(5)4℃12000g离心10min，弃上清。
(6)加入1ml 75％乙醇，使沉淀悬浮，4℃12000g离心10min，弃上清。
(7)干燥沉淀(大概5min)，加入20μl DEPC H2O。
(二)检测RNA浓度
表12检测RNA浓度
(三)去DNA处理
取全部RNA样品进行后续实验，实验体系：
表13去DNA体系和条件
(四)逆转录
1、去DNA处理完成后，重新测定浓度
表14重新测定浓度
2、mRNA逆转录
取1μg RNA进行逆转录(采用Thermo试剂盒)
(1)在冰上将下列体系配制好
表15逆转录体系
Template RNA 1μg Oligo(dT)Primer 0.5μL Water，nuclease-free To 6μL Total volume 6μL
(2)混匀，离心后，65℃孵育5min，立即放冰上5min。
(3)加入下列试剂
表16逆转录体系
5x Reaction Buffer 2μL 10mM dNTP Mix 1μL RiboLock RNase Inhibitior(20U/μL) 0.5μL RevertAid M-MuLV RT(200U/μL) 0.5μL Total volume 10μL
(4)混匀，离心后，42℃60min，70℃5min。
(五)qPCR检测
1、模板制备
取逆转录好的样品稀释5倍，其余cDNA样品稀释10倍，后作为模板进行后续的实验。2、qPCR检测(采用QIAGEN试剂盒)
qPCR检测反应体系如下：
表17 qPCR检测反应体系
qPCR检测程序如下：
表18 qPCR检测反应程序
(六)检测结果
2-Real time PCR实验检测结果如图3，结果显示，转染了过表达载体的细胞较转染空载和空白细胞存在更高的Notch3mRNA水平，表明过表达载体能够实现Notch3的mRNA过表达。
实施例2 N3ICD克隆质粒用于慢病毒包装、细胞系转染过表达蛋白
一、细胞蛋白提取
1、细胞来源
以本发明克隆载体序列为模板，构建到慢病毒载体pAd-EF1a-GFP中进行病毒包装，以收获的病毒感染细胞进行N3ICD过表达。细胞感染分3组：空白+凝聚胺，AV-GFP，AV-N3ICD。
2、蛋白样品蛋白制备：在细胞样品中加入适量裂解液RIP A(含蛋白抑制剂)冰上裂解30min，再经过超声波细胞粉碎机超声破碎，4℃，13000rpm离心30min。离心完成后移取上清至洁净离心管中，立即使用或者-80℃保存。
3、总蛋白浓度检测：蛋白样品提取完成后将上清做倍数稀释后以BCA蛋白定量法测定蛋白吸光值(OD)值，再通过标准曲线计算蛋白样品的浓度。
二、蛋白免疫印迹实验(Western-Blot)
2.1、12％分离胶和5％浓缩胶的配置(m1)
表19 12％分离胶和5％浓缩胶的配制
2.2、制胶：将玻璃板刷洗干净，用双蒸水冲净，晾干。在制胶架上安装玻璃板，按上表配方配制分离胶，注入两块玻璃板中间，并在液面上加入适量超纯水压平胶面，静置30min。待胶凝固后，倒掉上层水并用滤纸将水分吸干。然后按配方配制浓缩胶注入玻璃板中，小心插入梳子，静置30min待胶凝固后将胶板夹紧到电泳槽上，小心拔出梳子，用滴头冲洗泳道中的碎胶。
2.3、蛋白变性：将待测蛋白以一定倍数稀释后再和loading buffer以3∶1的体积比混合，沸水浴10min，然后取出样品管置于冰上降温。
2.4、上样
2.5、电泳：在电泳槽内加入电泳缓冲液，接通电源，80V恒压电泳至溴酚蓝跑出浓缩胶层，时间大约为30min。分离胶电泳为120V，当溴酚蓝迁移至距离分离胶下缘约1cm时，关掉电源，停止电泳。
2.6、转膜
(1)预先配置1L 1×转移电泳缓冲液预冷至4℃。
(2)先将PVDF膜在甲醇中浸泡30s，再将其转移至转膜缓冲液浸泡15min，然后把滤纸、凝胶一起放到转膜缓冲液中浸泡15min。
(3)按夹心法依次将(转膜夹黑色面)海绵、滤纸、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、滤纸、海绵(白色面)按顺序放好，小心赶除所有的气泡，将转膜夹放入转印槽中，倒入适量转膜缓冲液，400mA稳流电转移1h(转膜条件依据不同蛋白进行优化)。
2.7、封闭
PVDF膜，去离子水洗涤。将PVDF膜浸入5％脱脂牛奶的封闭液中，室温封闭1h。
2.8、孵育抗体
取出已封闭的PVDF膜，置于1×TBS-T缓冲液中，于摇床上缓慢洗涤3×5min。然后移入第一抗体中，室温摇床孵育或者4℃孵育过夜。
一抗孵育完成后将一抗回收，将PVDF膜置于1×TBS-T缓冲液中，于摇床上缓慢洗涤3×5min。然后分别对应移入有HRP标记的第二抗体中，室温摇床孵育1h。
内参孵育：取出已封闭的PVDF膜，浸于1×TBS-T缓冲液中，于摇床上缓慢洗涤3×5min。然后移入内参抗体中，室温摇床孵育或者4℃孵育过夜。
2.9、洗膜
将PVDF膜浸于1×TBS-T缓冲液中，于摇床上缓慢浸洗3×10min。
2.10、ECL化学发光显影
