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1、(10)授权公告号 CN 103013879 B (45)授权公告日 2014.09.24 CN 103013879 B (21)申请号 201210552498.3 (22)申请日 2012.12.19 CGMCC NO ： 5448 2011.11.08 201110439694.5 2011.12.23 CN C12N 1/20(2006.01) C12R 1/25(2006.01) (73)专利权人 黑龙江省乳品工业技术开发中心 地址 150001 黑龙江省哈尔滨市南岗区学府 路 337 号 (72)发明人 姜毓君 单艺 满朝新 邓宇 (74)专利代理机构 北京爱普纳杰专利代理事务 所。
2、 ( 特殊普通合伙 ) 11419 代理人 何自刚 王玉松 CN 101928679 A,2010.12.29, 权利要求 1-4. 范杰 等.高产-氨基丁酸乳酸菌的筛选及 鉴定 .中国酿造 .2011,( 第 229 期 ), 摘要 . 渠岩 等 . 发酵食品中产 - 氨基丁酸植 物乳杆菌 S35 的筛选鉴定 .中国农业大学学 报 .2010, 第 15 卷 ( 第 5 期 ), 摘要 . (54) 发明名称 一株具有高产 - 氨基丁酸能力的菌株 (57) 摘要 本发明公开了一株具有高产 - 氨基丁 酸能力的菌株， 为植物乳杆菌 （Lactobacillus plantarum） NDC 7。
3、5017， 属于乳杆菌属， 已在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保 藏， 保藏地址为北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏编号为 CGMCC NO ： 5448， 保藏日期为 2011 年 11 月 08 日。本发明中菌株 NDC 75017 具有高 产 - 氨基丁酸的能力， 经高效液相色谱检测其 产量高达 138mg/L ； - 氨基丁酸是一种重要的 抑制性神经递质， 具有很高的生理活性， 有调节血 压、 促使精神安定、 促进脑部血流、 营养神经细胞、 增加生长激素分泌、 改善更年期综合症等多种功 效。 (66)本国优先权数据 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl.。
4、 (56)对比文件 审查员 赵鹏 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 序列表4页 附图2页 (10)授权公告号 CN 103013879 B CN 103013879 B 1/1 页 2 1. 一株植物乳杆菌， 其特征在于它为植物乳杆菌 （Lactobacillus plantarum） NDC75017， 属于乳杆菌属 （Lactobacillus） ， 已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心保藏， 保藏地址为北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏编号为 CGM。
5、CC NO ： 5448， 保藏日期为 2011 年 11 月 08 日。 权 利 要 求 书 CN 103013879 B 2 1/5 页 3 一株具有高产 - 氨基丁酸能力的菌株 技术领域 0001 本发明涉及一株植物乳杆菌。 背景技术 0002 乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、 革兰氏染色阳性细菌的总称。 绝大部分乳酸菌都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群， 其广泛存在于人体的 肠道中。目前已被国内外生物学家所证实， 肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关 系。 0003 植物乳杆菌是乳酸菌的一种， 属于乳杆菌属， 有很强的发酵碳水化合物的能力， 较 耐盐， 与其它。
