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1、(10)授权公告号 CN 103288966 B (45)授权公告日 2015.01.21 CN 103288966 B (21)申请号 201310184791.3 (22)申请日 2013.05.17 C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 华侨大学 地址 362000 福建省泉州市丰泽区城东华侨 大学 (72)发明人 李招发 邓小英 惠二京 刁勇 许瑞安 (74)专利代理机构 泉州市文华专利代理有限公 司 35205 代理人 车世伟 CN 155273。
2、4 A,2004.12.08, 全文 . CN 101076540 A,2007.11.21, 全文 . CN 101173299 A,2008.05.07, 全文 . 刘亚民等 .TRAIL 受体在老年结肠癌中的表 达及临床意义 .中国老年学杂志 .2007, 第 27 卷 1597-1598. 段晓秋等 . 死亡受体 Fas 在 TRAIL 联合三氧 化二砷诱导人胃癌细胞凋亡中的作用 . 癌变 畸 变突变 .2012, 第 24 卷 ( 第 6 期 ),422-426. (54) 发明名称 一种融合受体及其用于治疗大肠癌的基因药 物 (57) 摘要 本发明提供一种融合受体及其用于治疗大肠 。
3、癌的基因药物， 所述融合受体是由 eDR4 基因和 iFAS 基因连接融合而成， 所述融合受体的基因序 列如 SEQ ID NO.1 所示， 所述融合受体所编码的 蛋白能与肿瘤相关凋亡诱导配体 TRAIL 蛋白相结 合 ； 所述融合受体基因以及 sTRAIL 基因相结合 可作为治疗大肠癌的基因药物， 所述基因药物的 使用方法为 ： 使用 CAG 组成型启动子驱动 sTRAIL 目的基因表达， 肿瘤特异性 Survivin 启动子驱动 eDR4基因与iFAS基因融合受体表达， sTRAIL通过 其DR受体及eDR4基因与iFAS融合受体多靶点进 行信号转导， 特异诱导肿瘤细胞凋亡。 (51)In。
4、t.Cl. (56)对比文件 审查员 刘俊 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 2 页 附图 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图7页 (10)授权公告号 CN 103288966 B CN 103288966 B 1/1 页 2 1. 一种融合受体， 其特征在于 ： 所述融合受体是由 DR4 胞外区基因和 FAS 胞内区基因 连接融合而成， 所述融合受体的基因序列如 SEQ ID NO.1 所示。 2. 根据权利要求 1 所述的一种融合受体， 其特征在于 ： 所述融合受体所编码的蛋白能 与肿瘤相关凋亡诱导配体 T。
5、RAIL 蛋白相结合。 3. 一种用于治疗大肠癌的基因药物， 其特征在于 ： 所述基因药物包含权利要求 1 所述 的融合受体基因以及 sTRAIL 基因。 4. 如权利要求 3 所述的一种用于治疗大肠癌的基因药物， 其特征在于 ： 所述基因药物 的使用方法为 ： 使用CAG组成型启动子驱动sTRAIL目的基因表达， 肿瘤特异性Survivin启 动子驱动权利要求 1 所述的 DR4 胞外区基因与 FAS 胞内区基因融合受体表达， sTRAIL 通过 其 DR 受体及权利要求 1 所述的 DR4 胞外区基因与 FAS 胞内区融合受体多靶点进行信号转 导， 特异诱导肿瘤细胞凋亡。 5. 如权利要求。
6、 3 或 4 所述的一种用于治疗大肠癌的基因药物， 其特征在于 ： 所述基因 药物可以通过非病毒载体系统或病毒载体系统进行基因传递， 治疗大肠癌。 权 利 要 求 书 CN 103288966 B 2 1/8 页 3 一种融合受体及其用于治疗大肠癌的基因药物 【技术领域】 0001 本发明涉及一种融合受体及其用于治疗大肠癌的基因药物。 【背景技术】 0002 据国际癌症研究机构统计， 在全世界范围内， 大肠癌高居癌症死因第三位， 每年有 超过 100 万的大肠癌新增病例， 其发生几率仅次于肺癌、 乳腺癌。目前， 临床治疗大肠癌的 手段有外科手术 （适用于早期） 、 化疗、 放射治疗 （副作用大。