将PVDF膜至于保鲜膜上，取适量等体积的A液和B液混合，混匀后加在膜的表面，移至凝胶成像分析仪中，曝光显影，如图4，WB结果显示，转染了过表达载体的细胞其NOTCH3蛋白表达量远高于空载和空白组，证明过表达载体能够实现NOTCH3的高表达。
2.11、灰度值分析
用Image J软件对目的条带进行灰度值(面积)计算结果如图5，WB灰度图显示转染了过表达载体的细胞其NOTCH3蛋白表达量远高于空载和空白组，证明过表达载体能够实现NOTCH3的高表达。
结论
(1)本发明构建的人源N3ICD序列克隆载体可以作为模板参与到多种基因操作中，避免了克隆所带来的人员与试剂成本。
(2)本发明构建的人源N3ICD序列克隆载体可进一步亚克隆到慢病毒载体中并实现mRNA和蛋白的高表达。
序列表
<110> 南宁维尔凯生物科技有限公司
<120> 人蛋白基因Notch3胞内片段克隆载体及其制备方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1980
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggtggccc ggcgcaagcg cgagcacagc accctctggt tccctgaggg cttctcactg 60
cacaaggacg tggcctctgg tcacaagggc cggcgggaac ccgtgggcca ggacgcgctg 120
ggcatgaaga acatggccaa gggtgagagc ctgatggggg aggtggccac agactggatg 180
gacacagagt gcccagaggc caagcggcta aaggtagagg agccaggcat gggggctgag 240
gaggctgtgg attgccgtca gtggactcaa caccatctgg ttgctgctga catccgcgtg 300
gcaccagcca tggcactgac accaccacag ggcgacgcag atgctgatgg catggatgtc 360
aatgtgcgtg gcccagatgg cttcaccccg ctaatgctgg cttccttctg tgggggggct 420
ctggagccaa tgccaactga agaggatgag gcagatgaca catcagctag catcatctcc 480
gacctgatct gccagggggc tcagcttggg gcacggactg accgtactgg cgagactgcc 540
ttgcacctgg ctgcccgtta tgcccgtgct gatgcagcca agcggctgct ggatgctggg 600
gcagacacca atgcccagga ccactcaggc cgcactcccc tgcacacagc tgtcacagcc 660
gatgcccagg gtgtcttcca gattctcatc cgaaaccgct ctacagactt ggatgcccgc 720
atggcagatg gctcaacggc actgatcctg gcggcccgcc tggcagtaga gggcatggtg 780
gaagagctca tcgccagcca tgctgatgtc aatgctgtgg atgagcttgg gaaatcagcc 840
ttacactggg ctgcggctgt gaacaacgtg gaagccactt tggccctgct caaaaatgga 900
gccaataagg acatgcagga tagcaaggag gagacccccc tattcctggc cgcccgcgag 960
ggcagctatg aggctgccaa gctgctgttg gaccactttg ccaaccgtga gatcaccgac 1020
cacctggaca ggctgccgcg ggacgtagcc caggagagac tgcaccagga catcgtgcgc 1080
ttgctggatc aacccagtgg gccccgcagc ccccccggtc cccacggcct ggggcctctg 1140
ctctgtcctc caggggcctt cctccctggc ctcaaagcgg cacagtcggg gtccaagaag 1200
agcaggaggc cccccgggaa ggcggggctg gggccgcagg ggccccgggg gcggggcaag 1260
aagctgacgc tggcctgccc gggccccctg gctgacagct cggtcacgct gtcgcccgtg 1320
gactcgctgg actccccgcg gcctttcggt gggccccctg cttcccctgg tggcttcccc 1380
cttgaggggc cctatgcagc tgccactgcc actgcagtgt ctctggcaca gcttggtggc 1440