6、乳酸菌有协同作用， 具有免疫调节、 拮抗致病菌、 抗突变和防癌等益生性质， 其 代谢产生的有机酸、 过氧化氢、 双乙酰、 细菌素等物质能够抑制病原菌的生长和粘附， 调节 宿主肠道、 阴道、 尿道的微生态平衡、 预防和治疗由于微生态失衡而造成的腹泻、 感染 ； 植物 乳杆菌是厌氧细菌 （兼性好氧） ， 能够降低血清胆固醇。在繁殖过程中能产出特有的乳酸杆 菌素， 乳酸杆菌素是一种生物型的防腐剂。 发明内容 0004 本发明提供了一株植物乳杆菌。 0005 一株植物乳杆菌， 它为植物乳杆菌 （Lactobacillus plantarum） NDC 75017， 属于 乳杆菌属 （Lactobaci。
7、llus） ， 已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏地址为北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏编号为 CGMCC NO ： 5448， 保藏日期为 2011 年 11 月 08 日 ； 它为革兰氏阳性菌， 呈短杆状、 两端呈圆形， 长为 1.0m 1.7m， 宽 为 0.4m 0.9m， 无芽孢， 无鞭毛 ； 在 MRS 培养基上形成白色的圆形菌落、 直径为 0.5 2mm、 菌落边缘整齐、 细致有光泽、 中央有凸起。 0006 本发明所述植物乳杆菌， 它为植物乳杆菌 （Lactobacillus plantarum） NDC 75017， 该菌株能够利用核糖、。
8、 半乳糖、 葡萄糖、 果糖、 甘露糖、 甘露醇、 - 甲基 -D- 甘露糖 甙、 N- 乙酰 - 葡糖胺、 苦杏仁甙、 熊果甙、 七叶灵、 柳醇、 纤维二糖、 麦芽糖、 乳糖、 蜜二糖、 蔗 糖、 海藻糖、 松叁糖、 棉子糖、 拢牛儿糖、 D- 阿拉伯糖醇和葡萄糖酸盐发酵产酸 ； 该菌株不能 利用甘油、 赤癣醇、 D- 阿拉伯糖、 L- 阿拉伯糖、 D- 木糖、 L- 木糖、 阿东醇、 - 甲基 -D- 木糖 甙半乳糖、 山梨糖、 鼠李糖、 卫茅醇、 肌醇、 山梨醇、 - 甲基 -D- 甘露糖甙、 菊糖、 淀粉、 糖原、 木糖醇、 D- 来苏糖、 D- 塔格糖、 D- 岩糖、 L- 岩糖、 L。
9、- 阿拉伯糖醇、 2- 酮基 - 葡萄糖酸盐和 5- 酮基 - 葡萄糖酸盐发酵产酸 ； 该菌株过氧化氢酶实验呈阴性、 明胶液化实验呈阴性、 硝酸 盐还原实验呈阴性、 硫化氢实验呈阴性、 吲哚实验呈阴性、 动力实验为不运动 ； 该菌株的最 适生长温度为 30 35， 10能生长， 45不生长， 生长 pH 为 4.5 9.5， 最适合生长 pH 为 5.8。 0007 本 发 明 中 一 株 植 物 乳 杆 菌， 它 为 植 物 乳 杆 菌 （Lactobacillus plantarum） NDC 75017， 经 16S rDNA 序列测序， 结果在 NCBI 上进行同源性比较， 菌株 ND。
10、C 75017 与 说 明 书 CN 103013879 B 3 2/5 页 4 Lactobacillusplantarum JDM1、 Lactobacillus plantarum subsp.plantarum ST-III、 Lactobacillus plantarumWCFS1 的亲缘关系最近， 同源性达 99.8%。经 IGS（intergenic spacer）序列测序， 将 IGS 测序结果的 785 个碱基在 NCBI 上进行同源性比较， 菌株 NDC 75017 与 Lactobacillus plantarumWCFS1、 Lactobacillus plantaru。
11、m subsp.plantarum ST-III 的亲缘关系最近， 同源性达 99.5%。 0008 所述植物乳杆菌其 16S rDNA 序列如 SEQ ID NO.1 所示。 0009 所述植物乳杆菌其 IGS 序列如 SEQ ID NO.2 所示。 0010 本发明中一株植物乳杆菌， 它为植物乳杆菌 （Lactobacillus plantarum） NDC 75017， 属于乳杆菌属 （Lactobacillus） ， 已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心保藏， 保藏地址为北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏编号为 CGMCC NO ： 5448， 保 藏日期为 2。
