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1、(10)授权公告号 CN 102241790 B (45)授权公告日 2013.03.06 CN 102241790 B *CN102241790B* (21)申请号 201110156977.9 (22)申请日 2011.06.13 C08B 37/08(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61K 31/704(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 中山大学 地址 510275 广东省广州市新港西路 135 号 (72)发明人 邓俊杰 张黎明 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 。
2、限公司 44245 代理人 裘晖 耿曼 (54) 发明名称 一种两亲性壳聚糖衍生物及其制备方法和应 用 (57) 摘要 本发明公开了一种两亲性壳聚糖衍生物 PAMAM-Cs-DCA， 本发明通过点击化学反应和酰胺 化反应将 PAMAM 基元和脱氧胆酸基元先后接枝到 壳聚糖主链上， 制备出 PAMAM-Cs-DCA， 该制备方 法反应条件温和、 高效、 有选择性， 本发明还公开 了两亲性壳聚糖衍生物在制备抗癌药物载体中的 应用， 两亲性壳聚糖衍生物在水溶液中自组装形 成以PAMAM基元和壳聚糖为亲水外壳、 DCA基元为 疏水内核的纳米胶束。其内核可以包裹疏水抗癌 药物， 外壳可复合 pDNA， 。
3、从而实现药物和基因的 共传递。两亲性壳聚糖衍生物独特的分子结构使 其在基因治疗、 药物控释和组织工程等领域具有 潜在应用价值。 (51)Int.Cl. 审查员 王海 权利要求书 3 页 说明书 12 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 3 页 说明书 12 页 附图 3 页 1/3 页 2 1. 一种两亲性壳聚糖衍生物 PAMAM-Cs-DCA， 其特征在于 ： 所述的 PAMAM-Cs-DCA 以 PAMAM 基元和壳聚糖为亲水外壳， 脱氧胆酸基元为疏水内核， 所述的壳聚糖的重均分子量为 10000 14000， 脱乙酰度为 70 90 ； 。
4、所述的 PAMAM 基元的接枝率为 10 20， 脱氧胆 酸基元的接枝率为 6 12 ； 所述的 PAMAM-Cs-DCA 的分子式为 ： 所述的 PAMAM 基元的结构式为 ： 2.权利要求1所述的一种两亲性壳聚糖衍生物PAMAM-Cs-DCA的制备方法， 其特征在于 权 利 要 求 书 CN 102241790 B 2 2/3 页 3 包括以下操作步骤 ： (1)6- 叠氮 -N- 氨基 - 壳聚糖 -g- 脱氧胆酸接枝聚合物的合成 ： a 氮气保护下， 将壳聚糖溶于 N， N- 二甲基甲酰胺与水的混合溶剂中， 加入邻苯二甲酸 酐， 在 100 120下搅拌反应 8 10 小时， 反应结束。
5、后， 冷却至 25 30， 用冰水沉淀， 过滤， 用甲醇洗涤， 真空干燥， 得到 N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖 ； b 氮气保护下， 将 N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖溶于 N- 甲基 - 吡咯烷酮中， 搅拌溶解， 在冰水浴中， 加入 N- 溴代琥珀酰亚胺和三苯基膦， 在 70 80搅拌反应 4 6 小时， 反应 结束后， 将产物离心， 过滤， 用丙酮洗涤， 真空干燥， 得到 6- 溴代 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚 糖 ； c 氮气保护下， 将叠氮钠和 6- 溴代 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖溶于 N- 甲基 - 吡咯烷 酮中， 在 60 80搅拌反应 8 12 小时， 反应。
6、结束后， 将产物过滤， 用乙醇沉降， 离心收集 产物， 并用丙酮洗涤， 真空干燥， 得到 6- 叠氮 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖 ； d 氮气保护下， 将 6- 叠氮 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖溶于一水合肼与 N- 甲基 - 吡咯 烷酮的混合溶剂中， 在 90 100搅拌反应 4 5 小时， 反应结束后， 将反应产物用乙醇沉 降， 洗涤， 真空干燥， 得到 6- 叠氮 -N- 氨基 - 壳聚糖 ； e 将 6- 叠氮 -N- 氨基 - 壳聚糖溶于质量百分比 1 3的醋酸溶剂中， 加入稀释溶剂 乙醇， 并滴入脱氧胆酸和 1- 乙基 -(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳二亚胺盐酸盐溶于。
