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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310741589.6 (22)申请日 2013.12.30 (66)本国优先权数据 201210587955.2 2012.12.31 CN (73)专利权人 江苏嘉语生物医药技术有限公司 地址 214431 江苏省无锡市江阴市砂山路 号 室 (72)发明人 赵万千王海晶杨扬杨焱焱 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 彭英 (51)Int.Cl. C12M 1/12(2006.01) C12N 1/00(2006.01) (56)对比文件。
2、 CN 102816688 A,2012.12.12,权利要求5， 9， 说明书第421段， 图14. CN 201942543 U,2011.08.24,权利要求1. US 2005170492 A1,2005.08.04,全文. WO 2010010355 A2,2010.01.28,全文. 审查员 纪圆圆 (54)发明名称 微生物分离培养装置及其方法 (57)摘要 本发明公开了一种微生物分离培养装置及 其方法； 该装置采用连接件将两个培养瓶的瓶口 连接， 且连接件中配装过滤组件； 该过滤组件是 针对目标菌株设置的， 因此， 将消化培养液经过 滤组件过滤后， 理论上即可分离出目标菌株， 且。
3、 过滤得到的目标菌株能够通过连接件流入用于 富集培养的培养瓶中， 由此可知， 本发明与现有 技术相比， 目标菌株的分离以及转移培养更为便 利， 能够减少操作过程中的可能污染， 以提高分 离效率、 减少各项成本。 权利要求书1页 说明书6页 附图4页 CN 103937662 B 2016.08.24 CN 103937662 B 1.一种微生物分离培养装置， 包括两个培养瓶， 其特征在于， 每一个培养瓶的底部通过 底盖封接， 且两个培养瓶的瓶口之间通过连接件连接， 该连接件沿自身轴线开设通孔， 所述 通孔的孔壁对应于两个培养瓶的瓶口分别设置有一个连接部位， 连接件的两个连接部位之 间设置有过滤。
4、组件安装部位， 该过滤组件安装部位安装有用于过滤目标微生物的过滤组 件， 而每一个培养瓶的瓶口与连接件的相应连接部位之间为可拆卸的密封连接。 2.根据权利要求1所述的微生物分离培养装置， 其特征在于， 所述的两个培养瓶中， 其 中一个培养瓶在另一个培养瓶的上方， 且两个培养瓶的瓶口相对设置。 3.根据权利要求1所述的微生物分离培养装置， 其特征在于， 每一个培养瓶的瓶口均设 置有外螺纹， 所述连接件的两个连接部位均包括开设在通孔孔壁上的内螺纹以及紧邻该内 螺纹设置的密封槽， 所述培养瓶瓶口的外螺纹与连接件上对应位置处的内螺纹螺纹配合连 接， 同时培养瓶的瓶口端部通过置于密封槽中的密封件与连接件。
5、密封。 4.根据权利要求1所述的微生物分离培养装置， 其特征在于， 所述的过滤组件包括滤膜 以及滤膜固定装置， 所述的滤膜固定装置与过滤组件安装部位螺纹配合连接， 而滤膜则通 过垫片配装在滤膜固定装置上， 垫片嵌装在通孔的孔壁紧邻过滤组件安装部位所开设的垫 片槽中， 而滤膜则位于垫片和滤膜固定装置之间。 5.根据权利要求1所述的微生物分离培养装置， 其特征在于， 所述的培养瓶中设置有培 养支架， 该培养支架包括支杆以及培养盘， 所述培养盘的开口与培养瓶瓶口朝向一致。 6.根据权利要求5所述的微生物分离培养装置， 其特征在于， 所述培养盘的盘面与支杆 呈倾斜设置。 权利要求书 1/1 页 2 C。
