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1、(10)申请公布号 CN 102409018 A (43)申请公布日 2012.04.11 CN 102409018 A *CN102409018A* (21)申请号 201110419361.6 (22)申请日 2011.12.15 CCTCC NO.M2011288 2011.08.15 C12N 1/20(2006.01) C09K 8/582(2006.01) C12R 1/06(2006.01) (71)申请人 西安瑞捷生物科技有限公司 地址 710065 陕西省西安市丈八一路 1 号汇 鑫 IBCB 座 2401 室 申请人 西北大学 (72)发明人 陈富林 孙叶芳 孙卫 薛姝雯 。
2、(74)专利代理机构 西安新思维专利商标事务所 有限公司 61114 代理人 李罡 (54) 发明名称 一株简单节杆菌及其培养方法与应用 (57) 摘要 本发明涉及一株简单节杆菌及其培养方法与 应用。简单节杆菌是通过筛选得到的一株驱油用 菌株， 可以在油层内生长繁殖， 通过代谢作用主 要产生脂肪酶及海藻糖脂， 起到剥离原油， 改善 原油物性， 提高采收率的功效。本发明按 10% 的 接种比例将简单节杆菌 （Arthrobactersimpler） CAWA11-15-1 CCTCCNO.M2011288 接种至液体培 养基中， 在 35的温度条件下恒温通气培养 ； 液 体培养基的配方为 ： 每。
3、 100ml 水中含， 酵母提取物 0.5g， 葡萄糖 1.5g， 磷酸氢二钾 0.1g， 磷酸二氢钾 0.1g， 硫酸镁 0.02g， pH6.8。本发明提供的简单节 杆菌 CAWA11-15-1， 可以显著降低接触角， 48h 脱 油效率可达 40% 左右 ； 该菌可以有效驱替出岩心 内部饱和原油， 使岩心驱替效率增加 10% 以上。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 CN 102409022 A1/1 页 2 1. 一株简单节杆菌 （Arthrobacter simp。
4、ler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288。 2.一株简单节杆菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288的培 养方法， 是按10%的接种比例将简单节杆菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288 接种至液体培养基中， 在 35的温度条件下恒温通气培养 ； 液体培养基的配方为 ： 每 100ml 水中含， 酵母提取物 0.5g， 葡萄糖 1.5g， 磷酸氢二钾 0.1g， 磷酸二氢钾 0.1g， 硫酸镁 0.02g， pH6.8。 3.。
5、 根据权利要求 2 所述的一株简单节杆菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288 的培养方法， 其特征在于 ： 培养时间为 48-72 小时 ； 溶解氧条件为 5-7mg/L。 4. 权利要求 1 所述的一株简单节杆菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288 在低渗透性油田三次开发中提高采收率中的应用。 5. 权利要求 1 所述的一株简单节杆菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288 在制备提。
6、高原油采收率生物制剂中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102409018 A CN 102409022 A1/6 页 3 一株简单节杆菌及其培养方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及菌种及其培养方法与应用， 具体涉及一株简单节杆菌及其培养方法与 应用。 背景技术 0002 石油是关系国民经济命脉的战略性资源， 经过经过一次、 二次两次常规采油之后 的总采收率一般只能占地下原油的 30% 40%。三次采油 （EOR） 技术是一项能够利用物理、 化学和生物等技术提高原油采收率的重要油田开发技术。 在过去数十年内， 美国、 加拿大和 委内瑞拉等石油大国都把如何提高原油采收率作为研究工作的重点。
7、目标。 随着社会经济持 续快速增长， 我国对油气需求量也不断增加。因此， 运用三次采油技术来原油提高采收率， 是减缓我国多数油田产量递减速度、 维持原油稳产的战略需要。 0003 简单节杆菌 （Arthrobacter simpler） 即是通过筛选得到的一株驱油用菌株， 可以 在油层内生长繁殖， 通过代谢作用主要产生脂肪酶及海藻糖脂， 起到剥离原油， 改善原油物 性， 提高采收率的功效。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一株能改善原油物性、 提高采收率的简单节杆菌及其培养方 法与应用。 0005 本发明所采用的技术方案是 ： 本发明所采用的技术方案是 ： 一株简单节杆菌 （Arthro。
8、bacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288。 0006 一株简单节杆菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288 的培养方法， 是按 10% 的接种比例将简单节杆菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288 接种至液体培养基中， 在 35的温度条件下恒温通气培养 ； 液体培养基的配方为 ： 每 100ml 水中含， 酵母提取物 0.5g， 葡萄糖 1.5g， 磷酸氢二钾 0.1g， 磷酸二氢钾 0.1g， 硫酸镁 。