7、） 等， 临床现有用药品种有紫杉 醇、 吉西他宾 （单一品种治疗效果有限） 等， 针对临床治疗的不足， 迫切需要行之有效的治疗 药物来解决临床用药问题。而肿瘤基因治疗法日渐成为继药物疗法、 手术疗法和放射疗法 发展起来治疗肿瘤的第四大疗法。 0003 新兴的基因治疗是根除肿瘤细胞的先进方法之一， 其关键是获得有效的基因传递 载体。目前基因治疗应用的载体主要分两类 ： 非病毒载体和病毒载体。常用的非病毒载体 包括聚阳离子复合物载体、 纳米颗粒载体、 脂质体等， 其中以脂质体转染细胞较为高效。而 常用的病毒载体主要包括逆转录病毒 (RV)、 腺病毒 (AdV)、 腺相关病毒 (AAV)、 慢病毒 。
8、(LV) 和单纯疱疹病毒 (HSV) 等载体系统。AAV 因其无致病性、 低免疫原性、 感染谱广及能携带外 源基因长期稳定表达等优点， 是目前较为理想的基因递送载体。采用 rAAV 载体介导肠癌基 因治疗是一个非常有前景的治疗手段， 但能否成功应用于临床实践的关键在于如何提高治 疗基因的靶向性和表达效率。 0004 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)相关的凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL) 是继 TNF、 FasL 之后发现的第三个 TNF 家族的凋亡因 子， 是由 Wiley 等从人心肌 cD。
9、NA 文库中克隆出来的。 0005 TRAIL C 端胞外区为保守性强的 114 281 位氨基酸 , 可形成典型的 夹心， 是 与受体结合的部位。研究证实 TRAIL 与死亡受体结合后能诱导多种肿瘤细胞凋亡， 而对绝 大多数正常细胞无毒性作用 ； 同时发现激活的 T 细胞、 NK 细胞、 单核细胞以及树突状细胞均 能表达 TRAIL。TRAIL 在形成三聚体时生物活性最强， 受体激活时也呈三聚体形式， 三聚体 顶部附近的锌结合位点对维持 TRAIL 的结构及稳定性起重要作用。体外实验表明， 全长或 可溶形式的 TRAIL（sTRAIL） 形成的三聚体都可以快速诱导多种肿瘤细胞凋亡。刘新垣院 。
10、士等采用 ZD55-TRAIL 复合使用在治疗癌症中亦有很好的治疗效果。本研究所许瑞安教授 等采用腺相关病毒载体介导 sTRAIL 进行了治疗肝癌和肝转移肿瘤的相关研究， 其实验结 果证明 ： sTRAIL 能抑制肿瘤的生长。 0006 目前为止已发现 5 种 TRAIL 受体 ： DR4、 DR5、 DcR1、 DcR2 和 OPG(osteoprotegerin, 护骨素 )。当 TRAIL 与 DR4、 DR5 结合时可以诱导靶细胞凋亡。其中 DR4 又称 TRAIL-RI， 属 I 型跨膜受体， 含有 468 个氨基酸， 由 DR4 胞外区 (eDR4)、 跨膜区和胞内区 3 个部分组。
11、成。 eDR4 可以选择性地结合 TRAIL。 0007 Fas 又名 CD95， 属 TNFR/NGFR 超家族成员， 是 I 型跨膜糖蛋白受体， 由 319 个氨基 酸残基组成， 分子量为 36KD。人 Fas 有两种形式 ： 膜结合型和可溶型， 其区别在于有无跨膜 说 明 书 CN 103288966 B 3 2/8 页 4 区， 可溶的 sFas 是由于交替拼接转录翻译所致。近年来， Fas 介导凋亡信号传导机制的研 究取得了很大的进展， 主要有以下途径 ： A)FasL 和 Fas 结合后将凋亡信号转导到细胞内， 激 活 Caspase-8， 引起 Caspase 级联反应最终导致细。
12、胞凋亡 ； B)Caspase-8 将 Bcl-2 家族成员 Bid 切割成 tBid， tBid 促进线粒体释放细胞色素 C 到胞浆， 激活 Caspase-9， 从而激活效应 Caspase-3而导致细胞凋亡 ； C)Zhenyue Hao等发现了一种新的御接蛋白-Daxx， Daxx与Fas 的死亡结构域 DD 结合后， 激活 JNK 信号通路， 最终导致细胞凋亡 ； D)FasL 和 Fas 结合后还 可激活膜鞘磷脂酶， 产生可溶性的神经酰胺而激活Caspase， 诱导细胞凋亡。 最近研究发现， 肝癌组织中 Fas 蛋白的表达显著低于癌周组织， 这提示促进肝癌细胞 Fas 表达有助于肝。
