技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及茄子光信号通路中的关键酶及其编码基因，具体 涉及一种茄子SmHY5(LongHypocotyl5)蛋白及其编码基因。
背景技术
HY5是最早被发现的正调控光形态建成的转录因子，其编码的蛋白序列分析显示， HY5属于基本的亮氨酸型拉链(b-ZIP)型转录因子，它定位于细胞核，能够与多种光调控基 因的启动子直接结合来调控这些基因的表达。对HY5蛋白水平的研究发现，HY5蛋白积累受 到光的调控，持续黑暗条件下生长的拟南芥幼苗体内的HY5蛋白大部分被降解，几乎检测不 到HY5蛋白的积累；而在照光条件下，HY5蛋白可以迅速积累；这种HY5的降解依赖于26S泛素 蛋白酶体降解途径，而调控HY5降解的E3泛素连接酶正是光形态建成负调控因子COP1。黑暗 条件下由于COP1定位在细胞核，降解了体内大部分的HY5蛋白，而在光照条件下，COP1由细 胞核转移到细胞质，对HY5的降解得到解除而大量积累，这样HY5就可以行使功能了。
目前已从很多植物中克隆得到HY5基因，如拟南芥、葡萄、苹果、玉米等。茄子是重 要的蔬菜作物，但相关研究相对比较滞后。目前，未有任何与茄子HY5基因及其编码蛋白的 相关文献报道。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的在于填补茄子HY5基因的空白。本发明提供 了一种茄子HY5的cDNA以及氨基酸序列；进一步地，本发明提供了茄子SmHY5基因在不同组 织器官的表达模式。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一种茄子HY5蛋白，包括SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供一种编码茄子HY5蛋白的基因核酸序列，所述基因的cDNA序 列包括：
(a)如SEQIDNO.1第1～477位所示的碱基序列；或
(b)与SEQIDNO.1第1～477位所示的碱基序列具有至少70％的同源性的碱基序 列；或
(c)能与SEQIDNO.1第1～477位所示的碱基序列进行杂交的碱基序列。
优选地，所述cDNA序列包括SEQIDNO.1第1～477位所示的核酸序列中1～90个核 苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加60个以内核苷酸。
第三方面，本发明提供一种用于扩增所述基因的引物对，所述引物对的碱基序列 如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示。
第四方面，本发明提供一种编码茄子SmHY5蛋白的基因的荧光定量PCR分析的引物 对，所述引物对的碱基序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示。
第五方面，本发明提供一种编码茄子SmHY5蛋白的基因在基因工程调控植物在光 下生长状况的用途。
优选地，所述植物包括拟南芥。
在本发明中，术语“SmHY5基因编码序列”指SEQIDNO.1所示的第1～477位核苷酸 序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDNO.1所示的第1～477位核苷酸中，有一 个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简 并性，所以与SEQIDNO.1所示的第1～477位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也 能编码出SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。该术语还包括与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列 的同源性至少70％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的茄子SmHY5相同功能的蛋白的SEQIDNO.1所 示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：通常为1～90个核苷酸的缺失、插入 和/或取代，以及在5′和/或3′端添加为60个以内核苷酸。
在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析茄子SmHY5基因产物的表达模式， 即分析茄子SmCOP1基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
此外，根据本发明的茄子SmHY5核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表 达蛋白质的同源性基础上，筛选茄子SmHY5相关同源基因或同源蛋白。
为了得到与茄子SmHY5相关基因的点阵，可以用DNA探针筛选茄子cDNA文库，这些 探针是在低严谨条件下，用32P对茄子SmHY5相关的全部或部分做放射活性标记而得的。适合 于筛选的cDNA文库是来自茄子的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法 是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自 Clontech,Stratagene,PaloAlto,Cal.。这种筛选方法可以识别与茄子SmHY5相关的基因 家族的核苷酸序列。
本发明的茄子SmHY5相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法 或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是 开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制 备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩 增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其 克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