7、乙醇形成的 溶液， 在2530中搅拌反应2428小时， 反应结束后， 使用乙醇和氨水混合溶剂沉淀产 物， 真空干燥， 得到 6- 叠氮 -N- 氨基 - 壳聚糖 -g- 脱氧胆酸接枝聚合物 ； (2)PAMAM-Cs-DCA 的合成 ： 将步骤 (e) 得到的 6- 叠氮 -N- 氨基 - 壳聚糖 -g- 脱氧胆酸接枝聚合物和 PAMAM 基元 溶于二甲基亚砜与水的混合溶剂中得到反应液， 搅拌充分溶解， 氮气保护下， 将五水硫酸铜 与抗坏血酸钠溶于水形成的混合溶液滴入反应液中， 升温到 50 55并在氮气保护下搅 拌反应 24 28 小时， 反应结束后， 将反应产物透析， 过滤并冷冻干燥得到 。
8、PAMAM-Cs-DCA。 3.根据权利要求2所述的一种两亲性壳聚糖衍生物PAMAM-Cs-DCA的制备方法， 其特征 在于 ： 步骤 a 中所述的 N， N- 二甲基甲酰胺与水的体积比为 95 5 90 10， 壳聚糖溶于 N， N- 二甲基甲酰胺与水的混合溶剂形成的质量体积比浓度为 0.05 0.06g/ml， 邻苯二甲 酸酐溶于 N， N- 二甲基甲酰胺与水的混合溶剂形成的质量体积比浓度为 0.15 0.20g/ml。 4.根据权利要求2所述的一种两亲性壳聚糖衍生物PAMAM-Cs-DCA的制备方法， 其特征 在于 ： 步骤 b 中所述的 N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖、 N- 溴代琥。
9、珀酰亚胺与三苯基膦的质量 比为 1 (6 7) (10 12)， N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖溶于 N- 甲基 - 吡咯烷酮形成 的质量体积比浓度为 10 20mg/ml。 5. 根据权利要求 2 所述的一种两亲性壳聚糖衍生物 PAMAM-Cs-DCA 的制备方法， 其 特征在于 ： 步骤 c 中所述的 6- 溴代 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖和叠氮钠的质量比为 1 (1.8 2.2)， 6- 溴代 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖溶于 N- 甲基 - 吡咯烷酮形成的质 量体积比浓度为 0.01 0.02g/mL。 6. 根据权利要求 2 所述的一种两亲性壳聚糖衍生物 PAMAM-。
10、Cs-DCA 的制备方法， 其特 征在于 ： 步骤 d 中所述的混合溶剂中 N- 甲基 - 吡咯烷酮与一水合肼的体积比为 1 (1 1.2)， 6-叠氮-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于一水合肼与N-甲基-吡咯烷酮的混合溶剂 权 利 要 求 书 CN 102241790 B 3 3/3 页 4 形成的质量体积比浓度为 5 6mg/mL。 7.根据权利要求2所述的一种两亲性壳聚糖衍生物PAMAM-Cs-DCA的制备方法， 其特征 在于 ： 步骤 e 中所述的 6- 叠氮 -N- 氨基 - 壳聚糖、 脱氧胆酸与 1- 乙基 -(3- 二甲基氨基丙 基 ) 碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为 1 (3 4) (。
11、1 1.2)， 6- 叠氮 -N- 氨基 - 壳聚糖溶 于质量百分比 1 3的醋酸溶剂形成的质量体积比浓度为 10 15mg/mL， 稀释溶剂乙醇 与质量百分比 1 3的醋酸的体积比为 1 (1 1.2)， 脱氧胆酸溶于乙醇形成质量体积 比浓度为 310 430mg/mL， 乙醇和氨水混合溶剂中乙醇与氨水的体积比为 7 3 8 2。 8. 根据权利要求 2 所述的一种两亲性壳聚糖衍生物 PAMAM-Cs-DCA 的制备方法， 其特 征在于 ： 步骤 (2) 中所述的二甲基亚砜与水的体积比为 (5 6) 1， 6- 叠氮 -N- 氨基 - 壳 聚糖 -g- 脱氧胆酸接枝聚合物溶于二甲基亚砜与水的。
12、混合溶剂形成的质量体积比浓度为 4 5mg/mL， PAMAM 基元溶于二甲基亚砜与水的混合溶剂形成的质量体积比浓度为 100 150mg/ml， 五水硫酸铜与抗坏血酸钠的摩尔比是 1 (2 2.5)， 五水硫酸铜与抗坏血酸 钠溶于水形成的混合溶液滴入反应液后五水硫酸铜与最终溶剂形成的质量体积比浓度为 2.5 3mg/mL， 透析条件为 3000 5000Da 透析袋透析 36 60 小时。 9. 权利要求 1 所述的一种两亲性壳聚糖衍生物 PAMAM-Cs-DCA 在制备抗癌药物载体中 的应用。 10.根据权利要求9所述的一种两亲性壳聚糖衍生物PAMAM-Cs-DCA在制备抗癌药物载 体中的。