13、癌 的治疗。另一方面， 有研究发现， TRAIL 通过其 DR 受体对肿瘤的凋亡尽管具有较 FasL 在保 护正常细胞方面的优越性， 但其对肿瘤的凋亡诱导作用仍具有不稳定性， 效果不如 Fas。 0008 Survivin 基因是 1997 年 Ambrosini 等首次利用效应细胞蛋白酶受体 -1cDNA 在 人类基因组文库的杂交筛选中分离得到的， 是凋亡抑制蛋白新成员。近年来研究发现 ： Survivin 是目前发现特异性最强的凋亡抑制因子， 并在大多数恶性肿瘤中特异性高表达， 在肿瘤细胞和组织中具有较强的转录活性。而 Survivin 启动子能介导目的基因能特异性 表达于各种肿瘤细胞， 。
14、而不表达于正常分化细胞和静止的血管内皮细胞， 具有高度的肿瘤 组织特异性。研究表明 ： 采用长度为 980bp、 440bp、 260bp 的 Survivin 启动子靶向基因治疗 可选择性地杀死肿瘤细胞， 而对正常细胞则无影响。 0009 TRAIL 与其受体 DR4(death receptor4) 选择性高效结合， 以一种高效低毒的方式 靶向性介导肿瘤细胞凋亡， 而对正常细胞无毒副作用， 具有肿瘤细胞靶向性。FAS 通路可通 过多种信号途径介导细胞凋亡， 其胞内区(intracellular FAS,iFAS)在传递凋亡信号中发 挥着关键性的作用， 是引起细胞程序性死亡的主要途径。iFa。
15、s 凋亡诱导效应虽然明显强于 TRAIL， 但特异性远不如 TRAIL。 【发明内容】 0010 本发明要解决的技术问题之一， 在于提供一种融合受体， 能够应用于靶向治疗大 肠癌的基因药物中， 能够显著促进大肠癌细胞的凋亡。 0011 本发明是这样实现的上述技术问题之一的 ： 0012 一种融合受体， 所述融合受体是由eDR4基因和iFAS基因连接融合而成， 所述融合 受体的基因序列如 SEQ ID NO.1 所示。 0013 进一步地， 所述融合受体所编码的蛋白能与肿瘤相关凋亡诱导配体 TRAIL 蛋白相 结合。 0014 本发明要解决的技术问题之二， 在于提供一种用于治疗大肠癌的基因药物，。
16、 能够 显著促进大肠癌细胞的凋亡， 可解决部分肿瘤对 TRAIL 不敏感 , 甚至耐受的问题。 0015 本发明是这样实现的上述技术问题之二的 ： 0016 一种用于治疗大肠癌的基因药物， 所述基因药物包含一种融合受体基因以及 sTRAIL 基因， 所述融合受体的基因序列如 SEQ ID NO.1 所示。 0017 进一步地， 所述基因药物的使用方法为 ： 使用 CAG 组成型启动子驱动 sTRAIL 目的 基因表达， 肿瘤特异性 Survivin 启动子驱动 eDR4 基因与 iFAS 基因融合受体表达， sTRAIL 通过其 DR 受体及 eDR4 基因与 iFAS 融合受体多靶点进行信号。
17、转导， 特异诱导肿瘤细胞凋 说 明 书 CN 103288966 B 4 3/8 页 5 亡。 0018 进一步地， 所述基因药物可以通过非病毒载体系统或病毒载体系统进行基因传 递， 治疗大肠癌。 0019 本发明具有如下优点 ： 0020 1) 利用死亡受体 DR4 以及受体 FAS 两者介导细胞凋亡的优势， 设计出融合受体 eDR4/iFAS。利用受体 - 配体结合的特点， 将所述的融合受体与其配体 TRAIL 有效结合而达 到促进靶细胞凋亡的目的。 0021 2)分别使用CAG组成型启动子和肿瘤特异性Survivin启动子驱动sTRAIL和所述 融合受体 eDR4/iFAS 在大肠癌细胞。
18、内的表达， 从而达到高效、 特异诱导大肠癌细胞的凋亡。 可解决部分肿瘤对 TRAIL 不敏感 , 甚至耐受的问题。 【附图说明】 0022 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。 0023 图 1 是本发明 eDR4、 iFAS 及 eDR4/iFAS 基因片段 PCR 扩增结果合成电泳图。 0024 图 2 是本发明 pAM-SVN-eDR4/iFAS 重组质粒的电泳图。 0025 图 3 是本发明 pAM-CAG-sTRAIL 重组质粒的鉴定结果电泳图。 0026 图 4A 是本发明中用 MTT 法测得转染后 60h 的 HEK293 细胞的细胞存活率柱状图。 0027 图 4B 。
19、本发明中用 MTT 法测得转染后 60h 的 HT-29 细胞的细胞存活率柱状图。 0028 图 5 是本发明使用 RT-PCR 检测 eDR4/iFAS 及 sTRAIL 基因在 HT-29 细胞中的表达 情况的电泳图。 0029 图 6 是本发明使用 Western Blot 检测 sTRAIL 蛋白在 HT-29 细胞中的表达情况的 电泳图。 0030 图 7 是本发明用荧光显微镜从形态学上观察 HT29 细胞的凋亡情况显微图。 0031 图 8A 是本发明使用 Hoechst33342 荧光染料染色分析转染后各组 HT-29 细胞的凋 亡情况显微图。 0032 图 8B 是本发明使用 。