光信号能调控许多次生代谢途径，例如花青素的合成。茄子是广泛种植的蔬菜作 物，紫色茄子的果皮含有丰富的花青素。近年来的研究结果表明，紫色茄子的抗氧化保健作 用在常见蔬菜作物中是最好的。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、将SmHY5基因在拟南芥突变株hy5中表达，茄子HY5基因具有与拟南芥HY5基因相 似的功能。
2、本发明针对目前茄子研究基础薄弱的现状，克隆光信号通路中的关键基因 SmHY5基因，为今后利用基因工程技术改良植物品质，获得具有高抗氧化性的药物或食物提 供理论依据，具有很大的应用价值。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明的茄子HY5蛋白与番茄HY5蛋白的氨基酸序列同源比较(FASTA)结果， 其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出；
图2为本发明的茄子HY5基因在不同组织的表达情况；
图3为转SmHY5基因植株的RT-PCR检测；
图4为转SmHY5基因对拟南芥突变株hy5的表型恢复情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的 条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、茄子SmHY5基因的克隆
1.植物材料的获得
本实验所用的植物材料为茄子优良种质资源蓝山禾线茄。实验材料栽培于上海市 闵行区浦江镇航天育种基地的人工塑料大棚中。在自然条件下育苗，生长并结实。采集茄子 的叶片用于提取RNA。
2.RNA的提取
采用TRIzol法提取总RNA(TRIzol购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。用甲 醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光光度计(ThermoScientificNANODROP1000 Spectrophotometer)上测定RNA的纯度及浓度。
3.基因的全长克隆
基于Genbank中HY5基因的保守序列设计一对简并引物。将提取RNA进行反转录 (PrimeScriptII1stStrandcDNASynthesisKit：宝生物工程(大连)有限公司)，以第 一链cDNA为模板，利用引物
F1(SEQIDNO.3)：5′-ATGCARGARCAAGCGACRAGYTC-3′
R1(SEQIDNO.4)：5′-YTACTTCCKCCCTTCCTGTGCAC-3′
进行PCR，扩增得到预期长度后回收并连接到pMD-19T(宝生物工程(大连)有限公 司)载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用α互补及菌落PCR筛选阳性克隆，送至英潍捷基(上海) 贸易有限公司进行测序，得cDNA序列SEQIDNO.1。
实施例2、茄子HY5基因的序列信息与同源性分析
本发明新的茄子HY5基因全长CDS开放读框序列为477bp，详细序列见SEQID NO.1。根据CDS开放读码框序列推导出茄子HY5的氨基酸序列，共158个氨基酸残基，分子量 为17453.4道尔顿，理论等电点(pI)为9.64，详细序列见SEQIDNO.2所示序列。
将茄子HY5的CDS开放读框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在Non- redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+ SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与番茄 HY5基因(NM_001247891.1)在核苷酸水平上具有92.02％一致性；在氨基酸水平上，它们两 者之间相似性高达93.04％，如图1所示(Query：茄子HY5的氨基酸序列；Sbjct：番茄HY5的氨 基酸序列)。由此可见，茄子HY5基因与番茄HY5基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高 的同源性。
实施例3、茄子HY5基因在不同组织中的表达
1.植物材料的获得
在果实成熟期分别采集茄子根、茎、叶、花、果皮、果肉，将样品分别用铝铂纸包好 后立刻投入液氮中，接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用。
2.RNA的提取
采用TRIzol法提取总RNA(TRIzol购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。用普 通琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1.2％；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15min)检测完整性。电泳条 带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示rRNA样品的降解。纯度较好 的RNA，A260/A280以及A260/A230约为2.0左右。用分光光度计测定OD值并计算RNA含量。
3.cDNA的获得
以500ng的总RNA为模板，按照宝生物公司TaKaRaPrimeScriptTMRTreagentKit PerfectRealTime试剂盒操作说明进行反转录获得cDNA备用。