9、0.02g， pH6.8。 0007 培养时间为 48-72 小时 ； 溶解氧条件为 5-7mg/L。 0008 所 述 的 一 株 简 单 节 杆 菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288 在低渗透性油田三次开发中提高采收率中的应用。 0009 所 述 的 一 株 简 单 节 杆 菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288 在制备提高原油采收率生物制剂中的应用。 0010 本发明具有以下优点 ： 本发明提供的简单节杆菌 CAWA 11-15-1， 可以显著。
10、降低接触角， 48h 脱油效率可达 40% 左右 ； 该菌可以有效驱替出岩心内部饱和原油， 使岩心驱替效率增加 10% 以上。此外， 该菌 培养方法简单易操作， 生长繁殖迅速， 具有扩大化生产的可行性。基于上述特点， 本发明的 说 明 书 CN 102409018 A CN 102409022 A2/6 页 4 简单节杆菌 CAWA 11-15-1 可用于油田的三次开发， 增加产油量， 提高原油采收率， 并可借 此开发出相应的清洁环保生物制剂， 具有较高的科研、 应用及市场价值。 附图说明 0011 图 1 为简单节杆菌 CAWA 11-15-1 的生长曲线。 0012 图 2 为简单节杆菌 。
11、CAWA 11-15-1 光学显微镜照片。 具体实施方式 0013 下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。 0014 本发明所涉及的简单节杆菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1， 已与 2011 年 8 月 15 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC NO.M2011288。 0015 以下实施例用于说明本发明， 但并不限定本发明。 下述实施例中的实验方法， 如无 特殊说明， 均为常规方法 ； 下述实施例中所用的实验材料， 如无特殊说明， 均为常规生化试 剂。 0016 以下实施例中所涉及的培养基为 ： 所用培养基 ： 富集用液体。
12、培养基 ： NaNO3 1.5g，（NH4） 2SO4 1.5g， K2HPO4 1g， MgSO47H2O 0.5g， KCl 0.5g， FeSO47H2O 0.01g， CaCl2 0.002g， 蒸馏水 1000ml， 原油 5g， pH6.8。 0017 分离培养基为富集用液体培养基中添加 2% 琼脂。 0018 血平板培养基 ： LB 固体培养基中添加 5% 新鲜羊血。 0019 实 施 例 一 ：简 单 节 杆 菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288 的分离筛选与纯化 ： 1、 石油降解菌株的富集与分离 ： 。
13、将 5g 油泥样品加入 100ml 培养基中， 35、 150r/ min 摇床培养 7d。待培养液混浊后， 吸取 5ml 培养液重新转接入新鲜培养基中， 与上述 培养条件相同连续转接富集培养 3 次。采用稀释平板法进行分离， 将培养液系列稀释后， 取 100l 稀释液涂布于培养基中， 培养 48h ； 待平板长出菌落后选择不同颜色及形态的单 菌落， 分别回接于培养基和中， 在两种培养基中均能生长的即为石油降解微生物。 0020 2、 表面活性剂产生菌的筛选 ： 由于表面活性剂具有降低表面张力的作用， 可使红 细胞破裂并释放血红素出现溶血圈， 因此采用血平板法筛选。挑取活化好的石油降解菌株 一。
14、环， 点接于血平板上， 35培养 3d 后若有溶血圈出现， 证明该菌能产生表面活性剂。 0021 3、 脂肪酶产生菌的筛选 ： 将分离培养基用灭菌打孔器制作成若干直径约 0.6cm 的 说 明 书 CN 102409018 A CN 102409022 A3/6 页 5 琼脂块， 将上述菌株接种在琼脂块上培养， 然后依次将菌体充分生长的琼脂块放在酶活测 定板上， 28培养 1 3d， 观察各菌落周围油脂水解圈， 水解圈越大表示酶活越强， 将酶活 强的菌株保存在 LB 固体平板培养基中。 0022 4、 纯化 ： 挑取单菌落， 转移到培养基中， 35， 120r/min 振荡培养， 至菌浓度达 。
15、到 107-108CFU/ml， 取 100l 涂布于 LB 固体培养基上， 检测纯度， 直至获得纯种菌株。 0023 实 施 例 二 ：简 单 节 杆 菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288 的培养方法 ： （一） 培养基的配方优化 ： 1、 碳源优化 ： 考察了简单节杆菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288 对葡萄糖、 甘油、 蔗糖、 麦芽糖、 酵母浸膏等几种碳源的利用情况， 具体方法为 ： 采取单因素分析试验， 固定氮源成分为酵母提取物 5g/L。
16、， 改变碳源成分为葡萄糖、 甘油、 蔗糖、 麦芽糖、 酵母浸膏等 （均为 15g/L） ， 接种简单节杆菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288， 35， 120r/min 振荡培养 48h， 测定 OD600， 确定细菌生长情 况， 试验结果显示， 葡萄糖为适宜的碳源。 0024 2、 氮源优化 ： 考察了简单节杆菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288 对蛋白胨、 酵母提取物、 牛肉膏、 尿素、 (NH4)2SO4几种氮源的利用情况， 具体 方法为 ：。
