技术领域
本发明涉及一种动脉血管模拟微流控装置及其应用，属于生物医药技 术领域。
背景技术
异常血流动力学因素是导致心脑血管疾病的关键危险因子之一，但其 作用机理尚不清楚，而传统研究方法的局限性阻碍了相关研究进展。近年 来，血管体外研究模型的建立和应用大大促进了相关研究的进展。血管的 血流动力学体外研究模型可以根据它们模拟血液流经血管时产生力学刺 激的种类分为三类，即流体剪切力模型、牵张应力模型、流体剪切力和牵 张应力共同作用模型。流体剪切力模型主要是采用层流板，液体通过开口 于两侧的液体进口和出口对种植在基底的细胞施加流体剪切应力；而牵张 应力模型则通过弹性膜或板的形变对粘附在上面的细胞施加机械拉伸刺 激。前两种模型可以探讨细胞在单一力学刺激情况下的行为变化，然而， 细胞所处的生物体内是一个有着多种力学刺激的复杂环境，一个更接近体 内环境的心血管系统体外研究模型必须考虑多种力学刺激对细胞的作用。 近年来，人们设计和改进了一些能够同时施加流体剪切力和牵张应力的装 置(Moore，J.E.，Burki，E.，Suciu，A.，Zhao，S.M.，Burnier，M.，Brunner，H.R. and Meister，J.J.(1994)A Device for Subjecting Vascular Endothelial-Cells to Both Fluid Shear-Stress and Circumferential Cyclic Stretch.Ann Biomed Eng. 22，416-422；Qiu，Y.C.and Tarbell，J.M.(2000)Interaction between wall shear stress and circumferential strain affects endothelial cell biochemical production.J Vasc Res.37，147-157；Toda，M.，Yamamoto，K.，Shimizu，N.， Obi，S.，Kumagaya，S.，Igarashi，T.，Kamiya，A.and Ando，J.(2008) Differential gene responses in endothelial cells exposed to a combination of shear stress and cyclic stretch.J Biotechnol.133，239-244)，其最基本的原理 就是用内壁贴附了内皮细胞的硅橡胶管模拟血管，在管腔内保持一定压力 的情况下通过管腔的扩张给粘附的细胞施加牵张应力，同时通过液体的冲 刷给细胞施加剪切应力。但是，上述装置的缺点也很明显，即细胞在管壁 的粘附不好控制、不能对细胞在力学刺激下的行为进行实时观察以及干预 等，这些问题也制约着相关研究的进展。近年来，微流控技术的快速发展 为许多疾病病理研究模型的建立提供了契机，微流控芯片可以为细胞提供 更接近于生理、病理条件下的微环境，可以结合表面化学和软刻蚀技术对 细胞行为进行操控和干预，还可以在细胞群体和单细胞两种水平对细胞的 行为变化进行观察和分析。Huh等(Huh，D.，Matthews，B.D.，Mammoto，A.， Montoya-Zavala，M.，Hsin，H.Y.and Ingber，D.E.(2010)Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip.Science.328，1662-1668)采用的微流 控装置可以对贴附在膜上的细胞产生流体剪切力和拉伸力，其用途是 模拟和研究肺泡功能，其制作工艺相对比较复杂，由于膜没有支撑物，容 易变形，显微镜下不易观察细胞形态和变化过程。Douville等(Douville，N. J.，Zamankhan，P.，Tung，Y.C.，Li，R.，Vaughan，B.L.，Tai，C.F.，White，J.， Christensen，P.J.，Grotberg，J.B.and Takayama，S.(2011)Combination of fluid and solid mechanical stresses contribute to cell death and detachment in a microfluidic alveolar model.Lab Chip.11，609-619)采用的微流控装置同样 可以提供流体剪切力和机械拉伸力，其用途也是模拟和研究肺泡的结构和 功能，可以形成气液界面，模拟肺泡细胞的微环境。然而，上述的微流控 装置只适合做肺泡模型，微流控血管模型尚无文献报道。而用于微流控血 管生理病理机理的研究模型国内外尚无专利申请。