12、011 年 11 月 08 日。 0011 本发明中一株植物乳杆菌， 它为植物乳杆菌 （Lactobacillus plantarum） NDC 75017， 该菌具有高产 - 氨基丁酸的能力， 经高效液相色谱检测其产量高达 138mg/L ； - 氨基丁酸是一种重要的抑制性神经递质， 它参与多种代谢活动， 具有很高的生理活性， 已报道的生理活性有调节血压、 促使精神安定、 促进脑部血流、 增进脑活力、 营养神经细胞、 增加生长激素分泌、 健肝利肾、 预防肥胖、 促进乙醇代谢 （醒酒） 、 改善更年期综合症等多种 功效， 也可与各种各样的食品组合， 制造成各种各样富含 - 氨基丁酸的功能食品。。
13、 附图说明 0012 图 1 为具体实施方式一中植物乳杆菌 （Lactobacillus plantarum） NDC 75017 单 个菌的电镜图 ； 0013 图 2 为具体实施方式一中植物乳杆菌 （Lactobacillus plantarum） NDC 75017 多 个菌的电镜图 ； 0014 图 3 为具体实施方式一中植物乳杆菌 （Lactobacillus plantarum） NDC 75017 的 16S rDNA 的系统发育树 ； 0015 图 4 为具体实施方式一中植物乳杆菌 （Lactobacillus plantarum） NDC 75017 的 IGS 的系统发育树。
14、。 具体实施方式 0016 实施例 1 ： 0017 植 物 乳 杆 菌 （Lactobacillus plantarum） NDC 75017，属 于 乳 杆 菌 属 （Lactobacillus） ， 已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏地址为 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏编号为 CGMCC NO ： 5448， 保藏日期为 2011 年 11 月 08 日 ； 它为革兰氏阳性菌， 呈短杆状、 两端呈圆形， 长为 1.0m 1.7m， 宽为 0.4m 0.9m， 无芽孢， 无鞭毛 ； 在 MRS 培养基上形成白色的圆形菌落、 直径为 0.5 2mm、。
15、 菌落边 缘整齐、 细致有光泽、 中央有凸起。 0018 本实施方式中植物乳杆菌 （Lactobacillus plantarum） NDC 75017 的最适生长温 度为 30 35， 10能生长， 45不生长， 生长 pH 为 4.5 9.5， 最适合生长 pH 为 5.8。 0019 本实施方式一株具有高产 - 氨基丁酸能力的菌株， 它从内蒙古传统发酵乳制品 说 明 书 CN 103013879 B 4 3/5 页 5 中分离得到， 筛选方法按以下步骤实现 ： 0020 一、 样品的采集 0021 采集样品时双手戴上无菌的一次性乳胶手套， 用一次性无菌注射器吸取内蒙古通 辽地区牧民家庭中。
16、自制的传统酸奶样品， 放入事先已经灭菌的器皿中， 用记号笔在器皿上 标注样品编号并封好放入冰盒内， 将冰盒放入含有冰袋的保温箱 ； 测定采集样品的 pH 值与 温度， 并记录采集地点到调查采样表中， 同时用相机采集样品的图片资料 ； 采集后的样品带 回实验室于 4冰箱中保存备用。 0022 二、 乳酸菌的分离与纯化 0023 用灭菌移液器取 1mL 酸奶样品， 接种于灭菌的生理盐水中， 进行梯度稀释 ； 在灭菌 培养皿中倒入灭菌、 冷却至50的含有0.75%CaCO3的MRS固体培养基， 冷却至凝固后， 将稀 释的样品接入MRS固体培养基中， 放入恒温厌氧培养箱， 37培养4872h。 观察并。
17、记录菌 落特征。 0024 从平板上长出的菌落中挑选出周围形成透明圈的单个菌落， 进行革兰氏染色， 将 G+菌株继续划线于 MRS 固体培养基， 直至确定为纯菌 ； 将纯化的菌株再进行革兰氏染色并 做 H2O2酶试验， 凡革兰氏染色阳性、 H2O2酶试验阴性的菌株可初步确定为乳酸菌 ； 0025 三、 乳酸菌分离株的保存 0026 将纯化菌株接种到 MRS 斜面培养基中， 经培养后置 4冰箱中保存备用， 同时将分 离菌株的纯培养物接种于MRS液体培养基中， 37厌氧培养16h， 连续传代培养3次， 将培养 液与 30% 灭菌甘油以 1 ： 1 的比例混合均匀， 置于 -80冰箱冷冻保存 ； 0。