13、应用， 其特征在于 ： 所述的抗癌药物是阿霉素， 应用方法包括以下操作步骤 ： 将 PAMAM-Cs-DCA 溶于二甲基亚砜溶剂中， PAMAM-Cs-DCA 质量浓度为 5 6mg/mL， 滴 入由盐酸阿霉素及三乙胺溶于二甲基亚砜溶剂形成的混合溶液， 混合溶液中盐酸阿霉素 与三乙胺的摩尔比为 1 (3 5)， 盐酸阿霉素质量浓度为 3 5mg/mL， PAMAM-Cs-DCA 与 盐酸阿霉素的质量比为 (8 10) 1， 搅拌 10 14 小时， 然后使用 3000 5000Da 透 析袋在磷酸盐缓冲溶剂中透析 12 36 小时， 透析结束后， 用 0.45m 过滤头过滤， 得到 PAMAM。
14、-Cs-DCA-DOX 纳米胶束。 权 利 要 求 书 CN 102241790 B 4 1/12 页 5 一种两亲性壳聚糖衍生物及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属于功能高分子材料领域， 具体涉及一种两亲性壳聚糖衍生物及其制备方 法和应用。 背景技术 0002 目前， 通过抗癌药物治疗癌症患者是临床研究的热点之一， 但抗癌药物较大的副 作用和多重抗药性限制了其临床应用， 而使用基因治疗方法则可避免上述不足 (Heike， Y. ； Kasono， K. ； Kunisaki， C.， et al.Int.J.Cancer， 2001， 92 ： 115.)。由于肿瘤细胞扩散较快，。
15、 单一的基因治疗方法难以达到长期有效的抑制， 因此联合基因和药物治疗来抑制肿瘤细胞 已成为新的研究方向。Bae 等 (Qiu， L.Y. ； Bae， Y.H.Biomaterials， 2007， 28 ： 4132.) 将聚 己内酯 (PCL) 接枝到聚乙烯亚胺 (PEI) 上合成一系列两亲性阳离子胶束， 其胶束亲水外壳 的 PEI 链段通过静电相互作用复合 DNA， PCL 链段聚集形成的内核通过疏水作用力包裹疏 水药物， 从而实现药物和基因的共传递。Zhang 等 (Zhu， J. ； Cheng， H. ； Jin， Y. ； Cheng， S. ； Zhang， X. ； Zhuo。
16、， R.J.Mater.Chem， 2008， 18 ： 4433.)合成聚乙二醇单甲醚-b-聚N-3-(二 甲氨基 ) 丙基 甲基丙烯酰胺 -co-2- 羟乙基甲基丙烯酸酯 - 聚 (3- 己内酯 )， 通过自 组装形成阳离子胶束实现药物和基因的共传递， 并初步研究了两者的协同效应。目前这种 基因和药物共传递体系在肿瘤治疗上已体现出巨大的潜力， 但有关研究主要集中在合成聚 合物类载体上， 很少涉及天然高分子的改性研究。壳聚糖 (chitosan， Cs) 是一种安全无毒、 生物相容性好的多聚阳离子， 且免疫原性低、 生物黏附性好， 并具有独特的跨细胞膜运输能 力， 因此开发壳聚糖衍生物用作基。
17、因和药物共传递载体具有潜在的应用前景。 发明内容 0003 为了解决上述现有技术的不足， 本发明首要目的在于提供一种两亲性壳聚糖衍生 物。 0004 本发明的另一目的在于提供一种两亲性壳聚糖衍生物的制备方法， 本发明通过点 击化学反应和酰胺化反应将三代的含炔基聚酰胺 - 胺树枝状大分子基元 (PAMAM 基元 ) 和 脱氧胆酸 (DCA) 基元先后接枝到壳聚糖主链上， 制备出两亲性壳聚糖衍生物， 该制备方法 反应条件温和、 高效、 有选择性。 0005 本发明的第三个目的在于提供两亲性壳聚糖衍生物在制备抗癌药物载体中的应 用， 两亲性壳聚糖衍生物在水溶液中自组装形成以 PAMAM 基元和壳聚糖。
18、为亲水外壳、 DCA 基 元为疏水内核的纳米胶束。其内核可以包裹疏水抗癌药物， 外壳可复合基质粒 DNA(pDNA)， 从而实现药物和基因的共传递。两亲性壳聚糖衍生物独特的分子结构使其在基因治疗、 药 物控释和组织工程等领域具有潜在应用价值。 0006 本发明的目的通过下述技术方案实现 ： 0007 一种两亲性壳聚糖衍生物 PAMAM-Cs-DCA， 其特征在于 ： 所述的 PAMAM-Cs-DCA 以 PAMAM 基元和壳聚糖为亲水外壳， 脱氧胆酸基元为疏水内核， 所述的壳聚糖的重均分子量为 说 明 书 CN 102241790 B 5 2/12 页 6 10000 14000， 脱乙酰度为。
19、 70 90 ； 所述的 PAMAM 基元的接枝率为 10 20， 脱氧胆 酸基元的接枝率为 6 12 ； 0008 所述的 PAMAM-Cs-DCA 的分子式为 ： 0009 0010 所述的 PAMAM 基元的结构式为 ： 0011 0012 上述一种两亲性壳聚糖衍生物 PAMAM-Cs-DCA 的制备方法， 包括以下操作步骤 ： 0013 (1)6- 叠氮 -N- 氨基 - 壳聚糖 -g- 脱氧胆酸接枝聚合物的合成 ： 说 明 书 CN 102241790 B 6 3/12 页 7 0014 a 氮气保护下， 将壳聚糖溶于 N， N- 二甲基甲酰胺与水的混合溶剂中， 加入邻苯二 甲酸酐，。