发明内容
因此，本发明的目的是针对现有的模拟动脉血管生理病理状态的体外 模型有的不能同时提供流体剪切力和机械拉伸力两种刺激，有的不利于动 态观察和分析，而微流控血管体外模拟装置目前尚属空白的不足，设计一 种能够同时提供流体剪切力和机械拉伸力的微流控装置及其应用，能够构 建某些生理、病理机理研究的体外模型，为相关的研究提供有效工具。针 对上述目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供一种动脉血管模拟微流控装置，该装置包括透明 的微流通道模块和与其相适配的透明的负压产生模块，所述微流通道模块 底部和负压产生模块顶部通过弹性膜相连接，所述微流通道模块用于流体 流动，所述负压产生模块用于产生使弹性膜发生形变的负压；
所述微流通道模块顶部设有流体入口和流体出口，所述流体入口和流 体出口分别通过与流体入口和流体出口相适配的第一PE管连接于微流通 道模块底部的微流通道，并与其相贯通；
所述负压产生模块顶部设有负压凹槽，所述负压凹槽设于微流通道的 下方，从而形成与微流通道相隔离的单独的空间，所述负压产生模块顶部 设有一气路开口，所述气路开口通过与其相适配的第二PE管与负压凹槽 相连。
优选地，所述负压凹槽一侧还设有与其相贯通的负压缓冲池，所述第 二PE管通过负压缓冲池与负压凹槽相连。
优选地，所述负压缓冲池通过一凹槽与负压凹槽相贯通，优选地，所 述第二PE管垂直连接于负压缓冲池底部。
优选地，所述负压凹槽中间围绕成一个长方形平台，与所述弹性膜紧 贴并对应于其上方的所述微流通道，所述长方形平台和弹性膜间填充有液 体润滑剂，用于使在负压的作用下发生相互移动。
优选地，所述长方形平台长为1.5×104μm，宽为1.0×103μm所述负 压产生模块顶部和底部封合为一体结构。
优选地，所述微流通道呈第二长方体结构，其由第三、第四侧壁和微 流通道底部和微流通道底部构成，所述微流通道底部由弹性膜构成，优选 地，所述第二长方体的长为1.8×104μm，宽为1.5×103μm，高为0.5× 103μm。
优选地，所述微流通道模块的顶部和底部通过第一、第二侧壁连接成 水平方向贯通的第一长方体结构，优选地，所述第一长方体的长为2.5-3.0 ×104μm，宽2.0-2.5×103μm，高为3.0-5.0×103μm。
优选地，所述微流通道模块、负压产生模块和弹性膜均由聚二甲基硅 氧烷(PDMS)材料制成。
优选地，所述流体入口和流体出口均为圆形孔，优选地，所述圆形孔 的直径为8.0×102μm；所述第一PE管垂直连接于所述微流通道模块底部 的微流通道。
优选地，所述负压产生模块的顶部呈长方形，该长方形的长为2.5-3.0 ×104μm，宽为2.0-2.5×104μm，所述负压凹槽呈第三长方体结构，其截面 为长方形，高为5×102μm，宽为2.5×102μm；所述负压缓冲池呈垂直于 平台区的圆柱形空腔状，所述圆柱形空腔的直径为5.0×103μm，高为1.0 ×103μm；所述凹槽呈第四长方体结构，其长为3.0×103μm，宽为5×102μm， 高为5×102μm；所述气路开口为圆形孔气路开口，优选地，所述圆形孔气 路开口的直径为8.0×102μm。
优选地，所述微流通道模块和负压产生模块长均为2.5-3.0×104μm， 宽均为2.0-2.5×104μm，厚均为3.0-5.0×103μm；所述弹性膜为长2.5-3.0 ×104μm，宽2.0-2.5×104μm，厚为10-100μm。
另一方面，本发明提供了一种动脉血管模拟微流控装置在动脉血管生 理病理机制研究或药物筛选中的应用。
又一方面，本发明提供了一种动脉血管模拟微流控装置在制备用于生 物检测的试剂盒中的应用，优选地，所述试剂盒为动脉血管生理病理机制 研究或药物筛选的试剂盒。