6、N 103937662 B 2 微生物分离培养装置及其方法 技术领域 0001 本发明涉及一种微生物分离培养装置及其方法， 属于微生物分离培养技术领域， 主要应用于微生物培养过程的杂菌感染监测； 另外， 本发明所述微生物分离培养装置也可 以用于病菌分离培养， 便于致病菌种类判断。 背景技术 0002 自然界的微生物包括细菌、 真菌、 放线菌、 支原体、 衣原体、 立克次体、 病毒、 螺旋 体。 微生物检测是生命科学领域最基本和最重要的工作。 待检样品中常混杂着多种微生物， 影响目标微生物的分离和培养， 干扰检测结果和效率； 因此， 根据待检样本的特征以及待检 微生物的形态结构、 细胞大小、 培。
7、养条件、 生化特性等， 选择合适的方法对其进行分离、 培 养， 是微生物检测的前提。 0003 在对目标微生物进行分离、 培养时， 常规或传统的方法是采用平皿分离培养法， 使 其能够分散生长形成单一菌落， 以便于观察形态特征或进行生化鉴定。 这种过程一般需2 3种培养基； 除了对标本或者样品进行必要的预处理外， 分离培养一般还需通过特殊的接种 方法来完成； 常用的接种方法有： 分区划线法、 倾注平板法、 菌落分纯法、 斜面接种法、 穿刺 培养法、 液体培养基接种法等； 分离培养的操作繁琐复杂， 人工和材料成本都比较高。 0004 微生物种的多样性和待检样本的复杂性， 使得目标微生物的分离培养工。
8、作成为影 响微生物检测的效率与准确度的一个关键技术。 普通细菌的分离培养可采用上述传统或常 规的平皿分离培养法进行； 而对于支原体、 L型细菌、 某些特殊细菌进行分离培养， 则需要采 用更为完善的方法与技术， 原因在于这类菌种分离效率较低， 培养增殖困难， 从而增加了培 养成本。 0005 支原体是一类缺乏细胞壁、 有别于细菌和病毒的原核微生物， 其体积微小， 直径一 般在0.20.3 m之间， 可通过除菌滤膜。 支原体种类繁多 （约120多种） ， 分布非常广泛， 是人 类和非人类动物以及植物几种常见疾病的病原体， 也是生物制剂生产中最常见的污染物。 工业细胞培养液中存在的支原体污染， 既广。
9、泛又不易被察觉。 支原体生长缓慢， 通常培养比 较困难， 对它的鉴定如果采用液体培养法则假阳性率高， 准确性低； 如果用固体培养法虽然 可以观察到菌落， 但判读结果所需时间较长。 同时使用两相培养法则操作极为繁琐， 且易受 环境微生物污染， 人工及材料的成本较高。 0006 L型细菌是一类细胞壁有缺陷、 且在普通环境中能够生长和致病的细菌， 包括原生 质体(革兰氏阳性菌L型)和原生质球(革兰氏阴性菌L型)， 营养要求与原菌基本相同， 但必 须补充特殊营养物质， 并加入一定浓度稳定剂以提高培养基的渗透压。 某些体积较小的L型 细菌可通过除菌滤膜。 此类细菌生长较缓慢， 培养27天才能在平板上形成。
10、细小菌落， 而在 液体培养基中生长后呈较疏松的絮状颗粒沉于管底。 0007 军团菌系需氧革兰氏阴性杆菌， 大小为(0.30.4) m(23) m， 菌体多形性， 呈杆状或线状， 可通过除菌滤膜。 军团菌包括45个种， 其中以嗜肺军团菌最为常见， 广泛存 在于自然环境中， 在温水里及潮热的地方蔓延， 常隐藏在包淋浴器、 矿泉池、 喷泉以及空调 说明书 1/6 页 3 CN 103937662 B 3 设备的冷却水塔等人工供水系统中。 本菌生长缓慢， 需要35日方见菌落。 分离培养军团 菌， 需先对标本作酸处理杀灭其他杂菌， 并使用富含半肮氨酸和铁的特殊培养基。 发明内容 0008 本发明针对现有。
