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1、(10)申请公布号 CN 101988042 A (43)申请公布日 2011.03.23 CN 101988042 A *CN101988042A* (21)申请号 200910070077.5 (22)申请日 2009.08.06 C12N 1/20(2006.01) C12R 1/13(2006.01) (71)申请人 天津市玄真生物医药科技发展有限 公司 地址 300457 天津市经济技术开发区第三大 街捷达园 2 号 3-402 (72)发明人 李建颖 林翠仪 池凌钰 (54) 发明名称 一株来自汽车排气管的耐高温的好氧反硝化 细菌 C-2 (57) 摘要 本发明为一株来自汽车排气管。
2、的耐高温的好 氧反硝化细菌 C-2。其分离筛选方法是取样、 富 集、 初筛、 复筛、 N2、 N2O 等气体生成的检测、 好氧反 硝化细菌的生长规律的测定、 最佳生长 pH 值的测 定、 最佳生长温度的测定以及好氧反硝化细菌的 形态观察。其性能是菌株 C-2 在培养的 12h 内已 经进入了对数生长期， 其生长速度较快， 从 20h 开 始进入稳定生长期。pH 值在 5.0 8.5 范围内的 生长良好， 最适生长 pH 值为 6.7 7.5。温度在 50条件下， 生长状况最佳， 属于耐高温菌。经试 验， 该菌株在 90的环境下能生长。经革兰氏染 色可知， 为革兰氏阴性短杆菌， 菌体两端浑圆， 。
3、单 独分散排列。通过此菌株的性能检测， 可以看出， 将此菌株应用于工业废弃的处理之上， 会获得巨 大的经济价值， 而从长远意义上讲， 将会对环境保 护工作起到一定程度的推动作用。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 CN 101988042 A1/1 页 2 1. 一株来自汽车排气管的耐高温的好氧反硝化细菌 C-2， 其特征在于是由汽车排气管 中取样分离筛选的。 2. 针对权利要求 1 所述的细菌， 其特征在于菌株 C-2 在培养的 12h 内已经进入了对数 生长期， 其生长速度较快， 从20h开。
4、始进入稳定生长期。 在pH5.08.5范围内的生长良好， 最适生长 pH 值为 6.7 7.5。在 50条件下， 生长状况最佳， 属于耐高温菌。经试验， 该菌 株在90的环境下能生长。 经革兰氏染色可知， 菌株C-2为革兰氏阴性短杆菌， 菌体两端浑 圆， 单独分散排列。 权 利 要 求 书 CN 101988042 A1/3 页 3 一株来自汽车排气管的耐高温的好氧反硝化细菌 C-2 技术领域 0001 本发明涉及工业微生物领域， 更具体的说， 是涉及一种优良微生物的选育。 背景技术 0002 反硝化细菌是指能够将 NO3-还原为气态氮的细菌， 多为异养、 兼性厌氧细菌， 如反 硝化杆菌、 斯。
5、氏杆菌、 萤气极毛杆菌等。它们广泛分布于土壤、 厩肥和污水中。 0003 反硝化机理 0004 适宜的脱氮菌在有外加碳源的情况下， 以氮氧化物为氮源， 将氮氧化物同化合成 为有机氮化合物， 成为菌体的一部分 ( 合成代谢 )， 脱氮菌本身获得生长繁殖 ； 而异化反硝 化作用 ( 分解代谢 ) 则将 NOx 最终还原成氮气。 0005 NOx中NO2和NO溶解于水的能力差别较大， 因此净化机理也不同。 NO不与水反应， 溶解度很小， 亨利系数 17.1 31.4Pa(0 30 )， 其净化途径可能有两条 ： 一是 NO 溶解于 水 ； 二是被反硝化细菌吸附， 然后在其氧化氮还原酶的作用下被还原为。
6、 N2。NO2先溶于水形 成 NO3-、 NO2-及 NO， 化学反应式为 ： 0006 2NO2+H2O HNO3+HNO2 0007 3HNO2 HNO3+2NO+H2O 0008 NO3-在微生物硝酸盐还原酶的作用下还原为NO2-， NO2-在亚硝酸盐还原酶的作用下 再还原为 NO， 最后 NO 被吸附在微生物表面后， 在氧化氮还原酶的作用下被还原为 N2。 0009 脱氮微生物的种类很多且差别较大。 许多属都有脱氮种， 其类型有异养脱氮菌、 专 性自氧菌和兼性自养菌。其中数量最多的异养脱氮菌， 包括无色杆菌属 (Achromobacter)、 产碱杆菌属 (Alcaligenes)、 。