ccaggccggg cgggtctagg gcgccagccc cctggaggat gtgtactcag cctgggcctg 1500
ctgaaccctg tggctgtgcc cctcgattgg gcccggctgc ccccacctgc ccctccaggc 1560
ccctcgttcc tgctgccact ggcgccggga ccccagctgc tcaacccagg gacccccgtc 1620
tccccgcagg agcggccccc gccttacctg gcagtcccag gacatggcga ggagtacccg 1680
gcggctgggg cacacagcag ccccccaaag gcccgcttcc tgcgggttcc cagtgagcac 1740
ccttacctga ccccatcccc cgaatcccct gagcactggg ccagcccctc acctccctcc 1800
ctctcagact ggtccgaatc cacgcccagc ccagccactg ccactggggc catggccacc 1860
accactgggg cactgcctgc ccagccactt cccttgtctg ttcccagctc ccttgctcag 1920
gcccagaccc agctggggcc ccagccggaa gttaccccca agaggcaagt gttggcctga 1980
<210> 2
<211> 659
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Val Ala Arg Arg Lys Arg Glu His Ser Thr Leu Trp Phe Pro Glu
1 5 10 15
Gly Phe Ser Leu His Lys Asp Val Ala Ser Gly His Lys Gly Arg Arg
20 25 30
Glu Pro Val Gly Gln Asp Ala Leu Gly Met Lys Asn Met Ala Lys Gly
35 40 45
Glu Ser Leu Met Gly Glu Val Ala Thr Asp Trp Met Asp Thr Glu Cys
50 55 60
Pro Glu Ala Lys Arg Leu Lys Val Glu Glu Pro Gly Met Gly Ala Glu
65 70 75 80
Glu Ala Val Asp Cys Arg Gln Trp Thr Gln His His Leu Val Ala Ala
85 90 95
Asp Ile Arg Val Ala Pro Ala Met Ala Leu Thr Pro Pro Gln Gly Asp
100 105 110
Ala Asp Ala Asp Gly Met Asp Val Asn Val Arg Gly Pro Asp Gly Phe
115 120 125
Thr Pro Leu Met Leu Ala Ser Phe Cys Gly Gly Ala Leu Glu Pro Met
130 135 140
Pro Thr Glu Glu Asp Glu Ala Asp Asp Thr Ser Ala Ser Ile Ile Ser
145 150 155 160
Asp Leu Ile Cys Gln Gly Ala Gln Leu Gly Ala Arg Thr Asp Arg Thr
165 170 175
Gly Glu Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Arg Tyr Ala Arg Ala Asp Ala
180 185 190
Ala Lys Arg Leu Leu Asp Ala Gly Ala Asp Thr Asn Ala Gln Asp His
195 200 205
Ser Gly Arg Thr Pro Leu His Thr Ala Val Thr Ala Asp Ala Gln Gly
210 215 220
Val Phe Gln Ile Leu Ile Arg Asn Arg Ser Thr Asp Leu Asp Ala Arg
225 230 235 240
Met Ala Asp Gly Ser Thr Ala Leu Ile Leu Ala Ala Arg Leu Ala Val
245 250 255
Glu Gly Met Val Glu Glu Leu Ile Ala Ser His Ala Asp Val Asn Ala
260 265 270
Val Asp Glu Leu Gly Lys Ser Ala Leu His Trp Ala Ala Ala Val Asn
275 280 285
Asn Val Glu Ala Thr Leu Ala Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asn Lys Asp