20、 在 100 120下搅拌反应 8 10 小时， 反应结束后， 冷却至 25 30， 用冰水沉 淀， 过滤， 用甲醇洗涤， 真空干燥， 得到 N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖 ； 0015 b 氮气保护下， 将 N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖溶于 N- 甲基 - 吡咯烷酮中， 搅拌溶 解， 在冰水浴中， 加入N-溴代琥珀酰亚胺和三苯基膦， 在7080搅拌反应46小时， 反 应结束后， 将产物离心， 过滤， 用丙酮洗涤， 真空干燥， 得到 6- 溴代 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳 聚糖 ； 0016 c 氮气保护下， 将叠氮钠和 6- 溴代 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖溶于 N- 甲基。
21、 - 吡 咯烷酮中， 在 60 80搅拌反应 8 12 小时， 反应结束后， 将产物过滤， 用乙醇沉降， 离心 收集产物， 并用丙酮洗涤， 真空干燥， 得到 6- 叠氮 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖 ； 0017 d 氮气保护下， 将 6- 叠氮 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖溶于一水合肼与 N- 甲 基 - 吡咯烷酮的混合溶剂中， 在 90 100搅拌反应 4 5 小时， 反应结束后， 将反应产物 用乙醇沉降， 洗涤， 真空干燥， 得到 6- 叠氮 -N- 氨基 - 壳聚糖 ； 0018 e将6-叠氮-N-氨基-壳聚糖溶于质量百分比13的醋酸溶剂中， 加入稀释溶 剂乙醇， 并滴入脱。
22、氧胆酸和 1- 乙基 -(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳二亚胺盐酸盐溶于乙醇形成 的溶液， 在2530中搅拌反应2428小时， 反应结束后， 使用乙醇和氨水混合溶剂沉淀 产物， 真空干燥， 得到6-叠氮-N-氨基-壳聚糖-g-脱氧胆酸接枝聚合物(6-N3-Cs-g-DCA) ； 0019 (2)PAMAM-Cs-DCA 的合成 ： 0020 将步骤 (e) 得到的 6- 叠氮 -N- 氨基 - 壳聚糖 -g- 脱氧胆酸接枝聚合物和 PAMAM 基元 (PAMAM 基元的制备方法按照中国专利 CN 102002117A 所述的方法进行 ) 溶于二甲基 亚砜 (DMSO) 与水的混合溶剂中得到反应液。
23、， 搅拌充分溶解， 氮气保护下， 将五水硫酸铜与 抗坏血酸钠溶于水形成的混合溶液滴入反应液中， 升温到 50 55并在氮气保护下搅拌 反应 24 28 小时， 反应结束后， 将反应产物透析， 过滤并冷冻干燥得到 PAMAM-Cs-DCA。 0021 步骤 a 中所述的 N， N- 二甲基甲酰胺与水的体积比为 95 5 90 10， 壳聚糖溶 于 N， N- 二甲基甲酰胺与水的混合溶剂形成的质量体积比浓度为 0.05 0.06g/ml， 邻苯二 甲酸酐溶于 N， N- 二甲基甲酰胺与水的混合溶剂形成的质量体积比浓度为 0.15 0.20g/ ml。 0022 步骤 b 中所述的 N- 邻苯二甲酰。
24、胺基 - 壳聚糖、 N- 溴代琥珀酰亚胺与三苯基膦的 质量比为 1 (6 7) (10 12)， N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖溶于 N- 甲基 - 吡咯烷酮 形成的质量体积比浓度为 10 20mg/ml。 0023 步骤 c 中所述的 6- 溴代 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖和叠氮钠的质量比为 1 (1.8 2.2)， 6- 溴代 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖溶于 N- 甲基 - 吡咯烷酮形成的质 量体积比浓度为 0.01 0.02g/mL。 0024 步骤 d 中所述的混合溶剂中 N- 甲基 - 吡咯烷酮与一水合肼的体积比为 1 (1 1.2)， 6-叠氮-N-邻苯二甲酰胺基。