17、 采取单因素分析试验， 固定碳源成分为葡萄糖 （15g/L） ， 改变氮源成分为蛋白胨、 胰蛋白胨、 牛肉膏、 尿素、（NH4） 2SO4（含量均为 5g/L） ， 接种简单节杆菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288， 35， 120r/min 振荡培养 48h， 测定 OD600， 确 定细菌生长情况， 试验结果显示， 酵母提取物为适宜的氮源。 0025 3、 发酵培养基组分的正交试验 ： 通过正交试验确定简单节杆菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M201128。
18、8 发酵培养基各组分的最佳添加量， 被考察因 子与水平数如下表 1 所示 ： 表 1 发酵培养基组分察因子与水平数列表 正交试验设计与数据分析如表 2 所示 ： 表 2 培养基优化正交试验设计与结果 说 明 书 CN 102409018 A CN 102409022 A4/6 页 6 最佳组合 ： X12X23 回归方程为 ： y=0.0636X1+0.1774X2+7.6952 最佳培养基配方为 ： 每 100ml 水中含， 酵母提取物 0.5g， 葡萄糖 1.5g， 磷酸氢二钾 0.1g， 磷酸二氢钾 0.1g， 硫酸镁 0.02g。 0026 （二） 培养方法 ： 按 10% 的接种比例。
19、将简单节杆菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288 接种至液体培养基中， 在 35的温度条件和 5-7mg/L 的溶解氧条件下恒温通 气培养 48-72 小时。液体培养基配方为 ： 每 100ml 水中含， 酵母提取物 0.5g， 葡萄糖 1.5g， 磷酸氢二钾 0.1g， 磷酸二氢钾 0.1g， 硫酸镁 0.02g， pH6.8。 0027 实 施 例 三 ：简 单 节 杆 菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288 的鉴定 ： 简单节杆菌 （Arthro。
20、bacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288 属于节杆菌 属， 幼龄培养物的细胞呈不规则杆状， 单个细胞 0.8 1.21.8 8m。生长过程中， 杆 状断裂成小球状， 直径 0.6 1.0m。单个、 成对排列， 不规则的堆状。明显的杆、 球周期 变化， 稳定期的培养物几乎全部是球状。革兰氏阳性， 但很易褪色。不生孢， 不抗酸。好氧。 该菌在 LB 液体培养基中生长繁殖的生长曲线如图 1 所示， 进入对数期的时间为 12 24 小 时， 平衡期细菌浓度为 108-109 CFU/ml。 0028 图 2 为简单节杆菌 CAWA 11-15-1 的。
21、光学显微镜照片。 0029 实 施 例 四 ： 检 测 简 单 节 杆 菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288 的接触角 ： 说 明 书 CN 102409018 A CN 102409022 A5/6 页 7 接触角， 也称润湿接触角， 是指在固、 液、 气三相接触达到平衡时， 三相接触周边的任一 点上， 液气界面切线与固体表面间形成的并包含液体的夹角， 是润湿程度的量度。若接触 角小于 90， 则固体是亲液的， 即液体可润湿固体， 其角越小， 润湿性越好 ； 若接触角大于 90， 则固体是憎液的， 即液体不润湿固体， 。
22、容易在表面上移动， 不能进入毛细孔。 0030 将一滴水或3%、 5%简单节杆菌溶液滴在正戊烷处理过的石英片上， 10min后用S-2 接触角仪测定接触角， 实验结果见表 3。由结果可知， 3%、 5% 的简单节杆菌溶液可以有效降 低接触角， 从而改变岩石润湿性， 易于原油剥离。 0031 表 3 简单节杆菌溶液接触角测定结果 （10min） 实 施 例 五 ： 检 测 简 单 节 杆 菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288 的驱油效率 取烘干带油石英砂 20， 分别加入 3% 和 5% 的简单节杆菌溶液 50ml， 置于。
23、 37 度恒温箱中 观察， 分别于 0.5， 1， 3， 6， 12， 24， 48 小时后取出计算油量， 实验结果见表 4。3% 和 5% 的简单 节杆菌溶液在 48h 的脱油效率分别为 39.7% 和 42.4%。 0032 表 4 简单节杆菌溶液脱油效率检测 实 施 例 六 ： 检 测 简 单 节 杆 菌 （Arthrobacter simpler） CAWA 11-15-1 CCTCC NO.M2011288 的室内驱替效率 ： 在室内模拟地下油藏的采油工艺过程， 通过实验计算渗透率、 采收率的变化， 从而对能 提高岩芯中的石油采出率的微生物进行评价。 具体为用饱和有石油的岩芯样品代表。
24、地下的 油层， 用泵给岩芯样品的圆柱面加压， 模拟地层的上覆压力， 通过驱替设备给中间容器中的 试验液体和岩芯加温到所需要的试验温度 （60） 并维持此温度 ； 用计量泵在模拟地层的 高压 （最高到 60 MPa） 下向岩芯注入加热后的微生物液体， 并注入岩芯样品， 微生物会将岩 芯样品中的石油驱除， 然后收集计量采出的油量， 并计算渗透率、 采收率， 从而对微生物性 能进行评价。 0033 表 5 5% 简单节杆菌溶液驱油实验数据 说 明 书 CN 102409018 A CN 102409022 A6/6 页 8 可以看出， 简单节杆菌溶液注入后， 可以驱替出水驱无法动用的原油， 整体采收率增加 了 13.15%。 说 明 书 CN 102409018 A CN 102409022 A1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102409018 A 。