7、杆菌属 (Bacillus)、 色杆菌属 (Chromobacterium)、 棒杆菌属 (Corynebacrerium)、 盐杆菌属 (Halobacterium)、 生丝杆菌属 (Hyphomicrobium)、 微球菌 属 (Micrococcus)、 莫拉氏菌属 (Moraxella)、 丙酸杆菌属 (Propionibacterium)、 假单胞菌 属(Pseudomonas)、 螺菌属(Spirillum)、 黄单胞菌属(Xanthomonas)。 这些异养脱氮菌有些 是专性好氧菌， 有些是兼性厌氧菌， 它们在好氧、 厌氧或缺氧条件下， 利用有机物进行脱氮。 此外， 还有少量专性。
8、和兼性的化能自养菌也能还原 NOx。如硫杆菌属 (Thiobacillus) 中的 脱氮硫杆菌(T.denitrificans)利用无机基质， 如H2、 H2S和S、 亚硫酸盐、 硫代硫酸盐等作为 氢受体， 能在厌氧条件下利用 NO3-或 NO2-作为氢受体， 使处于还原价位的含硫化合物氧化， 而把 NO2-和 NO3-还原成 N2。 0010 好氧反硝化细菌的发现 0011 20 世纪 80 年代， Robert son 等人报道了好氧反硝化细菌和好氧反硝化酶系的存 在， 并证实了泛养硫球菌 Thiosphaera pantot ropha( 现更名为脱氮副球菌 Paracoccus den。
9、it rif ications) 在生长过程中， O2和 NO3-共同存在时， 其生长速率比两者单独存在时 都高。 目前， 越来越多的研究证明细菌好氧反硝化的存在， 并发现了一些在有氧条件下有较 高反硝化率的细菌。 0012 好氧反硝化细菌作用机制的电子理论 说 明 书 CN 101988042 A2/3 页 4 0013 早期理论认为， O2的得电子能力阻止了电子传递给NO3-或NO2-， 从而抑制了反硝化 的进行。而最近研究表明， 细菌反硝化酶系和有氧呼吸系统同时存在。NO3-被还原的同时， O2被还原， 氧不是抑制反硝化酶活性和反硝化酶生成的直接因素。缺少 NO3-或 O2都会降低 细菌。
10、的生长率和反硝化率。Wilson 等人提出了细菌反硝化过程中的电子传递模型 ( 图 1)。 从图 1 中可以看出 ： NO3-、 O2均可作为电子最终受体。反硝化菌可将电子从被还原的物质传 递给 O2， 同时也可通过硝酸还原酶将电子传递给 NO3-。 0014 鉴于当前关于好氧反硝化细菌大多从土壤或活性污泥中分离筛选， 而在我国， 氮 氧化物的第二大来源来自于汽车废气， 于是申请人将取样目标定位在汽车排气管， 从中分 离筛选好氧反硝化细菌。 发明内容 0015 本发明是为了证明微生物的分布广， 种类多， 在前人的研究基础上， 尝试从汽车排 气管中分离筛选出性能优良的好氧反硝化细菌， 并且分离得。
11、到了该菌株。 0016 本发明通过下述技术方案实现 ： 0017 培养基 0018 (1) 富 集 培 养 基 SM(L) ：丁 二 酸 钠 2.84g、 NaNO3 0.67g、 KH2PO4 1.36g、 (NH4)2SO40.24g、 酵母粉 1.00g、 MgSO47H2O 0.19g， 1ml 微量元素溶液， pH 7.2。 0019 (2) 鉴别培养基 BTB(L) ： L- 天门冬酰胺酸 1.00g、 KNO3 1.00g、 KH2PO4 1.00g、 FeCl36H2O 0.05g、 CaCl22H2O 0.20g、 MgSO47H2O 1.00g， 1mL 溴百里酚兰 (BT。