25、-壳聚糖溶于一水合肼与N-甲基-吡咯烷酮的混合溶剂 形成的质量体积比浓度为 5 6mg/mL。 0025 步骤 e 中所述的 6- 叠氮 -N- 氨基 - 壳聚糖、 脱氧胆酸与 1- 乙基 -(3- 二甲基氨基 丙基 ) 碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为 1 (3 4) (1 1.2)， 6- 叠氮 -N- 氨基 - 壳聚糖溶 于质量百分比 1 3的醋酸溶剂形成的质量体积比浓度为 10 15mg/mL， 稀释溶剂乙醇 说 明 书 CN 102241790 B 7 4/12 页 8 与质量百分比 1 3的醋酸的体积比为 1 (1 1.2)， 脱氧胆酸溶于乙醇形成质量体积 比浓度为 310 430mg/m。
26、L， 乙醇和氨水混合溶剂中乙醇与氨水的体积比为 7 3 8 2。 0026 步骤(2)中所述的二甲基亚砜与水的体积比为(56)1， 6-叠氮-N-氨基-壳 聚糖 -g- 脱氧胆酸接枝聚合物溶于二甲基亚砜与水的混合溶剂形成的质量体积比浓度为 4 5mg/mL， PAMAM 基元溶于二甲基亚砜与水的混合溶剂形成的质量体积比浓度为 100 150mg/ml， 五水硫酸铜与抗坏血酸钠的摩尔比是 1 (2 2.5)， 五水硫酸铜与抗坏血酸 钠溶于水形成的混合溶液滴入反应液后五水硫酸铜与最终溶剂形成的质量体积比浓度为 2.5 3mg/mL， 透析条件为 3000 5000Da 透析袋透析 36 60 小时。
27、。 0027 上述一种两亲性壳聚糖衍生物 PAMAM-Cs-DCA 在制备抗癌药物载体中的应用。 0028 所述的抗癌药物是阿霉素， 应用方法包括以下操作步骤 ： 0029 将 PAMAM-Cs-DCA 溶于二甲基亚砜溶剂中， PAMAM-Cs-DCA 质量浓度为 5 6mg/mL， 滴入由盐酸阿霉素及三乙胺溶于二甲基亚砜溶剂形成的混合溶液， 混合溶液中盐酸阿霉素 与三乙胺的摩尔比为 1 (3 5)， 盐酸阿霉素质量浓度为 3 5mg/mL， PAMAM-Cs-DCA 与 盐酸阿霉素的质量比为 (8 10) 1， 搅拌 10 14 小时， 然后使用 3000 5000Da 透析 袋在磷酸盐缓冲。
28、溶剂中透析 12 36 小时， 透析结束后， 用 0.45m 过滤头过滤， 得到以壳 聚糖和 PAMAM 基元为亲水外壳、 DCA 为疏水内核， 抗癌药物阿霉素被包裹在疏水内核中的 PAMAM-Cs-DCA-DOX 纳米胶束。 0030 本发明 PAMAM-Cs-DCA 的合成过程如下式所示 ： 0031 0032 说 明 书 CN 102241790 B 8 5/12 页 9 0033 本发明相对于现有技术， 具有如下的优点及有益效果 ： 0034 (1) 本发明制备的 PAMAM-Cs-DCA 所用原料之一壳聚糖是一种由甲壳素脱去乙酰 基制得的天然高分子聚氨基多糖， 来源十分丰富。 003。
29、5 (2) 本发明采用点击化学反应和酰胺化反应来制备 PAMAM-Cs-DCA， 不但其制备反 应条件温和、 易于实施， 而且高效、 具有选择性。 0036 (3)本发明制备的PAMAM-Cs-DCA能在水中自组装形成以PAMAM基元和壳聚糖为亲 水外壳、 DCA 基元为疏水内核的纳米胶束。该胶束不仅能够包裹疏水抗癌药物， 而且能同时 复合基因， 并在细胞中实现药物和基因的共传递， 在生物医药领域具有潜在的应用价值。 说 明 书 CN 102241790 B 9 6/12 页 10 附图说明 0037 图1是实施例1制备的6-N3-Cs-g-DCA和PAMAM-Cs-DCA的 1H NMR图谱。
30、(DMSO-d 6， 300MHz)， 其中 (a) 为 6-N3-Cs-g-DCA、 (b) 为 PAMAM-Cs-DCA ； 0038 图 2 是通过动态光散射和透射电镜测试 PAMAM-Cs-DCA-DOX 纳米胶束的粒径大小 和分布图 ； 0039 图 3 是通过紫外光谱仪测试的 PAMAM-Cs-DCA-DOX 纳米胶束在 PBS(pH 7.4 和 5.2) 中的体外药物释放曲线 ； 0040 图 4 琼脂糖凝胶电泳测试结果， 其中 1 为 pDNA， 2-7 分别为不同 N/P 值下 (N/P 比 值是指阳离子聚合物中的 NH4+与 pDNA 中的 PO3-摩尔比例 ) 的 PAM。
31、AM-Cs-DCA-DOX/pDNA 复 合物 (2-7 分别代表 N/P 值为 0.5 1、 1 1、 2 1、 5 1、 10 1 和 20 1) ； 0041 图 5 是通过流式细胞仪测试的不同 N/P 值下 PAMAM-Cs-DCA-DOX/pDNA 复合物在人 肾上皮细胞中的转染效率 (1-3 分别代表 N/P 值为 5 1、 10 1、 20 1) ； 0042 图 6 是不同 N/P 值下 PAMAM-Cs-DCA-DOX/pDNA 复合物 (a 代表 N/P 值为 5 1 ； b 代表 N/P 值为 10 1 ； c 代表 N/P 值为 20 1) 在人肾上皮细胞中转染 48 。
