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1、(10)授权公告号 CN 103060298 B (45)授权公告日 2014.07.02 CN 103060298 B (21)申请号 201210591787.4 (22)申请日 2012.12.31 C12N 9/80(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12P 35/02(2006.01) C12R 1/38(2006.01) (73)专利权人 安徽丰原基因工程技术有限公司 地址 233010 安徽省蚌埠市胜利西路 777 号 (72)发明人 徐。
2、斌 郑辉 汪本助 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王朋飞 张庆敏 CN 101240285 A,2008.08.13, CN 101351549 A,2009.01.21, Matsuda， A. et al.GenBank:M18278.1. Ge nbank .1993, (54) 发明名称 一种头孢菌素 C 酰化酶突变体及其编码基因 与应用 (57) 摘要 本发明涉及一种头孢菌素 C 酰化酶突变体及 其编码基因与应用。 其氨基酸序列如SEQ ID NO.4 所示或该序列经替换、 缺失或添加一个或几个氨 基酸且具有同等功能的由 SEQ ID NO.。
3、4 衍生的氨 基酸序列。 本发明的头孢菌素C酰化酶突变体， 在 使用该突变体转变CPC7-ACA酶促反应过程中， 转化率达 99%， 得率达 96%。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 黄利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 12 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 序列表12页 附图2页 (10)授权公告号 CN 103060298 B CN 103060298 B 1/1 页 2 1. 一种头孢菌素 C 酰化酶突变体， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO.4 所示。 2. 编码权利要求 1 所述头孢。
4、菌素 C 酰化酶突变体的基因。 3. 根据权利要求 2 所述的基因， 其特征在于， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.3 所示。 4. 含有权利要求 2 或 3 所述基因的载体。 5. 含有权利要求 2 或 3 所述基因或权利要求 4 所述载体的宿主细胞。 6. 权利要求 1 所述的头孢菌素 C 酰化酶突变体的制备方法， 包括以下步骤 ： （1） PCR 扩增权利要求 2 或 3 所述头孢菌素 C 酰化酶突变体基因 ； （2） 将步骤 （1） 所得 PCR 产物连接表达载体 pET-30b ； （3） 连接产物转入大肠杆菌感受态细胞， 获得表达产物。 7. 根据权利要求 6 的制备方法， 其。
5、特征在于， 所用引物为 ： 正向引物 ： 5 -AAACATATGACGATGGCGGCCA-3 ； 反向引物 ： 5 -AAACTCGAGTCAATGATGATGATGATGATGATGGGCCGGGACGAGTTCCTGCGAG-3。 8.根据权利要求6或7所述的制备方法， 其特征在于， 所述头孢菌素C酰化酶突变体采 用亲和层析法进行分离纯化。 9. 权利要求 1 所述头孢菌素 C 酰化酶突变体、 权利要求 2 或 3 所述基因在制备 7- 氨基 头孢烷酸中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 以头孢菌素C为底物， 采用一步酶法制备 7- 氨基头孢烷酸。 权 利 要 求。
6、 书 CN 103060298 B 2 1/5 页 3 一种头孢菌素 C 酰化酶突变体及其编码基因与应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术制药领域， 具体地涉及一种头孢菌素 C 酰化酶突变体及其编 码基因与应用。 背景技术 0002 近年来， 由于头孢菌素类抗生素过敏反应小， 对 - 内酰胺酶较稳定， 具有抗菌谱 广、 疗效好、 毒低、 同其他抗生素无交叉耐药性、 与青霉素较少产交叉过敏反应等优点， 已 经成为抗感染最重要的有效药物。研究发现， 头孢菌素的抗菌部为其母核 7- 氨基头孢烷 酸 (7-aminocephalosporanic acid,7-ACA)， 因此作为合成半合成头孢。