11、技术的不足， 提供一种微生物分离培养装置， 该分离培养装置利 用能否穿透一般的细菌滤器并在无生命的培养基中生长繁殖等条件， 可以分离得到支原体 和某些细菌， 再通过选择性增殖培养等方法来进行进一步的分离， 这样可以减少操作过程 中的可能污染， 以提高分离效率、 减少各项成本。 0009 为实现以上的技术目的， 本发明将采取以下的技术方案： 0010 一种微生物分离培养装置， 包括两个培养瓶， 每一个培养瓶的底部通过底盖封接， 且两个培养瓶的瓶口之间通过连接件连接， 该连接件沿自身轴线开设通孔， 所述通孔的孔 壁对应于两个培养瓶的瓶口分别设置有一个连接部位， 连接件的两个连接部位之间设置有 过滤。
12、组件安装部位， 该过滤组件安装部位安装有用于过滤目标微生物的过滤组件， 而每一 个培养瓶的瓶口与连接件的相应连接部位之间为可拆卸的密封连接。 0011 作为本发明的进一步改进， 所述的两个培养瓶中， 其中一个培养瓶在另一个培养 瓶的上方， 且两个培养瓶的瓶口相对设置。 0012 作为本发明的进一步改进， 每一个培养瓶的瓶口均设置有外螺纹， 所述连接件的 两个连接部位均包括开设在通孔孔壁上的内螺纹以及紧邻该内螺纹设置的密封槽， 所述培 养瓶瓶口的外螺纹与连接件上对应位置处的内螺纹螺纹配合连接， 同时培养瓶的瓶口端部 通过置于密封槽中的密封件与连接件密封。 0013 作为本发明的进一步改进， 所述。
13、的过滤组件包括滤膜以及滤膜固定装置， 所述的 滤膜固定装置与过滤组件安装部位螺纹配合连接， 而滤膜则通过垫片配装在滤膜固定装置 上， 垫片嵌装在通孔的孔壁紧邻过滤组件安装部位所开设的垫片槽中， 而滤膜则位于垫片 和滤膜固定装置之间。 0014 作为本发明的进一步改进， 所述的培养瓶中设置有培养支架， 该培养支架包括支 杆以及培养盘， 所述培养盘的开口与培养瓶瓶口朝向一致。 0015 作为本发明的进一步改进， 所述培养盘的盘面与支杆呈倾斜设置。 0016 本发明的另一个技术目的是提供一种基于上述微生物分离培养装置的微生物分 离培养方法， 所述微生物分离培养装置中的两个培养瓶， 分别为培养瓶I、 。
14、培养瓶II； 所述微 生物分离培养方法包括以下步骤： 步骤一、 待检样本的消化处理首先， 将待检样本接种 到备有消化培养液的培养瓶 100中； 接着， 通过连接件将培养瓶 100的瓶口与培养瓶300 的瓶口连接， 且培养瓶 100的瓶口、 培养瓶300的瓶口均与连接件密封， 同时连接件中配 装过滤组件； 然后， 以培养瓶 100在下、 培养瓶300在上的状态， 在37度恒温条件下摇瓶培 养1224小时； 步骤二、 消化培养液的倒置过滤分离培养瓶 100在上、 培养瓶300在 下， 通过培养瓶300的抽滤口302进行负压抽滤， 使菌液由培养瓶 100流向培养瓶 300； 步骤三、 含有目标菌株的。
15、富集液体培养通过培养瓶 100的底盖 101向培养瓶 300内加入富集培养液， 在37度恒温条件下培养1224小时； 步骤四、 按照目标菌株的生化 特征判断富集液体培养液中是否含有目标菌株。 0017 作为本发明的进一步改进， 步骤四的判断结果表明富集液体培养液中含有目标菌 说明书 2/6 页 4 CN 103937662 B 4 株， 则继续进行如下操作： 步骤五、 更换新的培养瓶 100、 连接件及连接件内的配件， 再将备 有固体培养基的培养支架800置入新更换的培养瓶 100内， 培养盘801的正面朝向培养瓶 100的瓶壁外侧， 盖好底盖 101； 步骤六、 将步骤五组装好的装置倒置， 。