20、Hoechst33342 荧光染料染色分析转染后各组 HT-29 细胞核异 常率柱状图。 0033 图 9 是本发明使用 MTT 法检测感染病毒后， 各组 HT-29 细胞的细胞存活率柱状图。 0034 图 10 是 pAM-SVN-eDR4/iFAS 载体的构建结果的 eDR4/iFAS 基因测序图。 【具体实施方式】 0035 请参阅图 1 10 所示， 对本发明的实施例进行详细的说明。 0036 本发明涉及一种融合受体， 所述融合受体是由 eDR4 基因和 iFAS 基因连接融合而 成， 所述融合受体的基因序列如 SEQ ID NO.1 所示。 0037 所述融合受体所编码的蛋白能与肿瘤。
21、相关凋亡诱导配体 TRAIL 蛋白相结合。 0038 本发明还涉及一种用于治疗大肠癌的基因药物， 所述基因药物包含融合受体基因 以及 sTRAIL 基因， 所述融合受体的基因序列如 SEQ ID NO.1 所示。 0039 所述基因药物的使用方法为 ： 使用 CAG 组成型启动子驱动 sTRAIL 目的基因表达， 肿瘤特异性 Survivin 启动子驱动 eDR4 基因与 iFAS 基因融合受体表达， sTRAIL 通过其 DR 说 明 书 CN 103288966 B 5 4/8 页 6 受体及 eDR4 基因与 iFAS 融合受体多靶点进行信号转导， 特异诱导肿瘤细胞凋亡。本发明 中采用 。
22、440bp Survivin 启动子。 0040 所述基因药物可以通过非病毒载体系统或病毒载体系统进行基因传递， 治疗大肠 癌。 0041 以下结合实施例对本发明作进一步的说明。 0042 实施例一、 pAM-SVN-eDR4/iFAS 与 pAM-CAG-sTRAIL 载体构建 0043 1、 eDR4/iFAS 基因的获取及载体构建 0044 1） eDR4/iFAS 基因的获取 0045 在 GenBank 查找分析出死亡受体 DR4 胞外区 eDR4 的基因序列， 并设计相应的特异 性引物， 一同委托上海生工生物工程股份有限公司合成。 0046 a） eDR4 基因的获取 ： 将带 e。
23、DR4 基因序列的 pUC57-eDR4/DH5 甘油菌进行活化， 按照质粒小量提取试剂盒 （Beyotime） 提取质粒 pUC57-eDR4， 并以此质粒为模板使用特异 性引物 ： Sense primer:CACGTGGGGATCCA CCATGGCGCCACCACCAGC ； Antisense primer: 0047 CTTCCTTTCTCTTACCTGAGCCGATGCAACAAC 进行 PCR。PCR 具体反应体系为 Pyrobest DNA Polymerase(Takara)0.3L， 10Pyrobest Buffer II5L， dNTP Mixture( 各 2.5m。
24、M)4L，质 粒 pUC57-eDR40.2L，引 物 S(20M)0.5L，引 物 A(20M)0.5L， ddH2O39.5L ； 扩增条件为945min(9430s,5530s,7290s)30Cycles7210mi n 4。 0048 然后， 2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物， 鉴定结果为eDR4基因， 后使用DNA凝胶回 收试剂盒 （Beyotime） 进行回收， -20保存备用。其中鉴定结果如图 1 泳道 3 所示， 目的片 段大小位于 750bp 与 1000bp 之间， 与预期值 801bp 相符合。 0049 b） iFAS 基因的获取 ： 将 pUC19-iFAS/DH5。
25、 进行活化， 按照质粒小量提取试剂 盒 （Beyotime）提取质粒 pUC19-iFAS， 并以其为模板使用特异性引物 Sense primer:CGG CTCAGGTAAGAGAAAGGAAGTACAGAAAACATGC ； Antisense primer:AATGAAATCCAAAGCTTGGTC 进 行 PCR， 反 应 体 系 为 Pyrobest DNA Polymerase(Takara)0.3L， 10Pyrobest Buffer II5L， dNTP Mixture( 各 2.5mM)4L， 质粒 pUC19-iFAS0.2L， 引物 S(20M)0.5L， 引 物A(2。