4.设计特异性引物以进行实时荧光定量PCR分析基因在不同组织中的表达量。根 据已经获得的茄子HY5基因序列，利用引物设计软件设计用于Real-timePCR中SmHY5基因 定量分析的特异性引物，
HY5-F(SEQIDNO.5)：5′-GACAAGTTCCATTGCGGCTAGTTC-3′
HY5-R(SEQIDNO.6)：5′-TCCATCTCTACCAGAAGCTGACGT-3′
内参基因为Actin(GU984779.1)，其引物为
ACTIN-F(SEQIDNO.7)：5′-GTCGGAATGGGACAGAAGGATG-3′
ACTIN-R(SEQIDNO.8)：5′-GTGCCTCAGTCAGGAGAACAGGGT-3′
5.制作目的基因及内参基因的标准曲线。用EASYDilution(试剂盒提供)将标准品 cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内参基因的 特异性引物进行Real-timePCR扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线。分析溶解曲 线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单 一的PCR扩增产物。通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数。
6.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析。以合成的cDNA第一条链为模板，分 别用目的基因与内参基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Real-timePCR反应在 FTC-3000实时定量仪上进行，反应体系为20μL。反应采用三步法，95℃变性1min，接着40个 循环：95℃30s；58℃30s；72℃45s。每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物是否为 特异产生。
7.采用2-△△Ct法作相对定量分析。结果表明SmHY5基因在茄子的根、茎、叶、花、果 皮、果肉中都有表达，且在各组织中的表达量均无显著差异，说明SmHY5基因的表达不具有 空间差异性(图2)。
实施例4、茄子HY5基因转拟南芥的功能验证
所用转化载体为pCAMBIA1302(Cambia)，拟南芥材料为HY5突变株hy5(Luetal., 2015.Red-light-dependentinteractionofphyBwithSPA1promotesCOP1–SPA1 dissociationandphotomorphogenicdevelopmentinArabidopsis.Molecular Plant.8:467–478.)。将含有SmHY5-1302的农杆菌培养至OD0.8～2.0，6000rpm离心5min， 弃上清，菌体沉淀用MS液重悬，调整OD600为0.8～1.2，侵染拟南芥花序10～60sec，暗培养 12h后正常培养，收集成熟的种子。
收集的T0代转基因种子，铺在含有50mg/L潮霉素抗性1/2MS平板上，4℃春化3d，光 照培养箱培养6-10d，选取根长的长，且长出真叶的健壮幼苗，移栽至土盆，培养。收集的T1代种子继续铺在含有50mg/L潮霉素抗性1/2MS平板上，选取抗性：不抗比为3:1的株系收集 T2代种子。T2代在50mg/L潮霉素抗性平板上存活率为100％的认为筛选到纯和抗性植株。对 获得的株系采用Real-timePCR检测SmHY5的表达量(图3)。所用拟南芥actin(NM_179953) 引物如下：
SEQIDNO.9：5′-GTCTGGATTGGAGGGTC-3′
SEQIDNO.10：5′-TGAGAAATGGTCGGAAA-3′
将筛选得到的阳性转化株同突变株，野生型一同置于光下培养。结果显示，hy5在 光下的下胚轴长度显著大于野生型WT，而转基因植株SmHY5/hy5恢复了这一表型(图4)。这 说明茄子HY5基因具有与拟南芥HY5基因相似的功能。
本发明还涉及的序列如下：
SEQIDNO.1((SmHY5基因cDNA序列)：
ATGCAAGAGCAAGCGACAAGTTCCATTGCGGCTAGTTCTATACCTTCAAGTAGTGAGAGATCTTCTAGTTCAGCTCT CCATCTTGAACACAAAGAAGGTATGGAGAGTGATGATGAGATCAGAAGAGTGCCGGAGATAGGCGGAGAAGCCACCG GAACCACGTCAGCTTCTGGTAGAGATGGAAGTTCCGCCACCCTTCAAGTTCAACCATTAACTGGGACTCAAAAGAAG CGAGGAAGAAGCCCAGCTGACAAAGAAAACAAGAGGTTAAAAAGGTTGCTGAGAAATAGAGTGTCTGCACAGCAAGC AAGGGAGAGGAAGAAAGCATACTTGATAGATCTGGAAGCAAGGGTGAAGGAACTGGAAACAAAGAATGCAGAACTTG AAGAGAGGTTGTCCACTTTGCAAAATGAGAACCAAATGCTTAGACATATACTGAAGAACACAACAGCAGGTGCACAG GAAGGGCGGAAGTAA
SEQIDNO.2(SmHY5基因氨基酸序列)：
MQEQATSSIAASSIPSSSERSSSSALHLEHKEGMESDDEIRRVPEIGGEATGTTSASGRDGSSATLQVQPLTGTQKK RGRSPADKENKRLKRLLRNRVSAQQARERKKAYLIDLEARVKELETKNAELEERLSTLQNENQMLRHILKNTTAGAQ EGRK
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述 特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影 响本发明的实质内容。