16、即培养瓶 100在下、 培养瓶300在上， 通过抽滤口 102进行负压抽滤， 使菌液流入培养瓶 100， 菌液浸没培养 支架800， 并接种到培养盘801内的固体培养基上； 步骤七、 将上述装置再次倒置， 即培养瓶 100在上、 培养瓶300在下， 通过抽滤口302进行负压抽滤， 使菌液流入培养瓶300； 步 骤八： 将上述装置置于培养箱内， 并在适合目标菌株的温度下培养2448小时； 步骤九： 观 察培养支架800上培养盘801中的菌落形态。 0018 作为本发明的进一步改进， 在步骤二和步骤六中， 进行负压抽滤时， 将所述瓶盖 101旋松。 0019 作为本发明的进一步改进， 在步骤六中，。
17、 进行负压抽滤时， 将所述瓶盖301旋松。 0020 根据以上的技术方案， 相对于现有技术， 本发明具有以下的优点： 0021 本发明采用连接件， 将用于消化培养的培养瓶和用于富集培养的培养瓶连接， 并 在连接件中配装过滤组件， 该过滤组件是针对目标菌株设置的， 因此， 将消化培养液经过滤 组件过滤后， 理论上即可分离出目标菌株， 且过滤得到的目标菌株能够通过连接件流入用 于富集培养的培养瓶中， 由此可知， 本发明与现有技术相比， 目标菌株的分离以及转移培养 更为便利， 能够减少操作过程中的可能污染， 以提高分离效率、 减少各项成本。 附图说明 0022 图1为本发明所述的微生物分离培养装置的。
18、结构示意图。 0023 图2为图1中局部 的纵切面的放大的示意图。 0024 图3为图2中瓶盖的纵切面的放大的示意图。 0025 图4为图2中瓶盖的立体示意图。 0026 图5为图2中滤膜固定装置的立体示意图。 0027 图6为培养支架实施例一的立体示意图。 0028 图7为培养支架实施例二的立体示意图。 0029 图8为图7的纵切面的示意图。 0030 图9是培养体系中PCO2/PO2的变化曲线， 其中： 横坐标为液体培养基中特定微 生物的细胞数量 （Cell/ml） ， 纵坐标为Index=PCO2/PO2。 0031 其中： 培养瓶 100； 底盖 101； 抽滤口 102； 外螺纹 1。
19、03； 瓶盖200； 通孔201； 内螺纹 211； 内螺纹212； 内螺纹213； 密封槽 221； 密封槽222； 垫片槽223； 培养瓶300； 底 盖301； 抽滤口302； 外螺纹303； 密封圈 401； 密封圈402； 垫片500； 滤膜600； 滤膜固 定装置700； 十字通孔701； 外螺纹702； 培养支架800； 培养盘801； 支杆802。 具体实施方式 0032 附图非限制性地公开了本发明所涉及优选实施例的结构示意图； 以下将结合附图 详细地说明本发明的技术方案。 0033 参见图1至图5， 本发明所述的微生物分离培养装置， 包括瓶口带有外螺纹 103的 培养瓶 10。
20、0与侧壁带有内螺纹 211、 盖中央带有通孔201的瓶盖200以及瓶口设有外螺纹 说明书 3/6 页 5 CN 103937662 B 5 303的培养瓶300。 所述内螺纹 211的顶部内侧设置密封槽 221， 所述密封槽 221内设有 密封圈 401， 所述培养瓶 100的外螺纹 103与瓶盖200的内螺纹 211连接。 所述培养瓶 100 的瓶口肩部设置抽滤口 102， 并在培养瓶 100内设置培养支架800， 如图6图8所示。 所述 培养瓶300的底部设置底盖301、 瓶口肩部设置抽滤口303。 0034 所述瓶盖200的侧壁反向延长、 并在瓶盖200反向延长的侧壁内侧从下往上依次设 。
21、置内螺纹212和内螺纹213， 所述内螺纹212的内直径小于内螺纹213的内直径， 通 孔201的内直径小于内螺纹212的内直径， 内螺纹212的底部内侧设置垫片槽223， 内螺 纹213的底部内侧设置密封槽222， 所述密封槽222内放置密封圈402。 所述瓶盖200 的内螺纹213与培养瓶300的外螺纹303连接。 0035 所述瓶盖200内依次设置垫片500、 滤膜600、 滤膜固定装置700， 所述滤膜固定装置 700为中央开设十字通孔701、 外壁设有外螺纹702的圆柱体， 所述垫片500设置在垫片槽 223内， 滤膜固定装置700的外螺纹702与瓶盖200的内螺纹212连接。 00。
