技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，并且更具体地，涉及到一种与椎间盘髓核相关的环状RNA及其应用。
背景技术
当前我国老龄化程度日益严重，已经成为世界上老年人口最多的国家，与老龄化相伴而来的则是年龄相关性慢性疾病发病率和发病数量不断升高。椎间盘退行性疾病是一类常见的年龄相关性慢性疾病，可以引起腰背痛等症状，严重可致患者劳动力丧失甚至残疾，给家庭和社会带来沉重的负担。多种因素可以导致椎间盘退行性疾病的发生，其共同特点是细胞数量减少和功能减退，细胞外基质含量下降且比例失调等。而髓核作为椎间盘的重要组成部分，其自身衰老在椎间盘退变过程中起着非常关键的作用。
近年来，环状RNA(circular RNA，circRNA)是RNA领域的研究热点，其自身环状结构特有的稳定性使得其具有成为生物标志物的天然优势，这为椎间盘退变的的早期诊断和分子诊断提供了新的可能。通过测序技术于髓核组织和细胞中发现了circPVT1，并证实退变髓核组织和衰老髓核细胞中circPVT1表达量减少，预示circRNA与髓核组织退变和髓核细胞衰老有着密切的关系。circRNA具有多种生物学功能，其在基因转录后的表达调控中起着重要作用，因此它与疾病存在以下的关联性：首先，circRNA的变化可能是病因，这是因为疾病的抑制因子以及促进因子都可能是circRNA的靶位点，当circRNA本身先发生了紊乱表达，其最终结果都会导致下游一系列基因表达的变化以及某些通路的整体紊乱，进而诱发疾病发生；其次，circRNA的变化也可能是疾病的结果，这是因为当疾病发生时，会导致染色体片段的丢失、基因的突变或者染色体片段的剧烈扩增，若circRNA正好位于这一变化区段内，那么其表达量将发生极其显著的变化。
因此，理论上circRNA可以作为一类新的疾病标记物，它的特异性变化必然与疾病产生发展相关联。同时circRNA还可以作为潜在的药物作用靶点，通过抑制疾病过程中上调的circRNA或过表达下调的circRNA，将有可能极大地缓解疾病的发生和发展。
综上所述，研究出一种可用于可提供上述用途的环状RNA，是本领域技术人员亟待解决的一个技术问题。
发明内容
本发明针对上述问题，目的在于提供一种与椎间盘髓核相关的环状RNA及其应用。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一方面，本发明公开了一种与椎间盘髓核相关的环状RNA，包括如SEQ ID NO:1所示的序列。
第二方面，本发明实施例还公开了上述环状RNA用于制备早期诊断椎间盘髓核组织退变的药剂的应用；用于制备鉴定髓核细胞退变衰老的药剂的应用；用于椎间盘髓核组织标本的辅助诊断药剂的应用；用于椎间盘髓核退变的生物导向治疗药剂的应用。
本发明的有益效果是：
本发明所涉及的环状RNA，用于制备与椎间盘髓核组织相关疾病的药剂，可作为新的疾病标记物，也可作为潜在的药物作用靶点，可极大地缓解疾病的生发和发展，对人体椎间盘疾病的诊断和治疗具有重大的意义。
附图说明
图1是本发明一实施例中的正常椎间盘组织和退变椎间盘组织中circPVT1的表达水平图；
图2是本发明一实施例中髓核第2、4、6代细胞中环状RNA表达水平图示；
图3是本发明一实施例中正常细胞和受circPVT1siRNA干扰的细胞内circPVT1的表达水平图示；
图4是本发明一实施例中正常细胞和受circPVT1siRNA干扰的细胞内衰老相关分子p53、p21、p16的基因表达量图示；
图5，图6是干扰circPVT1表达对髓核细胞衰老的影响图示。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
RT-PCR验证退变髓核组织和正常髓核的circPVT1表达差异。
1、样本收集
人正常椎间盘组织2例，取自外伤致脊柱爆裂性骨折患者。人退变椎间盘组织5例，取自椎间盘退行性病变手术患者，平均年龄55岁，根据Gr1es〔5〕评分标准，均为重度退变。样本收集时均得到患者及其家属同意。
2、髓核组织提取
正常髓核组织：手术摘取正常椎间盘组织，可见到外周白色的纤维环和中心胶冻样的髓核组织。用含双抗(青一链霉素)的生理盐水浸泡椎间盘10分钟，用刮匙轻轻将髓核组织从椎间盘中分离，双抗生理盐水浸泡冲洗直至无明显血迹为止，大约3-4次。