7、菌素重要中间体， 7-ACA 的研究生产显得至关重要。 0003 头孢菌素 C（Cephalosporin C,CPC) 经化学法或是酶法裂解得到 7-ACA。化学法 的反应条件较为苛刻， 反应过程必须在超低温条件下进行， 而且涉及到大量有毒有害的有 机溶剂， 会带来环境污染等问题。因此， 对环境友好的酶法开始成为工业生产的新方向。 0004 目前使用两步酶法制备 7-ACA 在生产成本和环境保护方面有优势， 但是从头孢菌 素 C 到 7-ACA 的转化率与化学法相比要低， 而且 DAAO 催化反应难以控制。 0005 头孢菌素 C 酰化酶 （CPC acylase） 可以直接把头孢菌素 C 。
8、转变成 7-ACA（不经过 GL-7-ACA等中间产物） ， 利用头孢菌素C酰化酶生产7-ACA的一步酶法既具有化学法的优势 （高转化率和纯度） 也具有两步酶法的优势 （高经济性和环境保护） 。但是野生型的头孢菌素 酰化酶活力较低， 不能胜任工业化生产的需要。本发明提供一种高酶活头孢菌素 C 酰化酶 制备方法。 发明内容 0006 本发明目的是提供一种头孢菌素 C 酰化酶突变体及其编码基因。 0007 本发明另一目的是提供头孢菌素 C 酰化酶突变体的制备方法。 0008 本发明又一目的是提供头孢菌素 C 酰化酶突变体及其编码基因在制备 7- 氨基头 孢烷酸中的应用。 0009 所述头孢菌素 C。
9、 酰化酶突变体， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO.4 所示或该序列经替 换、 缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由SEQ ID NO.4衍生的氨基酸序列。 所 述头孢菌素 C 酰化酶突变体基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.3 所示。 0010 与野生型的头孢菌素 C 酰化酶相比， 本发明的头孢菌素 C 酰化酶突变体具体的氨 基酸序列的改变是 ： K171S（第 171 位赖氨酸变为丝氨酸） ， M270W（第 270 位蛋氨酸变为色 氨酸） ， I314S（第 314 位异亮氨酸变为丝氨酸） ,L535T（第 535 位亮氨酸变为苏氨酸） 。 0011 所述头孢菌素 C 酰化。
10、酶突变体的筛选方法， 包括以下步骤 : 0012 （1） 由产头孢菌素 C 酰化酶 CPCA 假单孢杆菌 (Pseudomonas sp.） SE83， 扩增 CPCA 的编码基因 adfQ ； 0013 （2） 采用易错 PCR 技术， 以 CPCA 的编码基因 adfQ 为模板， 扩增获得 CPCA 突变体基 说 明 书 CN 103060298 B 3 2/5 页 4 因 ； 0014 （3） 将步骤 （2） 所得易错 PCR 产物及表达质粒 pET30a 用 Nde 和 Xho 双酶切后 连接， 连接产物转入大肠杆菌 BL21(DE3) 感受态细胞， 涂布至 LB（Kan） 平板， 即。
11、得构建好的 重组 CPCA 基因突变库 ； 0015 （4） 将 LB（Kan） 平板上长出的菌落一一对应转入 LB（Kan） 平板和 LB（Kan、 IPTG、 CPC-Na） 平板上， 转板后将平板置 37恒温培养箱培养， LB（Kan） 平板培养 8h 后取出放入 4冰箱保存， LB（Kan、 IPTG、 CPC-Na） 平板继续 25培养 36h， 然后分别破菌， 测定 CPCA 酶 活力， 挑选酶活力最强的一株， 并测定其基因序列， 分别为 SEQ ID NO.3 所示的基因序列和 SEQ ID NO.4 所示的氨基酸序列。 0016 其中， 所述头孢菌素 C 酰化酶具有 SEQ I。