18、027 其中所述 MRS 固体培养基 （1000mL） 由 5g 的蛋白胨、 5g 的牛肉膏、 5g 的酵母粉和 10g 的胰蛋白胨、 1.0mL 的 Tween-80、 20g 的葡萄糖、 各 10 毫升的 5 种盐溶液和余量的蒸馏 水组成， 调 pH 至 5.8， 121高压灭菌 15min ； 其中 5 种盐溶液 ： 20g K2HPO4 3H2O+100mL 蒸馏 水， 20g 柠檬酸氢二铵 +100mL 蒸馏水， 50g 乙酸钠 +100mL 蒸馏水， 5.8g MgSO47H2O+100mL 蒸馏水， 2.5g MnSO4H2O+100mL 蒸馏水。 0028 本实施方式筛选所得菌。
19、的电镜图见图 1 和 2。 0029 对筛选所得菌进行生理生化试验 ： 0030 依据 伯杰氏细菌学鉴定手册 （第八版） 和 常见细菌系统鉴定手册 对其进行 常规生理生化鉴定， 实验结果为 ： 该菌株能够利用核糖、 半乳糖、 葡萄糖、 果糖、 甘露糖、 甘露 醇、 - 甲基 -D- 甘露糖甙、 N- 乙酰 - 葡糖胺、 苦杏仁甙、 熊果甙、 七叶灵、 柳醇、 纤维二糖、 麦 芽糖、 乳糖、 蜜二糖、 蔗糖、 海藻糖、 松叁糖、 棉子糖、 拢牛儿糖、 D- 阿拉伯糖醇和葡萄糖酸盐 发酵产酸 ； 该菌株不能利用甘油、 赤癣醇、 D- 阿拉伯糖、 L- 阿拉伯糖、 D- 木糖、 L- 木糖、 阿东 。
20、醇、 - 甲基 -D- 木糖甙半乳糖、 山梨糖、 鼠李糖、 卫茅醇、 肌醇、 山梨醇、 - 甲基 -D- 甘露糖 甙、 菊糖、 淀粉、 糖原、 木糖醇、 D- 来苏糖、 D- 塔格糖、 D- 岩糖、 L- 岩糖、 L- 阿拉伯糖醇、 2- 酮 基 - 葡萄糖酸盐和 5- 酮基 - 葡萄糖酸盐发酵产酸 ； 该菌株过氧化氢酶实验呈阴性、 明胶液 化实验呈阴性、 硝酸盐还原实验呈阴性、 硫化氢实验呈阴性、 吲哚实验呈阴性、 动力实验为 不运动。 0031 分子生物学鉴定 ： 0032 对筛选所得菌经 16S rDNA 序列测序， 结果在 NCBI 上进行同源性比较， 菌株 NDC 75017 与 L。
21、actobacillus plantarum JDM1、 Lactobacillus plantarum subsp.plantarum 说 明 书 CN 103013879 B 5 4/5 页 6 ST-III、 Lactobacillusplantarum WCFS1 的亲缘关系最近， 同源性达 99.8%（如图 3 所 示） 。经 IGS（intergenic spacer）序列测序， 将 IGS 测序结果的 785 个碱基在 NCBI 上 进行同源性比较， 菌株 NDC 75017 与 Lactobacillus plantarum WCFS1、 Lactobacillus plant。
22、arum subsp.plantarum ST-III 的亲缘关系最近， 同源性达 99.5%（如图 4 所示） 。 结合菌株 NDC 75017 形态学观察、 生理生化试验鉴定结果， 确定菌株 NDC 75017 为乳杆菌 属 （Lactobacillus）的一个新菌株， 命名为植物乳杆菌 （Lactobacillus plantarum） NDC 75017。 0033 本实施方式筛选所得植物乳杆菌 （Lactobacillus plantarum） NDC 75017， 通过高 效液相色谱检测对其进行产 - 氨基丁酸的能力的测试， 结果为 138mg/L。 0034 实施例 2 ： 00。
23、35 小鼠灌服植物乳杆菌NDC 75017菌悬液后， 利用Real-time RT PCR方法检测肠道 内免疫相关基因的差异表达变化。结果显示， IL1、 IL-1、 IL-6、 IL17、 IL18 和 TNF- 这 六个目的基因的表达均呈现出先增加后减小的趋势， 并且所有基因表达量都在小鼠灌胃第 5 天出现最大值， 同时表达量与对照组相比差异极显著 （p0.01） 。 0036 实施例 3 ： 0037 植物乳杆菌 NDC 75017 作用于 Caco-2 细胞 0.5、 1、 2 和 4h 后， 利用 Western Blot 方法检测 TLR2、 p-NF-B p65 和 p-p38M。
