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1、(10)申请公布号 CN 102731641 A (43)申请公布日 2012.10.17 CN 102731641 A *CN102731641A* (21)申请号 201210103512.1 (22)申请日 2012.04.10 CGMCC No5764 2012.02.16 C07K 14/435(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12P 21/02(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01)。
2、 C12R 1/84(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院兰州兽医研究所 地址 730046 甘肃省兰州市城关区徐家坪 1 号 (72)发明人 贾万忠 娄忠子 李宏民 闫鸿斌 倪兴维 (74)专利代理机构 兰州振华专利代理有限责任 公司 62102 代理人 张晋 (54) 发明名称 细粒棘球蚴 EG95 蛋白的修饰及在酵母中的 表达 (57) 摘要 本发明公开一种细粒棘球蚴 EG95 蛋白的修 饰方法， 以及用这种经过修饰后细粒棘球蚴 EG95 蛋白制备重组表达质粒、 重组酵母工程菌， 以及重 组酵母工程菌诱导表达方法。本发明的对细粒棘 球蚴主要免疫原性蛋白 EG95 的修饰方法是。
3、在完 整EG95蛋白的基础上， 从N-端去除23个氨基酸， 从 C- 端截去 22 个氨基酸， 改造后的 tEG95 基因 序列为 SEQ ID No.1， 蛋白序列为 SEQ ID No.2。 用本性发明的方法构建并筛选出酵母单克隆菌株 EG95-1 于 2012 年 02 月 16 日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No.5764。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 。
4、2 页 附图 4 页 1/1 页 2 1. 细粒棘球蚴主要免疫原性蛋白 EG95 的修饰方法， 其特征在于在完整 EG95 蛋白的基 础上， N- 端去除 23 个氨基酸， C- 端截去 22 个氨基酸， 改造后的 tEG95 基因序列为 SEQ 1， 蛋白质序列为 SEQ 2。 2. 权利要求 1 所述的经修饰细粒棘球蚴主要免疫原性蛋白 tEG95 制备重组表达质粒 的方法， 将权利要求 1 所述的改造后的 tEG95 通过 TA 克隆到 pMD18T-Simple 载体上， 构 建 pMD18T-tEG95 重组载体， 再将重组 pMD18T-tEG95 载体和 pPIC9K 进行 Eco。
5、R I 和 Not I 双酶切， 然后再用 T4DNA 连接酶将 tEG95 基因片段和 pPIC9K 载体进行连接， 构建成含有 -Factor 信号肽的酵母表达载体 pPIC9K-tEG95。 3. 用权利要求 2 所述的重组质粒构建重组酵母工程菌的方法， 其特征是将权利要求 2 所述的酵母表达载体pPIC9K-tEG95经Sal I酶切， 然后采用1500V， 200， 25F电击5ms， 将 酶切产物转化毕赤酵母 GS115， 转化液涂布 MD 平板， 然后转接含有 1mg/mL 的 YPD 平板上培 养， 后转至含 2mg/mL YPD 平板获得抗性菌株， 将抗性菌转接含 2mg/m。
6、L YPD 液体培养基， 96 孔细胞培养板上进行有限稀释获取抗性酵母工程菌单克隆。 4. 用权利要求 3 所述的方法构建并筛选出酵母单克隆菌株 EG95-1， 该菌株于 2012 年 02 月 16 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No5764。 5. 权利要求 4 所述的菌株诱导表达方法， 其特征在于将重组工程菌株 EG95-1 接种于 15mL BMGY 液体培养基中， 28培养 24h 左右， 当 OD600 5 6 时， 室温 1500r/min 离心 5min收获细胞， 将收获的细胞用20mL BMMY培养基悬浮于250mL的三角瓶中， 。
7、无菌培养容器 透气封口膜扎口， 28诱导表达， 每24h向培养基中补加甲醇至终浓度为0.51左右， 以保证持续的诱导表达。 6.对抗性酵母工程菌EG95-1进行PCR鉴定所用的扩增引物序列为SEQ2和SEQ3。 权 利 要 求 书 CN 102731641 A 2 1/4 页 3 细粒棘球蚴 EG95 蛋白的修饰及在酵母中的表达 技术领域 0001 本发明涉及一种细粒棘球蚴 EG95 蛋白的修饰方法， 以及用这种经过修饰后细粒 棘球蚴 EG95 蛋白制备重组表达质粒、 重组酵母工程菌， 以及重组酵母工程菌诱导表达方 法。 背景技术 0002 棘球蚴病 (Echinococcosis) 又称包虫。
8、病 (Hydatid disease)， 是由棘球绦虫续绦 期的幼虫寄生于哺乳动物 ( 包括人 ) 体内肝、 肺等脏器而引起的一种对人畜危害极为严重 的人畜共患寄生虫疾病。该病呈世界性分布， 我国是包虫病发病最高的国家之一。在我国 以细粒棘球蚴引起的囊型包虫病 (cystic echinococcosis， CE) 和多房棘球绦虫引起的泡 型包虫病 (alveolar echinococcosis， AE) 分布最为广泛， 其中以囊型包虫病 (CE) 为主。 CE 对人畜危害极为严重， 人可因误食虫卵感染该病， 在肝、 肺等器官形成占位性病灶。各种 动物 ( 包括人 ) 都可因囊泡破裂而产生严。