再一方面，本发明提供一种用于生物检测的试剂盒，该试剂盒包括根 据本发明的动脉血管模拟微流控装置，还包括检测试剂和缓冲液，优选地， 所述检测试剂为血管活性小分子、细胞因子、抗体或用于筛选的药物。
本发明的有益效果为：基于微流控技术，通过合理设计和整合微流通 道模块、弹性膜、负压产生模块的微流控装置，能够同时提供流体剪切力 和机械拉伸力，建立动脉粥样硬化体外研究模型，为相关研究提供有效工 具，体积小，结构简单，易于制作和使用；光学透明材料制作，易于肉眼 或镜下观察通道内的情况，可以在显微镜和培养箱之间任意转换，可以实 现对细胞在两种力学刺激下以及化学刺激下的原位动态监测，两种力学刺 激的大小、频率随时可调，可以随时改变细胞的化学微环境。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明所述的动脉血管模拟微流控装置的结构示意图；
图2为本发明所述的动脉血管模拟微流控系统的结构示意图；
图3为所述弹性膜放置于本发明所述的动脉血管模拟微流控装置(只 有负压产生模块)进行拉伸的实验结果示意图，图中a为拉伸前的弹性膜 的结果示意图，图中b为拉伸后的弹性膜的实验结果示意图；
图4为将大鼠骨髓基质干细胞(MSC)输入本发明所述的动脉血管模 拟微流控装置后与MSC细胞单独拉伸和单独剪切进行对比的实验结果示 意图，图中a为MSC细胞单独拉伸的实验结果示意图，b为MSC细胞单 独剪切的实验结果示意图，c为MSC细胞在本发明的装置中经拉伸和剪切 后的实验结果示意图；
其中：
1为微流通道模块，101为微流通道模块的顶部，102为微流通道模块 的底部，103为第一侧壁，104为第二侧壁，105为流体入口，106为流体 出口，107为第一PE管，108为微流通道，1081为微流通道顶部、1082 为微流通道底部、1083为第三侧壁、1084为第四侧壁；
2为弹性膜；
3为负压产生模块，301为负压产生模块的底部，302为负压产生模块 的顶部，303为负压凹槽，304为气流开口，303负压凹槽，305为第二PE 管，306负压缓冲腔，307为凹槽、308为长方形平台；
4为动脉血管模拟微流控装置；5为细胞培养驱动系统；6为负压发生 器。
具体实施方式
如图1所示，本发明所述的动脉血管模拟微流控装置4，该装置包括 透明的微流通道模块1和与其相适配的透明的负压产生模块3，所述微流 通道模块底部和负压产生模块顶部通过弹性膜2经等离子氧化处理共价键 合，所述微流通道模块1、负压产生模块3和弹性膜2均由聚二甲基硅氧 烷(PDMS)材料制成，所述弹性模2为长2.5-3.0×104μm，宽2.0-2.5× 104μm，厚为10-100μm的弹性模2，所述微流通道模块1用于液体流动， 所述负压产生模块3用于产生使弹性膜2发生形变的负压；所述微流通道 模块顶部101和底部102通过第一、第二侧壁103、104连接成水平方向 贯通的第一长方体结构，所述第一长方体的长为2.5-3.0×104μm，宽2.0-2.5 ×104μm，高为3.0-5.0×103μm，所述微流通道模块长为2.5-3.0×104μm， 宽为2.0-2.5×104μm，厚为3.0-5.0×103μm，所述微流通道模块顶部101 设有流体入口105和流体出口106，所述流体入口105和流体出口106分 别通过与流体入口105和流体出口106相适配的第一PE管107垂直连接 于微流通道模块底部102的微流通道108，所述微流通道108呈第二长方 体结构，其由微流通道顶部、底部1081、1082和第三、第四侧壁1083、 1084构成，并与其相贯通，所述微流通道底部由弹性膜构成，所述第二长 方体的长为1.8×104μm，宽为1.5×103μm，高为5.0×102μm，所述流体入 口105和流体出口106均为圆形孔，所述圆形孔的直径为8.0×102μm；所 述负压产生模块3的底部301和顶部302封合而成一体结构，所述负压产 生膜块为长2.5-3.0×104μm，宽2.0-2.5×104μm，厚为3.0-5.0×103μm的 PDMS模块，所述负压产生模块顶部302设有负压凹槽303，所述负压凹 槽303设于微流通道108的下方，从而形成与微流通道108相隔离的单独 