26、0M)0.5L， ddH2O39.5L ； 扩增条件为945min(9430s,5530s,7260s)3 0Cycles 72 10min 4。 0050 2% 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物， 鉴定结果为 iFAS 基因， 后使用 DNA 凝胶回收试 剂盒 （Beyotime） 进行回收， -20保存备用。其中鉴定结果如图 1 泳道 2 所示， 目的片段大 小位于 500bp 稍下方， 与预期值 435bp 相符合。 0051 c） eDR4 与 iFAS 基因融合受体的获取 0052 分别获得 eDR4 基因和 iFAS 基因后， 使用 eDR4 基因序列的 Sense primer 。
27、和 iFAS 基因序列的 Antisense primer 进行重叠 PCR 将这两个基因片段进行连接， 形成融合受 体基因 eDR4/iFAS， 重叠 PCR 反应体系如下 ： Pyrobest DNA Polymerase(Takara)0.3L， 10Pyrobest Buffer II5L， dNTP Mixture( 各 2.5mM)4L， 引物 S、 引物 A(20M) 各 0.5L， eDR4PCR产物0.5L， iFAS PCR产物1L， ddH2O38.2L ； 扩增条件为945min (94 30s,55 30s,72 90s)30Cycles 72 10min 4。 00。
28、53 2% 琼脂糖电泳鉴定 PCR 产物正确后， 即获得的产物为 eDR4 与 iFAS 融合受体， 然 说 明 书 CN 103288966 B 6 5/8 页 7 后进行回收。其中鉴定结果如图 1 泳道 4 所示， 目的片段大小位于 1000bp 上方， 与预期值 1235bp 相符合。 0054 图 1 是本发明 eDR4、 iFAS 及 eDR4/iFAS 基因片段 PCR 扩增结果合成电泳图 ； 其中 泳道 1 为 DNA 分子量标准 DL2000， 泳道 2 为 iFAS 的 PCR 扩增片段， 泳道 3 为 eDR4 的 PCR 扩增片段， 泳道 4 为 eDR4/iFAS 的重。
29、叠 PCR 扩增片段。电泳图表明 ： PCR 扩增获得的 eDR4、 iFAS 及 eDR4/iFAS 基因片段大小与预期的数据符合。 0055 2） pAM-SVN-eDR4/iFAS 载体的构建 0056 将获得的 eDR4 与 iFAS 融合受体使用 BamH 和 EcoR 限制性核酸内切酶进行酶 切， 酶切体系为 ： eDR4/iFAS PCR 产物 20L， 10K3L， EcoR 0.5L BamH 0.5L， ddH2O6L， 反应条件为 ： 37， 3h。酶切反应结束后， 对酶切产物进行 DNA 凝胶回收， 回收产 物置 -20保存备用 ； 0057 使用 EcoR 和 Bam。
30、H 进行酶切 pAM-SVN-sTRAIL 质粒。在 1.5mL 离心管中， 制备 如下双酶切反应体系 ： 10K5L， 质粒 DNA（2g/L） 40L， EcoR 1L， BamH 1L， ddH2O3L， 反应条件为 ： 37， 3h。 酶切反应结束后分别回收载体片段pAM-SVN及sTRAIL片 段 ； 0058 经 EcoR 、 BamH 双酶切后的目的片段 eDR4/iFAS 与经 EcoR 、 BamH 双酶切 的载体片段 pAM-SVN 进行连接反应。在 1.5mL 离心管中， 制备如下连接反应体系 ： 目的片 段 8L， 载体片段 0.5L， 10T4 缓冲液 1L， T4D。
31、NA ligase（大连宝生物工程有限公司） 0.5L。反应条件为 16， 过夜， 得到连接产物， 即 pAM-SVN-eDR4/iFAS 载体。 0059 将上述连接产物转化到大肠杆菌 E.coli DH5 感受态细胞中， 涂布 LB/Amp+ 平 板， 得到带重组质粒pAM-SVN-eDR4/iFAS的工程菌， 提取pAM-SVN-eDR4/iFAS质粒进行酶切 鉴定， 酶切反应结果如图 2 所示。 0060 图 2 是本发明 pAM-SVN-eDR4/iFAS 重组质粒的电泳图。泳道 1 为 DNA 分子量标 准 DL15000， 泳道 2 为 pAM 空质粒， 泳道 3 为 Xho /。