22、36 所述培养瓶 100、 瓶盖200、 培养瓶300、 密封圈 401、 密封圈402、 垫片500、 滤 膜600、 滤膜固定装置700和培养支架800的中心均同轴。 0037 由此可知， 本发明所述的瓶盖200事实上为一连接件， 该连接件具有两个连接部位 （内螺纹 211、 内螺纹213、 密封槽 221、 密封槽222） ， 以分别与培养瓶 100的瓶口和培 养瓶300的瓶口实现密封连接， 且这样的连接方式是可拆卸的， 因此， 除了上述公开的螺 纹连接方式外， 卡扣连接也适用于本发明所述的技术方案； 同时所述的两个连接部位之间， 设置过滤组件安装部位 （内螺纹212） ， 以进行用于分。
23、离待筛选菌株的过滤组件的安装； 过 滤组件包括滤膜600、 滤膜固定装置700， 通过滤膜600的选择， 进行待筛选菌株的分离。 0038 本发明主要用于分离培养支原体、 L型细菌、 衣原体、 少数立克次氏体、 病毒， 因此， 滤膜600可以为一般的细菌滤膜； 上述的支原体、 L型细菌、 衣原体、 少数立克次氏体、 病毒均 可通过一般的细菌滤膜。 0039 以下将以肺炎支原体的分离培养作为案例， 具体地说明上述分离培养装置的使 用。 0040 一、 消化复苏。 0041 步骤一： 将临床痰样本接种到备有消化培养液的培养瓶 100中； 所述消化培养液 为含丰富营养物质、 消化酶及抑菌药物的选择性。
24、增菌、 消化培养液， 该消化培养液具有解离 分散痰样本、 抑制杂菌污染、 释放并复苏肺炎支原体的作用。 0042 步骤二： 培养瓶 100上依次装配设置有密封圈 401、 密封圈402、 垫片500、 滤膜 600、 滤膜固定装置700的瓶盖200和培养瓶300， 盖好底盖301。 0043 步骤三： 将上述装置以培养瓶 100在下、 培养瓶300在上的状态置于摇床上， 在 37度恒温条件下培养1224小时。 0044 二、 富集增殖。 0045 步骤四： 将上述装置倒置， 即培养瓶 100在上、 培养瓶300在下， 通过培养瓶 300的抽滤口302进行负压抽滤， 滤膜600阻隔杂菌， 而使菌。
25、液中的肺炎支原体透过滤膜 600由培养瓶 100流向培养瓶300。 为使菌液流动通畅， 可通过旋松瓶盖 101实现。 0046 步骤五： 通过培养瓶 100的底盖 101向培养瓶300内加入足量的富集培养液， 在 37度恒温条件下培养1224小时； 所述富集培养液， 主要功能是对通过滤膜的某一种特定 说明书 4/6 页 6 CN 103937662 B 6 微生物进行选择性增菌培养， 为含丰富营养物质、 抑菌药物和/或变色指示剂的选择性增 菌、 富集培养液， 可根据检测需要进行配制， ， 对于本实施例而 言， 该富集培养液具有抑制杂菌污染、 富集肺炎支原体、 指示肺炎支原体生长的作用。 004。
26、7 步骤六： 通过肉眼和或仪器观察培养瓶300中培养液的浑浊程度、 颜色变化、 有 无荧光现象， 或加入试剂进行进一步的观察。 0048 “可通过滤膜” 的特定微生物经过前述消化处理、 倒置过滤分离、 液体培养后， 已具 备一定的细胞量； 进行固体增菌培养， 要求微生物的数量在合理的范围， 如数量太少则其在 固体培养基上生长一定时间后， 会过于稀疏或漏检； 如数量太多则会密集成膜， 无法形成单 一菌落， 给后续的生化试验等鉴定带来不便。 选择合适的时机将微生物从液体培养基转接 到固体培养基上至关重要。 支原体生长过程中， 会消耗体系中的氧气， 代谢并向环境中释放 二氧化碳； 因此可以通过监测培。