32、小时后的荧光照 片。 具体实施方式 0043 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述， 但本发明的实施方式不限 于此。 0044 实施例 1 PAMAM-Cs-DCA 的制备 0045 (1)6- 叠氮 -N- 氨基 - 壳聚糖 -g- 脱氧胆酸接枝聚合物的合成 ： 0046 a 氮气保护下， 将 3.0g 壳聚糖 ( 重均分子量为 10000， 脱乙酰度为 70 ) 溶于 60mLN， N- 二甲基甲酰胺与水的混合溶剂中 (95 5， v/v)， 加入 9.0g 邻苯二甲酸酐， 在 120下搅拌反应 8 小时， 反应结束后， 冷却至 25， 用冰水沉淀， 过滤， 将所得产物用甲醇 三。
33、次洗涤， 真空干燥后得到 N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖， 产率 ： 80。 0047 b氮气保护下， 将1.0g N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于100mL N-甲基-吡咯烷酮 中， 搅拌溶解， 在冰水浴中， 加入 6.05g N- 溴代琥珀酰亚胺和 10.3g 三苯基膦， 升温到 70 并在氮气保护下磁力搅拌反应6小时(转速为600转/分钟)， 反应结束后， 将产物离心， 过 滤， 用丙酮三次洗涤， 真空干燥得到 6- 溴代 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖， 产率 ： 75。 0048 c 氮气保护下， 将 1.0g 6- 溴代 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖和 1.84g 叠氮钠。
34、溶 于100mL N-甲基-吡咯烷酮中， 升温到80并在氮气保护下磁力搅拌反应8小时(转速为 600 转 / 分钟 )， 反应结束后， 将产物过滤， 用乙醇沉降， 离心收集产物， 并用丙酮三次洗涤， 真空干燥得到 6- 叠氮 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖， 产率 ： 90。 0049 d 氮气保护下， 0.6g 6- 叠氮 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖溶于 100mL 一水合肼 与 N- 甲基 - 吡咯烷酮的混合溶剂中 (1 1， v/v)， 完全溶解后， 升温到 100并在氮气保 护下搅拌反应 4 小时， 反应结束后， 将反应产物用乙醇沉淀， 三次洗涤， 真空干燥得到 6- 叠 。
35、氮 -N- 氨基 - 壳聚糖。 0050 e 取 0.1g 6- 叠氮 -N- 氨基 - 壳聚糖溶于 10mL 质量浓度为 1的醋酸溶剂中， 并 说 明 书 CN 102241790 B 10 7/12 页 11 加入8mL乙醇溶剂稀释， 并滴入0.634g脱氧胆酸和0.083g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐溶于2mL乙醇溶剂形成的溶液， 在25中搅拌反应24小时， 反应结束后， 使 用20mL乙醇和氨水混合溶液剂(体积比为73)沉淀产物， 真空干燥， 得到6-叠氮-N-氨 基 - 壳聚糖与脱氧胆酸的接枝聚合物 (6-N3-Cs-g-DCA)， 产率为 70。 0051 (。
36、2)PAMAM-Cs-DCA 的合成 ： 0052 取 40mg 6-N3-Cs-g-DCA 和 1.0g 三代含炔基 PAMAM 基元 (PAMAM 基元的制备方法 按照中国专利 CN 102002117A 所述的方法进行 )， 溶于 10mL DMSO 与水的混合溶剂 (DMSO 与水的体积比为 5 1) 中得到反应液， 搅拌充分溶解， 氮气保护下， 取 32mg 五水硫酸铜溶 与 50mg 抗坏血酸钠溶于 1mL 水中， 滴入圆底烧瓶中， 升温到 50并在氮气保护下搅拌反 应 24 小时， 反应结束后， 将反应产物用透析袋 (3000Da) 透析 60 小时， 过滤， 冷冻干燥得到 PA。
37、MAM-Cs-DCA， 产率为 80。 0053 通过元素分析计算步骤 (1) 得到的产物 6-N3-Cs-g-DCA 中 DCA 基元的接枝率为 11.4， 步骤 (2) 得到的产物的 PAMAM-Cs-DCA 中 PAMAM 基元的接枝率为 11.6。 0054 得到的产物 PAMAM-Cs-DCA 以 PAMAM 基元和壳聚糖为亲水外壳， DCA 基元为疏水内 核， PAMAM-Cs-DCA 的分子式为 ： 0055 0056 实施例 2 PAMAM-Cs-DCA 的制备 0057 (1)6- 叠氮 -N- 氨基 - 壳聚糖 -g- 脱氧胆酸接枝聚合物的合成 ： 0058 a氮气保护下，。