24、APK 蛋白水平的表达。结果显示， 植物乳杆菌 NDC 75017能短期诱导TLR2、 p-NF-B P65和p-p38MAPK的表达， 表明植物乳杆菌NDC 75017能 快速的激活 TLR2 介导的两条免疫相关信号通路， 并且能够进一步促进免疫相关细胞因子 的产生。 0038 实施例 4 ： 0039 因本申请采用菌株筛选自内蒙古传统发酵乳制品， 植物乳杆菌 NDC 75017 可用于 发酵生产酸奶， 在牛乳中添加 L- 谷氨酸钠 （100mmol/L） ， 磷酸吡哆醛浓度为 20mol/L， 植 物乳杆菌 NDC 75017 接种量 2%（活菌数 51011） ， 30 摄氏度发酵 24。
25、 小时， 在酸奶中检测到 GABA 含量为 113mg/L， 发酵得到的成品酸奶， 经过感官评价， 总体结果是 ： 色泽气味良好， 呈 均匀的乳白色， 有酸奶的奶香味 ； 组织状态良好， 凝块细小均匀光滑无气泡， 无异味， 只有微 量的乳清析出。 0040 实施例 5 ： 0041 植物乳杆菌 NDC 75017 在 pH 3.0 条件下处理 1h-3h， 存活率分别为 53.66%、 28.46% 和 10.57% ； 将菌悬液以 2% 接种量接至含 0.3% 胆酸盐的 MRS 液体培养基中 37培 养 12h， 存活率能达到 84.31% ； 将菌悬液按 2% 分别接种至 7g/100ml。
26、 的高盐浓度 MRS 液体培 养基中 37培养箱中分别培养 24h， 活菌数可达 108CFU/mL。 0042 实施例 6 ： 0043 将制备好的菌悬液按 2% 接种量接种至过滤除菌的 pH3.0 的人工胃液中 37培养 0、 1、 2、 3h后取样， 测定其活菌数。 然后， 分别无菌吸取处理0、 1、 2、 3h后的含菌人工胃液， 以 2% 接种量接种至过滤除菌的 pH8.0 的人工肠液中， 继续置 37培养， 分别在 0h、 3h、 5h、 7h、 8h 后测定活菌数。 0044 人工胃液 ： NaCl 0.2%、 胃蛋白酶 0.35%， 用 1N HCl 调整 pH 值为 3.0 后。
27、， 0.22um 滤 膜过滤除菌备用。 说 明 书 CN 103013879 B 6 5/5 页 7 0045 人工肠液 ： 将下述 a 液和 b 液以 2:1 混合即为人工肠液 0046 a 胰腺液 ： NaHCO31.1%、 NaCl 0.2%、 胰蛋白酶 0.1%， 调整 pH 为 8.0 后， 过滤除菌备 用。 0047 b 胆液 ： 胆盐 1.2%, 调整 pH 为 8.0 后， 过滤除菌备用。 0048 存活率 Nt/No100% 0049 式中， Nt菌体在人工消化液培养不同时间后的活菌数 ； 0050 No菌体在 MRS 培养基中培养不同时间后的活菌数。 0051 植物乳杆菌 。
28、NDC 75017 在 pH3.0 的人工胃液中作用 1-3h， 存活率分别可达到 34.23%、 26.43%、 18.92%， 在人工胃液中存活率较高， 说明其能耐受胃液酸性及胃蛋白酶环 境， 可以通过胃进入肠道并保持活性。 0052 植物乳杆菌 NDC 75017 经人工胃液处理后， 在人工肠液中分别作用 3h、 5h、 7h、 8h 后， 存活率分别可达到 82.54%、 68.25%、 63.49%、 58.73%， 这表明， 在模拟小肠中食物消化吸 收的时间内， 植物乳杆菌 NDC 75017 可在肠液中保持一定活性， 对肠液的耐受性能较好。 说 明 书 CN 103013879 B 7 1/4 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 103013879 B 8 2/4 页 9 0003 序 列 表 CN 103013879 B 9 3/4 页 10 0004 序 列 表 CN 103013879 B 10 4/4 页 11 序 列 表 CN 103013879 B 11 1/2 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103013879 B 12 2/2 页 13 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103013879 B 13 。