12、D NO.1 所示的基因序列和 SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列。 0017 本发明进一步提供含有所述基因的载体。含有所述基因或所述载体的宿主细胞。 0018 本发明的另一方面提供所述头孢菌素 C 酰化酶突变体的制备方法， 包括以下步 骤 ： 0019 （1） PCR 扩增上述头孢菌素 C 酰化酶突变体基因 ； 0020 （2） 将步骤 （1） 所得 PCR 产物连接表达载体 pET-30b ； 0021 （3） 连接产物转入大肠杆菌感受态细胞， 获得表达产物。 0022 其中， 步骤 （1） 中所用引物为 ： 0023 正向引物 ： 5 -AAAACGATGGCGGCCA-3 ； 0。
13、024 反向引物 ： 0025 5 -AAATCAATGATGATGATGATGATGATGGGCCGGGACGAGTTCCTGCGAG-3。 0026 其中所述过表达的头孢菌素 C 酰化酶 C- 端含有 6 个组氨酸标签。 0027 进一步， 采用亲和层析法分离纯化表达产物， 分离纯化包括步骤 ： 0028 1） 以 NTA 介质填柱， 用 2 倍柱体积的去离子水洗涤， 接着加 NiSO4 溶液至 NTA 介质 结合度达到饱和， 用 5 倍柱体积的 NAT-0 缓冲液 （20mM Tris-HCl pH7.9， 0.5M NaCl） 洗柱 ； 0029 2） 将含有表达的头孢菌素 C 酰化酶。
14、的大肠杆菌破碎菌体离心后得到的上清加入 到 Ni2+-NTA 树脂柱中， 用 5 倍柱体积的 NAT-1 缓冲液 （即 NAT-0 缓冲液含有 80mmol/L 咪唑） 洗涤介质以去除杂蛋白， 最后用含有 300mmol/L 咪唑的 NAT-0 缓冲液洗脱带有 6 个组氨酸 标签的头孢菌素 C 酰化酶， 并做 SDS-PAGE 分析。 0030 本发明的另一方面提供一种 7- 氨基头孢烷酸的制备方法， 其是通过在大肠杆菌 中表达头孢菌素C酰化酶基因及其突变体， 然后对表达的头孢菌素C酰化酶进行分离纯化， 在有底物头孢菌素 C 的情况下， 制备 7-ACA。 0031 借由上述技术方案， 本发明。
15、至少具有下列优点及有益效果 ： 0032 本发明利用蛋白质亲和色谱技术， 利用带有 6 个组氨酸标签的头孢菌素 C 酰化酶 能与蛋白纯化树脂 Ni-NTA 层析柱特异性结合的原理， 再用含有低浓度的咪唑洗去杂蛋白， 保留在 Ni-NTA 层析柱上的 6His-XK， 从而简化 6His-XK 分离纯化步骤。 0033 本发明涉及固定化酶技术， 带有 6 个组氨酸标签的头孢菌素 C 酰化酶与蛋白纯化 树脂 Ni-NTA 层析柱特异性结合， 在洗去杂蛋白后， Ni-NTA 层析柱保留特异性成分头孢菌 素 C 酰化酶， 用此酶制备 7- 氨基头孢烷酸。 说 明 书 CN 103060298 B 4 。
16、3/5 页 5 0034 本发明涉及头孢菌素 C 酰化酶突变体， 在使用该突变体转变 CPC7-ACA 酶促反 应过程中， 转化率达 99%， 得率达 96%， 而野生型转化率只有 39%， 得率只有 32%。 附图说明 0035 图 1 为 PCR 技术扩增头孢菌素 C 酰化酶基因片段， 长度 2.3kb ； 0036 图 2 为 SDS-PAGE 分析纯化前后头孢菌素 C 酰化酶， 为纯化前为纯化后 ； 0037 图 3 为 HPLC 分析头孢菌素 C 酰化酶酶促反应 ； 为头孢菌素酰化酶将头孢菌素 C 转化为 7- 氨基头孢烷酸的 HPLC 图谱 ； 为头孢菌素 CHPLC 图谱 ； 为。
17、 7- 氨基头孢烷酸 HPLC 图谱。 具体实施方式 0038 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明的范围。 0039 若未特别指明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 0040 实施例 1 头孢菌素 C 酰化酶基因的获得 0041 以 1g 假单孢杆菌 (Pseudomonas sp.） SE83 基因组 DNA 为 PCR 反应模板， 按 SEQ ID NO.1 的序列设计正向引物 CPC-F 为 5 -AAAACGATGGCGGCCA-3； 反向引物 。
18、： 5 -AAATCAATGATGATGATGATGATGATGGGCCGGGACGAGTTCCTGCGAG-3。其中斜体 字母部分分别为酶切位点 NdeI 和 XhoI。PCR 反应在 50L 总体积中进行， 反应条件为在 94变性 5min 后开始循环， 然后 94变性 50s， 58退火 1min， 72延伸 2min， 共 30 个循 环后， 再于 72延伸 10min。取 3L PCR 扩增产物做琼脂糖凝胶电泳验证， 结果如图 1 所 示。取 100L PCR 产物做琼脂糖凝胶电泳， 按照胶回收试剂盒的步骤回收目的片段。 0042 实施例 2 野生型头孢菌素 C 酰化酶基因表达载体的。