38、 将3.0g壳聚糖(重均分子量为14000， 脱乙酰度为90)溶于50mL N， N- 二甲基甲酰胺与水的混合溶剂中 (90 10， v/v)， 加入 10g 邻苯二甲酸酐， 在 100下 搅拌反应 10 小时， 反应结束后， 冷却至室温 25， 用冰水沉淀， 过滤， 将所得产物用甲醇三 次洗涤， 真空干燥后得到 N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖， 产率 ： 85。 说 明 书 CN 102241790 B 11 8/12 页 12 0059 b氮气保护下， 将1.0g N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于50mL N-甲基-吡咯烷酮 中， 搅拌溶解， 在冰水浴中， 加入 7.26g N- 溴代琥珀。
39、酰亚胺和 12.4g 三苯基膦， 升温到 80 并在氮气保护下磁力搅拌反应 4 小时 ( 转速为 1200 转 / 分钟 )， 反应结束后， 将产物离心， 过滤， 用丙酮三次洗涤， 真空干燥得到 6- 溴代 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖， 产率 ： 78。 0060 c 氮气保护下， 将 1.0g 6- 溴代 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖和 2.21g 叠氮钠溶 于50mL N-甲基-吡咯烷酮中， 升温到60并在氮气保护下磁力搅拌反应12小时(转速为 1200转/分钟)， 反应结束后， 将产物过滤， 用乙醇沉降， 离心收集产物， 并用丙酮三次洗涤， 真空干燥得到 6- 叠氮 -N-。
40、 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖， 产率 ： 92。 0061 d 氮气保护下， 0.5g 6- 叠氮 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖溶于 100mL 一水合肼 与 N- 甲基 - 吡咯烷酮的混合溶剂中 (1 1.2， v/v)， 完全溶解后， 升温到 90并在氮气保 护下搅拌反应 5 小时， 反应结束后， 将反应产物用乙醇沉淀， 三次洗涤， 真空干燥得到 6- 叠 氮 -N- 氨基 - 壳聚糖。 0062 e 取 0.1g 6- 叠氮 -N- 氨基 - 壳聚糖溶于 7mL 质量浓度为 3的醋酸溶剂中， 并加 入 7mL 乙醇溶剂稀释， 并滴入 0.85g 脱氧胆酸和 0.104g 1- 乙基。
41、 -(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳 二亚胺盐酸盐溶于2mL乙醇溶剂形成的溶液， 在25中搅拌反应24小时， 反应结束后， 使用 20mL 乙醇和氨水混合溶液剂 ( 体积比为 8 2) 沉淀产物， 真空干燥， 得到 6- 叠氮 -N- 氨 基 - 壳聚糖与脱氧胆酸的接枝聚合物 (6-N3-Cs-g-DCA)， 产率为 75。 0063 (2)PAMAM-Cs-DCA 的合成 ： 0064 取60mg 6-N3-Cs-g-DCA和1.8g PAMAM基元， 溶于12mLDMSO与水的混合溶剂(DMSO 与水的体积比为 6 1) 中得到反应液， 搅拌充分溶解， 氮气保护下， 取 32mg 五水硫酸铜。
42、 与 62.5mg 抗坏血酸钠溶于 1mL 水中， 滴入圆底烧瓶中， 升温到 50并在氮气保护下搅拌反 应 24 小时， 反应结束后， 将反应产物用透析袋 (5000Da) 透析 12 小时， 过滤， 冷冻干燥得到 PAMAM-Cs-DCA， 产率为 85。 0065 通过元素分析计算步骤 (1) 得到的产物 6-N3-Cs-g-DCA 中 DCA 基元的接枝率为 6.6， 步骤 (2) 得到的产物的 PAMAM-Cs-DCA 中 PAMAM 基元的接枝率为 13.8。 0066 得到的产物 PAMAM-Cs-DCA 以 PAMAM 基元和壳聚糖为亲水外壳， DCA 基元为疏水内 核， PAM。
43、AM-Cs-DCA 的分子式为 ： 0067 说 明 书 CN 102241790 B 12 9/12 页 13 0068 实施例 3 PAMAM-Cs-DCA 的制备 0069 (1)6- 叠氮 -N- 氨基 - 壳聚糖 -g- 脱氧胆酸接枝聚合物的合成 ： 0070 a氮气保护下， 将3.2g壳聚糖(重均分子量为12000， 脱乙酰度为80)溶于60mL N， N-二甲基甲酰胺与水的混合溶剂中(141， v/v)， 加入10g邻苯二甲酸酐， 在110下搅 拌反应 9 小时， 反应结束后， 冷却至 30， 用冰水沉淀， 过滤， 将所得产物用甲醇三次洗涤， 真空干燥后得到 N- 邻苯二甲酰胺基。