290 295 300
Met Gln Asp Ser Lys Glu Glu Thr Pro Leu Phe Leu Ala Ala Arg Glu
305 310 315 320
Gly Ser Tyr Glu Ala Ala Lys Leu Leu Leu Asp His Phe Ala Asn Arg
325 330 335
Glu Ile Thr Asp His Leu Asp Arg Leu Pro Arg Asp Val Ala Gln Glu
340 345 350
Arg Leu His Gln Asp Ile Val Arg Leu Leu Asp Gln Pro Ser Gly Pro
355 360 365
Arg Ser Pro Pro Gly Pro His Gly Leu Gly Pro Leu Leu Cys Pro Pro
370 375 380
Gly Ala Phe Leu Pro Gly Leu Lys Ala Ala Gln Ser Gly Ser Lys Lys
385 390 395 400
Ser Arg Arg Pro Pro Gly Lys Ala Gly Leu Gly Pro Gln Gly Pro Arg
405 410 415
Gly Arg Gly Lys Lys Leu Thr Leu Ala Cys Pro Gly Pro Leu Ala Asp
420 425 430
Ser Ser Val Thr Leu Ser Pro Val Asp Ser Leu Asp Ser Pro Arg Pro
435 440 445
Phe Gly Gly Pro Pro Ala Ser Pro Gly Gly Phe Pro Leu Glu Gly Pro
450 455 460
Tyr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Val Ser Leu Ala Gln Leu Gly Gly
465 470 475 480
Pro Gly Arg Ala Gly Leu Gly Arg Gln Pro Pro Gly Gly Cys Val Leu
485 490 495
Ser Leu Gly Leu Leu Asn Pro Val Ala Val Pro Leu Asp Trp Ala Arg
500 505 510
Leu Pro Pro Pro Ala Pro Pro Gly Pro Ser Phe Leu Leu Pro Leu Ala
515 520 525
Pro Gly Pro Gln Leu Leu Asn Pro Gly Thr Pro Val Ser Pro Gln Glu
530 535 540
Arg Pro Pro Pro Tyr Leu Ala Val Pro Gly His Gly Glu Glu Tyr Pro
545 550 555 560
Ala Ala Gly Ala His Ser Ser Pro Pro Lys Ala Arg Phe Leu Arg Val
565 570 575
Pro Ser Glu His Pro Tyr Leu Thr Pro Ser Pro Glu Ser Pro Glu His
580 585 590
Trp Ala Ser Pro Ser Pro Pro Ser Leu Ser Asp Trp Ser Glu Ser Thr
595 600 605
Pro Ser Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Met Ala Thr Thr Thr Gly Ala
610 615 620
Leu Pro Ala Gln Pro Leu Pro Leu Ser Val Pro Ser Ser Leu Ala Gln
625 630 635 640
Ala Gln Thr Gln Leu Gly Pro Gln Pro Glu Val Thr Pro Lys Arg Gln
645 650 655
Val Leu Ala
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcattctcg tcctgggtgt catg 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtctcaggcc aacacttgcc tc 22
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<211> 27
<212> DNA
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ccggtaccat ggtggcccgg cgcaagc 27
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttctagatc aggccaacac ttgcctct 28