19、构建 0043 实施例 1 中 PCR 产物经限制性内切酶 NdeI 和 XhoI 双酶切消化后， 与用相同内切 酶消化的 pET-30a 质粒 （购自 Novagen 公司） 进行连接反应， 构建的载体被称为 pET-CPCA， 然后用连接产物 pET-CPCA 混合物转化大肠杆菌 DH5-a （购自 promega 公司） ， 并进行序列测 定提取转化菌体库的质粒， 转化大肠杆菌 BL（DE3） 菌株 （购自 Novagen 公司） 。 0044 实施例 3 易错 PCR 扩增头孢菌素 C 酰化酶基因 0045 利用 TaqDNA 聚合酶不具有 3 -5校对功能的性质， 在高镁离子浓度 （。
20、5mmol/ L-9mmol/L） 和不同浓度 dNTP 的浓度下 （1.5mmol/L-3.5mmol/L） ， 来控制随机突变的频率， 向目的基因中引入随机突变， 构建突变库。实验中最优的突变率约为 0.6%。 0046 易错 PCR 反应体系 （100l） ： 0047 说 明 书 CN 103060298 B 5 4/5 页 6 0048 0049 PCR 程序为 ： 96预变性 4min， 94变性 1min， 56退火 1min， 75延伸 1min40s， 反应 45 个循环， 最后 75延伸 15min。采用胶回收方法回收 PCR 产物。取 5l 产物 1% 琼 脂糖凝胶电泳检。
21、验， -20保存备用。 0050 实施例 4 突变体的构建 0051 实施例3中PCR产物 （DNA改组后的混合物） 经限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切消 化后， 与用相同内切酶消化的 pET-30a 质粒进行连接反应， 构建的载体被称为 pET-CPCAM， 然后用连接产物 pET-CPCAM 混合物转化大肠杆菌 DH5-a， 构建转化菌体库。 0052 实施例 5 构建表达突变库及高酶活突变体的筛选 0053 提取转化菌体库的质粒， 分别转化大肠杆菌 BL（DE3） 菌株， 获得转化子约 500 株， 构建表达突变体库。挑取突变菌株至含 150lLB/kan 培养基的 96 孔板中 3。
22、0、 150rpm 培 养， 待 OD 值达 0.6-0.8， 加入 IPTG（终浓度 0.2M） ， 继续培养 36h， 收集菌体。超声破菌得上 清， 并进行酶活及蛋白含量测定。 检测酶活力最高的菌株， 并挑选其克隆， 并提取质粒， 测定 与头孢菌素 C 酰化酶对应的基因序列。测定的基因序列为 SEQ ID NO.3 所示， 其对应的氨 基酸序列为 SEQ ID NO.4 所示。 0054 头孢菌素 C 酰化酶的酶活检测 ： 0055 （1） 离心收集菌体， 用 0.1mol/L Tris-HC1 缓冲液 (pH8.0) 洗涤后低温超声破碎， 离心取适量上清液加入100l底物头孢菌素C(CP。
23、C)(0.1mol/L Tris-HC1缓冲液配制)， 并 用缓冲液补加至 200l， 37反应 5 分钟。 0056 （2） 终止条件 ： 取 20l 反应液， 加入 500l 终止液 （20% 乙酸与 0.05M NaOH） 。 0057 （3） 终止后处理 ： 12000rpm 离心 5min， 取 500l 溶液加入样品瓶中。 0058 （4） HPLC 进样条件 ： 采用 C18 柱 （4.6mm*150mm） ， 柱温 30， 进样体积 10l， 检测 吸收峰 254nm， 进样流量 1ml/min。进样时间 20min。 0059 （5） 流动相 ： 0.1M 柠檬酸 （每 1L。
24、 加入 1g 辛烷磺酸钠） 88% ： 乙腈 12%， 流速为 1ml/ min， 进样体积为 4l， 检测吸光度为 254nm， C18 柱。 0060 （6） 酶活单位定义为每分钟催化生成 1mol7-ACA 所需的酶量。 0061 表 1 野生型 CPC 酰化酶和高酶活 CPC 酰化酶突变体的酶活 说 明 书 CN 103060298 B 6 5/5 页 7 0062 0063 表 1 为野生型 CPC 酰化酶和高酶活 CPC 酰化酶突变体的酶活结果。结果表明， 通 过易错 PCR 对 CPC 酰化酶进行改造， 获得酶活力提高了 108.6% 的突变菌株。 0064 实施例 6 利用 N。