12、B) 储备液 (1的 BTB 乙醇溶液 )， 琼脂 20.00g， pH 7.0-7.3 0020 (3) 菌种驯化及细菌反硝化能力测试培养基 DM(L) ： 丁二酸钠 4.72g、 NaNO30.67g、 KH2PO4 1.50g、 Na2HPO4 0.42g、 MgSO47H2O 1.00g， 2ml 微量元素溶液， pH 7.2， 固体培养 基中时加入 20.00g 琼脂粉。 0021 (4) 微量元素溶液 (L) ： CuSO45H2O 4.00g、 FeSO47H2O 0.70g、 FeCl36H2O7.00g、 CoCl26H2O 0.20g、 NaMoO42H2O 3.40g 和。
13、 CaCl22H2O 2.00g。 0022 (1)富集培养 ： 从汽车排气管取样品0.5g， 加入盛有50mL SM培养基的250mL锥形 瓶中， 在 30、 120r/min 条件下富集培养 3 天， 将 2mL 培养物接种到新鲜的 SM 培养基， 以相 同的条件进行培养。如此重复 3 次。 0023 (2) 初筛 ： 富集培养物在 BTB 培养基 (BTB 培养基中加入丁二酸钠 8.50g/L) 上划 线培养， 30培养 1 3 天。挑取使 BTB 培养基呈现蓝色的菌落进行复筛。 0024 (3) 复筛 ： 将初筛菌落在 DM 培养基上划线分离 3 次， 以获得纯培养物， 并依据菌种 在。
14、 DM 培养基的生长情况， 挑选生长旺盛的菌株， 之后通过测定各菌株的反硝化能力进行复 筛， 反硝化能力的检测主要分亚硝酸盐生成和 N2、 N2O 等气体生成的检测。 0025 (4)N2、 N2O 等气体生成的检测 ： 参照细菌糖类发酵试验的方法进行， 即将具有反硝 化能力的细菌纯培养物接种到盛有10mL DM培养液、 且放置有小倒管的大试管中， 37连续 培养， 每天观察产气情况。 0026 (5) 好氧反硝化细菌的生长规律的测定 ： 在容积为 250mL 的锥形瓶中， 加入 DM 培 养液 100mL， 接种 1mL 菌悬液 (OD 1)， 在 30、 120r/min 条件下培养， 每。
15、隔 4h 取一次样在 波长 540nm 处用 722S 型可见分光光度计测其光密度。 说 明 书 CN 101988042 A3/3 页 5 0027 (6) 最佳生长 pH 值的测定 ： 配制不同 pH 值的 DM 培养液， 各取 30mL 分装到容积 250mL 的锥形瓶中， 接种 0.5mL 菌悬液， 30、 120r/min 条件下培养 20h， 以 DM 培养液作空 白， 在波长 540nm 处测定菌悬液的光密度。 0028 (7) 最佳生长温度的测定 ： 将 pH7.2 的 DM 培养液 30ml 置于 250mL 锥形瓶中， 接种 0.5mL菌悬液， 分别在10、 15、 20、。
16、 25、 30、 37、 50和60条件下培养20h， 在波 长 540nm 处测定其光密度值。 0029 (8) 好氧反硝化细菌的形态观察 - 革兰氏染色镜检 . 0030 本发明具有以下技术效果 0031 1、 分离筛选得到好氧反硝化细菌功能性菌株 C-2。 0032 2、 菌株 C-2 在培养的 12h 内已经进入了对数生长期， 其生长速度较快， 从 20h 开始 进入稳定生长期。 0033 3、 菌株 C-2 在 pH5.0-8.5 范围内的生长良好， 最适生长 pH 值为 6.7-7.5。 0034 4、 菌株 C-2 在 50条件下， OD 值最大， 生长状况最佳， 属于耐高温菌。经试验， 该 菌株在 90的环境下能生长。 0035 5、 经革兰氏染色可知， 菌株 C-2 为革兰氏阴性短杆菌， 菌体两端浑圆， 单独分散排 列。 具体实施方式 0036 以下结合具体实施例对本发明详细说明。 0037 实施例 1 ： 工艺流程 ： 0038 取样富集初筛复筛 N2、 N2O 等气体生成的检测好氧反硝化细菌的生长 规律的测定最佳生长 pH 值的测定最佳生长温度的测定好氧反硝化细菌的形态观察 得到好氧反硝化细菌 C-2。 说 明 书 CN 101988042 A1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 。