27、养体系中PCO2/PO2的变化来判断微生物在单位统计中 的数量是否符合要求。 0049 完成步骤六之后， 可采用下列两种方法中的一种或两种， 监测培养体系中PCO2/ PO2的变化， 判断特殊微生物 （例如支原体等） 的在单位统计中的数量： 0050 （1） CO2/O2指示剂： 更换新的培养瓶 、 瓶盖及瓶盖内的配件， 再安装上含有CO2/O2 指示剂的特定装置， 从而判定细胞数； 0051 （2） CO2/O2荧光传感器： 更换新的培养瓶 、 瓶盖及瓶盖内的配件， 再连接CO2/O2荧 光传感器， 通过测定特定物质的荧光特性， 来监测体系中PCO2/PO2的变化， 从而判断细 胞数。 00。
28、52 若体系中的特殊微生物 （例如支原体等） 的细胞数已经达到固体培养的要求， 则继 续进行后续操作。 0053 三、 分离培养。 0054 若在步骤六中， 所述培养瓶300中培养液鉴定为肺炎支原体呈阳性， 则继续进行 如下操作。 0055 步骤七： 更换新的培养瓶 100、 瓶盖200及瓶盖200内的配件， 再将备有固体培养基 的培养支架800置入培养瓶 100内， 培养盘801的正面朝向培养瓶 100的瓶壁外侧， 盖好底 盖 101。 所述固体培养基为分离培养基、 选择性培养基、 生化鉴别培养基中的一种或多种； 这类培养基包括但不限于显色培养基， 或者是一种培养基， 在菌落形成后能和随后加。
29、入的 特定化合物起反应， 并呈现出一些外观的变化， 如： 变色、 产生气泡等； 该类培养基具有分 离， 筛选， 鉴别肺炎支原体的作用。 0056 固体培养基的配制： 富含胱氨酸和铁离子的培养基利于军团菌的生长； 培养基中 加入1020%人或动物血清以提供支原体生长所需的胆固醇； L型细菌必须在生存在高渗环 境中， 立克次氏体和衣原体则必须寄生于细胞内， 不能在人工培养基中生长等。 0057 步骤八： 将上述组装好的装置倒置， 即培养瓶 100在下、 培养瓶300在上， 通过抽 滤口 102进行负压抽滤， 使菌液流入培养瓶 100， 菌液浸没培养支架800， 并接种到培养盘 801内的固体培养基。
30、上。 滤膜600再次起阻隔杂菌的作用。 为使菌液流动通畅， 可通过旋松瓶 说明书 5/6 页 7 CN 103937662 B 7 盖底盖301实现。 0058 步骤九： 将上述装置再次倒置， 即培养瓶 100在上、 培养瓶300在下， 通过抽滤口 302进行负压抽滤， 使菌液流入培养瓶300。 为使菌液流动通畅， 可通过旋松瓶盖 101实 现。 0059 步骤十： 将上述装置置于培养箱内， 并在适合肺炎支原体的温度下培养2448小 时。 0060 步骤十一： 通过肉眼和或仪器观察上述装置内培养支架800上培养盘801中菌落 形态。 0061 另外， 本发明所述的消化培养基、 富集培养基以及固体培养基均是针对目标菌株 进行配制的； 由于本发明主要用于是否感染目标菌株的检测， 因此， 前述的各培养基均是采 用现有技术中的成熟配方； 即本发明的改进点主要在于装置部分以及基于装置的使用方 法。 说明书 6/6 页 8 CN 103937662 B 8 图 1 图 2 说明书附图 1/4 页 9 CN 103937662 B 9 图 3 图 4 说明书附图 2/4 页 10 CN 103937662 B 10 图 5 图 6 图 7 图 8 说明书附图 3/4 页 11 CN 103937662 B 11 图9 说明书附图 4/4 页 12 CN 103937662 B 12 。