44、 - 壳聚糖， 产率 ： 83。 0071 b氮气保护下， 将1.0g N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于75mL N-甲基-吡咯烷酮 中， 搅拌溶解， 在冰水浴中， 加入 6.50g N- 溴代琥珀酰亚胺和 11.0g 三苯基膦， 升温到 75 并在氮气保护下磁力搅拌反应5小时(转速为900转/分钟)， 反应结束后， 将产物离心， 过 滤， 用丙酮三次洗涤， 真空干燥得到 6- 溴代 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖， 产率 ： 75。 0072 c 氮气保护下， 将 1.0g 6- 溴代 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖和 2.0g 叠氮钠溶于 75mL N- 甲基 - 吡咯烷酮中， 升温。
45、到 70并在氮气保护下磁力搅拌反应 10 小时 ( 转速为 900 转 / 分钟 )， 反应结束后， 将产物过滤， 用乙醇沉降， 离心收集产物， 并用丙酮三次洗涤， 真空干燥得到 6- 叠氮 -N- 邻苯二甲酰胺基 - 壳聚糖， 产率 ： 90。 0073 d氮气保护下， 0.55g 6-叠氮-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于100mL一水合肼与 N- 甲基 - 吡咯烷酮的混合溶剂中 (1 1.1， v/v)， 完全溶解后， 升温到 95并在氮气保护 下搅拌反应 4.5 小时， 反应结束后， 将反应产物用乙醇沉淀， 三次洗涤， 真空干燥得到 6- 叠 氮 -N- 氨基 - 壳聚糖。 0074 e。
46、 取 0.1g 6- 叠氮 -N- 氨基 - 壳聚糖溶于 8mL 质量浓度为 2的醋酸溶剂中， 并加 入 7.2mL 乙醇溶剂稀释， 并滴入 0.79gDCA 和 0.091g 1- 乙基 -(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳二 亚胺盐酸盐溶于 2mL 乙醇溶剂形成的溶液， 在 30中搅拌反应 28 小时， 反应结束后， 使用 20mL 乙醇和氨水混合溶液剂 ( 体积比为 3 1) 沉淀产物， 真空干燥， 得到 6- 叠氮 -N- 氨 说 明 书 CN 102241790 B 13 10/12 页 14 基 - 壳聚糖与 DCA 的接枝聚合物 (6-N3-Cs-g-DCA)， 产率为 70。 00。
47、75 (2)PAMAM-Cs-DCA 的合成 ： 0076 取 50mg 6-N3-Cs-g-DCA 和 1.4g 三代含炔基 PAMAM 基元 (PAMAM 的制备方法按照 中国专利 CN 102002117A 所述的方法进行 )， 溶于 11mL DMSO 与水的混合溶剂 (DMSO 与水 的体积比为 5.5 1) 中得到反应液， 搅拌充分溶解， 氮气保护下， 取 32mg 五水硫酸铜溶 与 55mg 抗坏血酸钠溶于 1mL 水中， 滴入圆底烧瓶中， 升温到 55并在氮气保护下搅拌反 应 28 小时， 反应结束后， 将反应产物用透析袋 (3500Da) 透析 48 小时， 过滤， 冷冻干燥。
48、得到 PAMAM-Cs-DCA， 产率为 80。 0077 通过元素分析计算步骤 (1) 得到的产物 6-N3-Cs-g-DCA 中 DCA 基元的接枝率为 9， 步骤 (2) 得到的产物的 PAMAM-Cs-DCA 中 PAMAM 基元的接枝率为 13。 0078 得到的产物 PAMAM-Cs-DCA 以 PAMAM 基元和壳聚糖为亲水外壳， DCA 基元为疏水内 核， PAMAM-Cs-DCA 的分子式为 ： 0079 0080 测试实施例 4 0081 将实施例 1-3 制备得到的 6-N3-Cs-g-DCA 溶于氘代 DMSO 中， 进行氢谱核磁表征。 结果如图 1(a) 所示 ： 0。
49、.60ppm 为 DCA 上 18-CH3的质子共振信号， 0.90ppm 为 DCA 上 19-CH3 的质子共振信号， 0.99ppm 为 DCA 上 21-CH3的质子共振信号， 1.0-2.30ppm 为 DCA 上其它 甲基和亚甲基上的质子共振信号， 3.0-5.0ppm 为壳聚糖骨架链上质子共振信号。将实施例 1-3 制备得到的 PAMAM-Cs-DCA 溶于氘代 DMSO 中， 进行氢谱核磁表征。结果如图 1(b) 所 示 ： 0.60ppm 为 DCA 上 18-CH3的质子共振信号， 0.90ppm 为 DCA 上 19-CH3的质子共振信号， 0.99ppm 为 DCA 上 21-CH3的质子共振信号， 1-2.30ppm 为 DCA 上其它甲基和亚甲基上的质 子共振信号， 2.30-3.30ppm处为PAMAM基元上的质子共振信号， 3.30-5.0ppm为壳聚糖骨架 说 明 书 CN 102241790 B 14 11/12 页。