退变髓核组织：手术经椎间孔镜从侧方入路，不能完整取出椎间盘。分离纤维环组织与髓核组织时，依靠肉眼、手感等进行区分。髓核组织呈胶冻状半透明状，纤维环呈白色柔韧状。髓核组织用眼科剪容易剪碎，无韧性。
3、RNA提取
将碾杵和匀浆器等器皿在200℃干烤4h，去除RNA酶，冷却；加入液氮中预冷，将组织从液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙将组织放入预先加入TRIzol试剂的匀浆器中，匀浆数分钟；将匀浆后的液体转入无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4℃离心分层；将上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4℃离心分层；将上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加异丙醇，4℃离心沉淀RNA；用75％乙醇洗涤沉淀2次；用无RNA酶的去离子水溶解沉淀。抽提的RNA进行质量鉴定(用分光光度仪测定RNA浓度、纯度和完整性)。质量鉴定好的RNA存放在-80℃冰箱待用。
4、逆转录
采用TAKARA公司的反转录试剂盒(DRR047)，对1μg RNA进行反转。反应体系和反应条件参照试剂盒说明书进行。
5、RT-PCR反应
以cDNA为模板，使用针对目标circRNA的PCR引物及Takara的SYBR(R)Premix ExTaqTM荧光定量PCR体系，在stratagen MX3000P定量PCR仪上进行扩增，并测得样品的Ct值。将所得Ct值通过代入测定标准曲线得出的公式，采用绝对定量的计算方法得出样品中的目标circRNA的含量。GAPDH基因作为内照对circRNA qPCR检测结果进行标准化校正。
针对circPVT1的引物如下：
正向引物为5’-CGACTCTTCCTGGTGAAGCATCTGAT-3’，
反向引物为3’-TACTTGAACGAAGCTCCATGCAGC-5’
针对GAPDH的引物如下：
正向引物：5’-CTCTCTGCTCCTCCTGTTCG-3’
反向引物：5’-TTAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3’
6、结果如图1所示，与正常椎间盘组织相比，退变椎间盘组织中circPVT1的表达水平显著降低。
实施例2
RT-PCR验证正常髓核细胞和连续传代复性衰老髓核细胞中的circPVT1表达差异。
1、细胞提取和培养
正常椎间盘髓核组织放入盛有10m12％II型胶原酶的100ml烧杯中，磁力搅拌器搅拌约60分钟。待组织完全溶解后，1000r/min离心10分钟，吸出上清液，用含10％胎牛血清的DMEM培养基lml轻轻吹散细胞，吸至50ml培养瓶中，加入10％胎牛血清的DMEM培养基6-8ml，静置于37℃、饱和湿度、5％CO2孵箱中培养3天。3天后倒置显微镜观察细胞贴壁生长情况，隔天换液。
2.构建髓核细胞连续传代复制性衰老模型
将提取所得髓核细胞置于静置于37℃、饱和湿度、5％CO2孵箱中培养。当细胞长至细胞瓶70％-80％时，用无菌PBS清洗一次后胰酶消化细胞，将消化所得细胞以1：3混匀分别接种于三个新培养瓶中，记为第二代细胞。如此往复传代至第6代细胞，收集第2、4、6代细胞进行后续实验。
2、RNA提取
将所得2、4、6代细胞放入预先加入TRIzol试剂中，冰上裂解数分钟；将裂解后的液体转入无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4℃离心分层；将上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4℃离心分层；将上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加异丙醇，4℃离心沉淀RNA；用75％乙醇洗涤沉淀2次；用无RNA酶的去离子水溶解沉淀。抽提的RNA进行质量鉴定(用安捷伦2100测定RNA浓度、纯度和完整性)。质量鉴定好的RNA存放在-80℃冰箱待用。
3、逆转录
采用TAKARA公司的反转录试剂盒(DRR047)，对1μg RNA进行反转。反应体系和反应条件参照试剂盒说明书进行。
4、RT-PCR反应