32、BamH 酶切 pAM-SVN-eDR4/iFAS 质粒 的图谱， 泳道 4 为 BamH /EcoR 酶切 pAM-SVN-eDR4/iFAS 质粒的图谱。其中， 泳道 3 为 Xho /BamH 双酶切结果， 其中小片段为 SVN 启动子基因片段， 显示在 250bp 上方， 与预 期的 SVN 启动子基因大小 440bp 相符。泳道 4 为 BamH /EcoR 双酶切结果， 其中小片段 为 eDR4/iFAS 基因片段， 显示在 1000bp 上方， 与预期的 eDR4/iFAS 基因大小相符。双酶切 鉴定结果表明 pAM-SVN-eDR4/iFAS 重组质粒已经成功构建。 0061 。
33、上述连接产物经上海生工生物工程股份有限公司基因测序， 测序结果 （如图 10 所 示） 与设计的 eDR4/iFAS 基因序列完全一致， 进一步证明 pAM-SVN-eDR4/iFAS 重组质粒构建 成功。 0062 2、 pAM-CAG-sTRAIL 载体的构建 0063 使用 EcoR 和 BamH 核酸限制性内切酶对 pAM-CAG-eGFP 质粒进行双酶切， 回收 载体片段 pAM-CAG， 并与经 EcoR 和 BamH 双酶切的 sTRAIL 片段连接， 连接反应过程为， 在 1.5mL 离心管中， 制备如下连接反应体系 ： 目的片段 8L， 载体片段 0.5L， 10T4 缓冲 。
34、液 1L， T4DNA ligase（大连宝生物工程有限公司） 0.5L。反应条件为 16， 过夜， 得到 连接产物。 0064 将该连接产物转化到大肠杆菌 E.coli DH5 感受态细胞中， 涂布 LB/Amp+ 平板， 说 明 书 CN 103288966 B 7 6/8 页 8 得到带重组质粒 pAM-CAG-sTRAIL 的工程菌， 提取质粒进行酶切鉴定， 鉴定结果的电泳图如 图 3 所示。图 3 是本发明 pAM-CAG-sTRAIL 重组质粒的鉴定结果电泳图。泳道 1 为 DNA 分子 量标准DL15,000 ； 泳道2为pAM-CAG-sTRAIL质粒， 泳道3为BamH酶切p。
35、AM-CAG-sTRAIL质 粒， 泳道6为DNA分子量标准DL2000。 其中， 泳道4为Xho/BamH双酶切pAM-CAG-sTRAIL 质粒， 酶切图谱小片段为 CAG 启动子， 大小位于 1000bp 左右， 与预期值相符 ； 泳道 5 为 BamH /EcoR 双酶切 pAM-CAG-sTRAIL 质粒， 酶切小片段为 sTRAIL 基因， 大小处于 500bp 与 750bp 之间， 与预期值 575bp 相符。电泳鉴定结果表明 ： 0065 pAM-CAG-sTRAIL 重组质粒已成功构建。 0066 实施例二、 重组质粒对细胞存活和凋亡的影响 0067 1、 大量提取、 纯化。
36、重组质粒 0068 利用QIAGEN plasmid Mega Kit试剂进行重组质粒pAM-CAG-eGFP、 pAM-SVN-eDR4/ iFAS 及 pAM-CAG-sTRAIL 的大量提取、 纯化， 并使用紫外分光光度计分别测得上述三种重组 质粒核酸 DNA 的 A260/A280的比值， 且均处于 1.8 2.0 正常范围内。 0069 2、 MTT 法测定细胞存活率 0070 本实施例所采用的细胞是人胚肾细胞株 HEK293 及人大肠癌细胞株 HT-29， 所有细 胞均在含有 10% 胎牛血清 （GIBCO） 、 100U/ml 氨苄青霉素和 100g/mL 硫酸链霉素 （Sigm。
37、a） 的 DMEM 培养基 （GIBCO） 中， 37、 5%CO2、 饱和湿度的标准环境条件下进行连续培养。转染前 一天， 细胞以 104个 / 孔的量接种于 96 孔板中。采用 Lipofectamine2000 （Invitrogen） 试 剂进行瞬时转染细胞， 按照说明书的操作进行， 转染各组质粒用量均为 0.2g， 其中共转染 组的质粒比例是 1:1。转染后 60h 加入 MTT 进行检测。 0071 图 4A 为用 MTT 法测得转染后 60h 的 HEK293 细胞的细胞存活率柱状图 ； 图 4B 为 用 MTT 法测得转染后 60h 的 HT-29 细胞的细胞存活率柱状图 ； 。