25、i2+- 层析柱纯化野生型和突变体头孢菌素 C 酰化酶 0065 以测序验证的 pET-CPCA 和 pET-CPCAM 表达质粒转化大肠杆菌 BL21（DE3） 感受 态细胞 ； 挑取阳性克隆， 接种于含卡那霉素的 LB 培养基中， 30振荡培养至约为 0.6 0.8 时， 加入终浓度为 0.2mmol/L 的 IPTG， 30诱导 36h。接种上述转化后的大肠杆菌 BL21 于 1000mL LB 培养基， 待 OD600 值约达 2.0 时， 诱导与上述相同。离心收集菌体， 以 50mmol/L、 pH8.0Tris-HCl缓冲液悬浮 （湿菌体与缓冲液的比例为1g湿菌体 ： 5mL缓冲液。
26、） ， 在冰浴中以 超声波破碎菌体， 离心后收集上清。 0066 NTA 介质填柱， 用 2 倍柱体积的去离子水洗涤， 接着加 NiSO4溶液至 NTA 介质结合 度达到饱和， 用 5 倍柱体积的 NAT-0 缓冲液 （20mM Tris-HCl pH7.9， 0.5M NaCl） 洗柱。将 上述收集破碎菌体离心后得到的上清加入到 Ni2+-NTA 树脂柱中， 反复加入 2 3 次后， 用 5 倍柱体积的 NAT-1 缓冲液 （即 NAT-0 缓冲液含有 80mmol/L 咪唑） 洗涤介质以去除杂蛋白 , 最后用含有 300mmol/L 咪唑的上述缓冲液洗脱带有 6 个组氨酸标签的头孢菌素 C。
27、 酰化酶， 并做 SDS-PAGE 分析和蛋白浓度测定。纯化分析如图 2 所示。 0067 实施例 7 一步酶法制备 7-ACA 0068 （1） 底物浓度20g/L， 即1.2gCPC先用30mL0.1M Tris-HCl(pH8.0)溶解， 用1M NaOH 调 pH8.0。调 pH 前后各取一个样， 取样 20l， 加入 500l 终止液。 0069 （2） 加入 30mL 透析处理后酶液， 用 1M NaOH 调节 pH 使其维持 pH8.0， 维持反应温 度 31.5 1.5。 0070 （3）分 别 于 加 入 酶 液 后 0min、 5min、 10min、 15min、 20m。
28、in、 25min、 30min、 40min、 50min、 60min、 1.5h、 2h、 3h取样， 取样20l， 每次取的样立即加入500l终止液终止， 终止 液为 20% 乙酸和 0.05M NaOH 按 2 ： 1 配制。 0071 （4） 终止后溶液 12000rpm 离心 5min， HPLC 检测。测得转化率 99%， 得率 96%。头 孢菌素 C 酰化酶酶促反应结果的如图 3 所示。 0072 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明。
29、精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 103060298 B 7 1/12 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 103060298 B 8 2/12 页 9 0003 序 列 表 CN 103060298 B 9 3/12 页 10 0004 序 列 表 CN 103060298 B 10 4/12 页 11 0005 序 列 表 CN 103060298 B 11 5/12 页 12 0006 序 列 表 CN 103060298 B 12 6/12 页 13 0007 序 列 表 CN 103060298 B 13 7/12 页 14。
30、 0008 序 列 表 CN 103060298 B 14 8/12 页 15 0009 序 列 表 CN 103060298 B 15 9/12 页 16 0010 序 列 表 CN 103060298 B 16 10/12 页 17 0011 序 列 表 CN 103060298 B 17 11/12 页 18 0012 序 列 表 CN 103060298 B 18 12/12 页 19 序 列 表 CN 103060298 B 19 1/2 页 20 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103060298 B 20 2/2 页 21 图 3 说 明 书 附 图 CN 103060298 B 21 。