以cDNA为模板，使用针对目标circRNA的PCR引物及Takara的SYBR(R)Premix ExTaqTM荧光定量PCR体系，在stratagen MX3000P定量PCR仪上进行扩增，并测得样品的Ct值。将所得Ct值通过代入测定标准曲线得出的公式，采用绝对定量的计算方法得出样品中的目标circRNA的含量。GAPDH基因作为内照对circRNA qPCR检测结果进行标准化校正。
针对circPVT1的引物如下：
正向引物为5’-CGACTCTTCCTGGTGAAGCATCTGAT-3’，
反向引物为3’-TACTTGAACGAAGCTCCATGCAGC-5’
针对GAPDH的引物如下：
正向引物：5’-CTCTCTGCTCCTCCTGTTCG-3’
反向引物：5’-TTAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3’
5、结果
如图2所示，髓核第2、4、6代细胞，细胞中circRNA的表达水平逐渐降低。
实施例3
RT-PCR验证干扰circPVT1表达对髓核细胞衰老的影响
1、设计合成针对circPVT1的siRNA
序列为：CUGUCAGCUGCAUGGAGCUUCGU(SEQ ID NO:1)。
2、细胞提取和培养
正常椎间盘髓核组织放入盛有10m12％II型胶原酶的100ml烧杯中，磁力搅拌器搅拌约60分钟。待组织完全溶解后，1000r/min离心10分钟，吸出上清液，用含10％胎牛血清的DMEM培养基lml轻轻吹散细胞，吸至50ml培养瓶中，加入10％胎牛血清的DMEM培养基6-8ml，静置于37℃、饱和湿度、5％CO2孵箱中培养3天。3天后倒置显微镜观察细胞贴壁生长情况，隔天换液。
3、细胞转染
将髓核细胞分为2组，分别为对照组、circPVT1 siRNA干扰组，将髓核细胞运用转染试剂LipofectamineTM 2000进行转染，转染方法参照说明书。转染后4天收集各组细胞用于后续实验。
4、RT-PCR实验
细胞总RNA提取和PCR步骤同实施例2。
5、结果
如图3，图4所示，其中，图3表示与对照组相比，circPVT1 siRNA干扰组的细胞内circPVT1的水平显著下调，表明干扰circPVT1表达成功；图4表示与对照组相比，circPVT1 siRNA干扰组的细胞内衰老相关分子p53、p21、p16基因表达量显著升高。
实施例4
SA-β-gal染色检测验证干扰circPVT1表达对髓核细胞衰老的影响。
1、SA-β-gal染色检测髓核细胞的衰老情况。SA-β-gal是一种可鉴定衰老细胞的生物学标志物。按照细胞衰老测定试剂盒(Cell Signaling Technology公司)说明检测，观察并计数显微镜下细胞质内有蓝色的细胞百分数，判断细胞衰老的情况。每组设3个复孔，每次实验重复3次。
2、细胞培养和转染同实施例3。
3、细胞转染4天后进行SA-β-gal染色。
4、结果
如图5，图6所示，对照组细胞组蓝色细胞平均百分数为5％，circPVT1干扰组细胞组蓝色细胞平均百分数为27％，差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明干扰circPVT1表达可以加速髓核细胞的衰老过程，给予我们的启示是可以通过增加circPVT1表达的方式来抑制细胞衰老。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院
<120> 一种与椎间盘髓核相关的环状RNA及应用
<130> 18P99118-CN
<141> 2018-04-09
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cugucagcug cauggagcuu cgu 23
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgactcttcc tggtgaagca tctgat 26
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacttgaacg aagctccatg cagc 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctctctgctc ctcctgttcg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttaaaagcag ccctggtgac 20