38、在人胚肾细胞株 HEK293 细 胞中， 转染质粒的各组细胞存活率不存在显著性差异 ； 而在 HT-29 细胞中， sTRAIL 组的细胞 存活率为 40.9%， 而 （eDR4/iFAS+sTRAIL） 组的细胞存活率为 21.6%， 二者间存在显著性差异 （p0.05） ， 即说明 eDR4/iFAS 与 sTRAIL 组合比 sTRAIL 对 HT-29 细胞的凋亡效果更好。 0072 3、 RT-PCR 检测目的基因的表达 0073 转染 48h 后， 采用 Trizol Reagent(Invitrogen) 进行总 RNA 提取 （由此开始在 冰上进行操作） ， 立刻进行反转录 （。
39、相关试剂购自 Zoman） ： 加入 Reaction Buffer(5)10 L,dNTP(10mM)1L,Rnasin(40U/L)1L,M-MuLV 反 转 录 酶 (RNase H-)2L,Random Primer1L, 总 RNA5L, 补充经 DEPC 处理过的 ddH2O 至 50L, 充分混匀后 65， 5min ； 4， 10min ； 25， 10min ； 42， 50min ； 70加热 15min 失活 M-MuLV 反转录酶 (RNase H-)。 （反转录产物可以直接用于后续的 PCR 反应， 也可以 -20冻存以备以后使用。 ） 0074 以反转录产物为模板，。
40、 进行普通 PCR 反应， 反应体系及过程如实例一中 pAM-SVN-eDR4/iFAS载体的构建和pAM-CAG-sTRAIL载体的构建载体的构建所述。 检测结果 如图 5 所示， 图 5 是本发明使用 RT-PCR 检测 eDR4/iFAS 及 sTRAIL 基因在 HT-29 细胞中的 表达情况的电泳图。其中泳道 1 为 eGFP 组， 泳道 2 为 sTRAIL 组， 泳道 3 为 eDR4/iFAS 组， 泳道 4 为 eDR4/iFAS 和 sTRAIL 共转染组 ； 结果显示 sTRAIL 以及融合受体 eDR4/iFAS 能够 在 HT-29 细胞中进行表达。 0075 4、 。
41、Western Blot 检测目的蛋白的表达 说 明 书 CN 103288966 B 8 7/8 页 9 0076 在转染各组质粒 48h 后， 用裂解液裂解 HT-29 细胞 （冰上操作） ， 充分裂解后， 收 集细胞碎片及裂解液 4， 14000rpm， 30min 离心后取上清。经 BCA 蛋白浓度检测试剂盒 （Beyotime） 测定蛋白浓度， 取 50g 蛋白上清进行 12%SDS-PAGE 电泳， 之后进行转膜， 剪下 目的蛋白条带， 用 5% 脱脂奶粉封闭过夜， 按 1 ： 500 加入对应性一抗 （小鼠抗人 TRAIL 一抗， Santa） ， 37孵育 2h， 用 TBST。
42、 洗 3 次， 用 1 ： 1000 的二抗 （山羊抗小鼠 IgG-HRP， Beyotime） 孵育 2h， 再用 TBST 洗 3 次， 用 ECL 检测试剂盒 （Beyotime） 显影。检测结果如图 6 所示， 图 6 是本发明使用 Western Blot 检测 sTRAIL 蛋白在 HT-29 细胞中的表达情况的电泳图。其 中泳道 1 为 eGFP 组， 泳道 2 为 sTRAIL 组， 泳道 3 为 eDR4/iFAS 和 sTRAIL 共转染组。由图 6 可知， 在 HT-29 细胞中能检测到 sTRAIL 蛋白的表达。 0077 5、 细胞凋亡的检测 0078 1） 形态学检。
43、测 0079 细胞瞬时转染 48h 后， 使用荧光显微镜观察转染不同质粒后的细胞状态， 整理分 析各组细胞形态学的变化， 结果见图 7。图 7 是本发明用荧光显微镜从形态学上观察 HT29 细胞的凋亡情况的显微图， 从图上可看出 sTRAIL 组以及 eDR4/iFAS 和 sTRAIL 共转染组的 细胞皱缩、 变圆， 细胞形态与阳性对照组相似。 0080 2） Hochest 染色检测 0081 打开一次性无菌细胞培养 6 孔板， 滴加 200L PBS/ 孔， 将经过高压蒸汽灭菌 处理的一般盖玻片依次小心放入培养板孔底， 每孔接种 105个 HT-29 细胞， 第二天使用 Lipofect。
44、amine2000 进行转染 , 每组 4g 质粒 DNA。转染 48h 后， 弃掉培养上清， 按照 1:200 的比例依次加入细胞染色缓冲液、 Hoechst 染色液 （Beyotime）冰浴 20 30min。 染色后， 预冷 PBS 洗涤两次， 直接在荧光显微镜下观察， 结果见图 8。图 8A 是本发明使用 Hoechst33342荧光染料染色分析转染后各组HT-29细胞的凋亡情况的显微图， 图8B是本发 明使用 Hoechst33342 荧光染料染色分析转染后各组 HT-29 细胞核异常率柱状图。 0082 结果显示， eDR4/iFAS 和 sTRAIL 组的细胞凋亡比其他对照组的明。