的空间，所述负压产生模块顶部302设有一个气流开口304，所述气路开 口304通过与其相适配的第二PE管305与负压凹槽303相连，所述负压 凹槽303中间围绕成一长方形平台308，与所述弹性膜2紧贴并对应于其 上方的所述微流通道108，所述长方形平台308长为1.5×104μm，宽为1.0 ×103μm，所述长方形平台308与弹性膜2不键合，添加液体润滑剂，使 之在负压作用下相互之间可以移动；所述负压凹槽303一侧还设于与其相 贯通的负压缓冲池306，所述第二PE管305通过负压缓冲池306与负压 凹槽303相连，所述负压缓冲池306通过一凹槽307与负压凹槽303相贯 通，所述第二PE管305垂直连接于负压缓冲池306底部，，所述负压产生 模块的顶部302呈长方形，该长方形的长为2.5-3.0×104μm，宽为2.0-2.5 ×104μm，所述负压凹槽303呈第三长方体结构，其截面为长方形，高为 5.0×102μm，宽为2.5×102μm；所述负压缓冲池306呈垂直于底部301的 圆柱形空腔状，所述圆柱形空腔的直径为5.0×103μm，高为1.0×103μm； 所述凹槽307呈第四长方体结构，其长为3.0×103μm，宽为5.0×102μm， 高为5.0×102μm；所述气路开口304为圆形孔气路开口，所述圆形孔气路 开口304的直径为8.0×102μm。
如图2所示，本发明所述的动脉血管模拟微流控的系统，包括上述所 述的动脉血管模拟微流控装置4，还包括细胞培养驱动系统5和负压发生 器6，所述细胞培养驱动系统5通过流体入口105和流体出口106与微流 通道108连接，所述细胞培养驱动系统5驱动微流通道108内的液体流动； 所述负压发生器6通过第二PE管305连接至气流开口304与负压发生模 块连接，用于使负压发生模块产生负压。
使用时，首先通过微流通道模块1的流体入口105将细胞悬液加入微 流通道108，在37℃，5％二氧化碳条件下，使细胞贴壁于微流通道108 底部的弹性膜2上，然后，将微流通道108的流体入口105和流体出口106 与细胞培养基驱动系统5连接；再将负压产生模块3的气路开口304通过 第二PE管和负压发生器6连接，然后，开动细胞培养基驱动系统5，细 胞培养基驱动系统5可以驱动微流通道108内的液体流动，从而对微流通 道108内基底上附着的细胞产生流体剪切力，而负压发生器6产生的负压 可以通过第二PE管305传导入负压产生模块3内的负压凹槽303内，使 负压凹槽303上方的弹性膜2发生形变，从而拉动贴于长方形平台的弹性 膜2，使之发生水平方向的形变，从而使贴附在上面的细胞受到机械拉伸 力。由于弹性膜2在平行于通道长轴方向上的形变非常小，可以忽略不计， 施加在弹性膜2以及弹性膜上细胞的力主要是垂直于通道长轴方向的，因 此，细胞的受力情况为：平行于通道方向的流体剪切力和垂直于通道方向 的机械拉伸力。
具体试验实施例
试验实施例1
将弹性膜(PDMS膜)(其上面印有荧光标记的蛋白阵列)放置于本 发明所述的动脉血管模拟微流控装置进行拉伸，结果如图3所示，经负压 拉伸后弹性膜，与拉伸前的弹性膜相比，拉伸率达25％，其拉伸率和均匀 性能够达到预期效果，完全可以满足模拟体内试验的需要。
试验实施例2
将MSC细胞(大鼠骨髓基质干细胞，取自SD大鼠(购自北京维通利 华实验动物公司)，提取方法参考以下文献进行：Bosnakovski D，Mizuno M， Kim G，Takagi S，Okumura M，Fujinaga T.Isolation and multilineage differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells.Cell Tissue Res 2005；319：243-53.)输入本发明所述的动脉血管模拟微流控装置，与MSC 细胞单独拉伸和单独剪切的结果相比，如图4所示，从该图可以看出单独 拉伸可以使细胞的骨架沿拉伸力平行方向排列，而单独流体剪切力可以使 细胞骨架沿剪切力方向排列；拉伸力和流体剪切力的合力则可使细胞骨架 的排列呈现与合力方向相同的趋势。因此，流体剪切力和拉伸力对血管内 细胞的排列有重要影响，从而说明本发明的动脉血管模拟微流控装置为相 关研究的有力工具。