45、显。这进一步说 明了融合受体 eDR4/iFAS 与 sTRAIL 组合确实能诱导 HT-29 细胞凋亡。 0083 实施例三、 rAAV2 的包装、 纯化及其活性验证 0084 1、 rAAV2 的包装 0085 本发明使用常规磷酸钙共沉淀法转染 HEK293 细胞， 利用三质粒系统包装 rAAV2， 所包装的 rAAV2 包括 rAAV2.eGFP、 rAAV2.sTRAIL 及 rAAV2.eDR4/iFAS， 其中 rAAV2.eGFP 作 为对照组。 0086 2、 rAAV2 的纯化 0087 转染 64h 后收获病毒。收集细胞后， 反复冻融裂解细胞， CsCl 密度梯度离心法纯 。
46、化病毒， PBS 透析三次。 0088 3、 MTT 法测定细胞存活率 0089 病毒感染前 24h， 在 96 孔细胞培养板中接种 HT-29 细胞， 104个细胞 / 孔。纯化后 的 rAAV2.eGFP、 rAAV2.eDR4/iFAS、 rAAV2.sTRAIL 病毒经 0.22m 滤器过滤， 设 3 个平行复 孔。 rAAV2.eGFP、 rAAV2.eDR4/iFAS、 rAAV2.sTRAIL三个单独感染组， 感染复数为MOI=104vg/ cell ； 0090 rAAV2.eDR4/iFAS 与 rAAV2.sTRAIL 同 时 感 染 组， 每 种 病 毒 感 染 复 数 。
47、均 为 说 明 书 CN 103288966 B 9 8/8 页 10 MOI=5103vg/cell。病毒感染后 4h 更换成完全培养基， 继续培养 72h。每孔加入 20L MTT 溶液 （5mg/mL， 即 0.5%MTT） ， 继续培养 4h。终止培养， 小心吸去孔内培养液， 每孔加入 150LDMSO 溶解生成的结晶物， 置细胞板振荡器上振荡 10min， 使其充分溶解。在酶标仪上 检测各孔 OD490nm 处的吸光值。结果如附图 9 所示， 图 9 是本发明使用 MTT 法检测感染病 毒后， 各组 HT-29 细胞的细胞存活率柱状图。结果显示 ： 在 HT-29 细胞中， sTRA。
48、IL 组的细胞 存活率为 46.9%， 而 （eDR4/iFAS+sTRAIL） 组的细胞存活率为 27.9%， 二者间存在显著性差异 （p0.05） ， 与脂质体转染质粒的结果一致， 证明 （eDR4/iFAS+sTRAIL） 此基因药物无论以非 病毒载体还是以病毒载体递送都能显著促进大肠癌细胞凋亡。且共感染组 （rAAV2.eDR4/ iFAS+rAAV2.sTRAIL） 与rAAV2.sTRAIL感染组比较， 共感染组能显著性地降低HT-29细胞的 细胞存活率， 证明了增加细胞膜上的融合受体 eDR4/iFAS 的表达能够显著性地促进癌细胞 凋亡。 0091 本发明利用死亡受体 DR4 。
49、以及受体 FAS 两者介导细胞凋亡的优势， 设计出融合受 体eDR4/iFAS。 利用受体-配体结合的特点， 将所述的融合受体与其配体TRAIL有效结合而 达到促进靶细胞凋亡的目的。 0092 然后， 分别使用 CAG 组成型启动子和肿瘤特异性 Survivin 启动子驱动 sTRAIL 和 所述融合受体 eDR4/iFAS 在大肠癌细胞内的表达， 从而达到高效、 特异诱导大肠癌细胞的 凋亡。可解决部分肿瘤对 TRAIL 不敏感 , 甚至耐受的问题。 0093 虽然以上描述了本发明的具体实施方式， 但是熟悉本技术领域的技术人员应当理 解， 我们所描述的具体的实施例只是说明性的， 而不是用于对本发明的范围的限定， 熟悉本 领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化， 都应当涵盖在本发明的 权利要求所保护的范围内。 0094 此外， 本发明中所涉及的一种融合受体及其用于治疗大肠癌的基因药物的核苷酸 序列见所附的核苷酸或氨基酸序列表。 说 明 书 CN 103288966 B 10 1/2 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 103288966 B 11 2/2 页 12 序 列 表 CN 103288。