9、重的过敏反应而突然死亡。该病可导致我国畜牧 业每年直接经济损失达 30 多亿元， 造成严重的经济损失， 严重威胁我国流行区农、 牧民身 体健康和畜牧业的发展， 是 “健康中国 2020 行动计划” 规划防治的五大寄生虫病之一。 0003 控制包虫病的流行主要是通过切断棘球绦虫生活发育环节， 预防中间宿主 ( 人、 畜 ) 对棘球蚴的感染， 预防或驱虫治疗终宿主 ( 犬 )， 阻断虫卵的播散。对中间宿主接种疫 苗可控制包虫病的流行。因此， 通过免疫预防途径控制和消灭包虫病是一项有效的措施和 较为理想的途径。 研究证实， 棘球绦虫六钩蚴分泌抗原具有较好的保护作用， 但由于细粒棘 球蚴有着复杂的生活。
10、史， 无法使其在体外培养中大量增殖， 抗原来源量有限， 因而限制了其 在免疫预防中的广泛应用。大量实验研究发现， EG95 抗原是六钩蚴组成成分中理想的疫苗 抗原候选分子， 已成功用于研制抗绵羊细粒棘球蚴病的疫苗。但现有的重组 EG95 重组蛋白 疫苗抗原使用大肠杆菌生产， 其表达产物多以不可溶的包涵体形式存 在， 难以维持蛋白的 天然结构， 也缺乏蛋白质翻译后加工修饰过程， 从而影响了疫苗的免疫保护效果。 发明内容 0004 本发明提供一种对细粒棘球蚴 EG95 基因进行修饰的处理方法， 这种经修饰处理 后的细粒棘球蚴 EG95 基因可制备出重组表达质粒、 重组酵母工程菌， 以及用这种重组酵。
11、母 工程菌经诱导表达预期具有表达蛋白具有可溶、 纯度高、 易于纯化以及生物学活性高的优 点。 0005 本发明的对细粒棘球蚴主要免疫原性蛋白EG95的修饰方法是在完整EG95蛋白的 基础上， 从 N- 端去除 23 个氨基酸， 从 C- 端截去 22 个氨基酸， 改造后的 tEG95 基因序列为 SEQ 1， 蛋白序列为 SEQ 2。 0006 1. 前述经修饰的细粒棘球蚴主要免疫原性蛋白 EG95(tEG95) 制备重组表达质粒 的方法是将经改造后的 tEG95 通过 TA 克隆到 pMD18T-Simple 载体上， 构建 pMD18T-tEG95 重组载体， 再将重组 pMD18T-tE。
12、G95 载体和 pPIC9K 进行 EcoR I 和 Not I 双酶切， 然后再用 说 明 书 CN 102731641 A 3 2/4 页 4 T4DNA 连接酶将 tEG95 基因片段和 pPIC9K 载体进行连接， 构建成含有 -Factor 信号肽的 酵母表达载体 pPIC9K-tEG95。 0007 用前述的重组质粒构建重组酵母工程菌的方法是将所述的酵母表达载体 pPIC9K-tEG95 经 Sal I 酶切， 然后采用 1500V， 200， 25F 电击 5ms， 将酶切产物转化毕赤 酵母 GS115， 转化液涂布 MD 平板， 然后转接含有 1mg/mL 的 YPD 平板上培。
13、养， 后转至 2mg/mL YPD 平板获得抗性菌株。将抗性菌转接含 2mg/mL YPD 液体培养基， 96 孔细胞培养板上进行 有限稀释获取抗性酵母工程菌单克隆， 对单克隆进行 PCR 鉴定， 扩增引物序列见附录 3， 阳 性单克隆命名为 EG95-1。 0008 用前所述的方法构建并筛选出抗性菌株 EG95-1， 该菌株于 2012 年 02 月 16 日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC)， 保藏号为 CGMCC No5764， 保藏分类命名 ： 巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)。 0009 用前述的抗性菌株 EG95-1 诱导表。
14、达方法是将重组工程菌株 EG95-1 接种于 15mL BMGY 液体培养基中， 28培养 24h 左右， 当 OD600 5 6 时， 室温 1500r/min 离心 5min 收 获细胞， 将收获的细胞用20mL BMMY培养基悬浮于250mL的三角瓶中， 无菌培养容器透气封 口膜扎口， 28诱导表达， 每24h向培养基中补加甲醇至终浓度为0.51左右， 以保证 持续的诱导表达。 0010 对本发明的 EG95-1 抗性菌株进行 PCR 鉴定所用的扩增引物序列为 SEQ 3 和 SEQ 4。 0011 经本发明的修饰方法修饰的细粒棘球蚴 EG95 蛋白， 是对其编码基因进行了优化 和截短处。
15、理， 这种密码子优化和基因截短处理可使其在酵母细胞内高效表达， 而且对 EG95 蛋白保护性抗原决定族的影响不大， 由此构建的表达 EG95 蛋白的重组酵母菌， 可对目的蛋 白进行高效可溶性分泌表达， 且可对目的蛋白进行一定程度的蛋白翻译后加工修饰。 附图说明 0012 附图 1 为本本发明的重组酵母表达载体 pPIC9K-tEG95 的双酶切鉴定电泳图， 其 中 ： M. 为 DL2000Marker ； 1 为 pPIC9K-tEG95 EcoR I 和 Not I 双酶切产物。 0013 附图 2 为本发明的酵母转化子的 PCR 鉴定的电泳图， 其中 ： M 为 DL2000Marker。
16、 ； 1 为重组毕赤酵母 EG95-1 转化子的 PCR 鉴定。 0014 图3为重组毕赤酵母EG95-1甲醇诱导后培养基上清的SDS-PAGE电泳图谱。 其中 ： M. 蛋白质分子质量标准 ； 1.EG95-1 重组酵母菌未诱导时的菌液浓缩上清液蛋白 ； 2.EG95-1 重组酵母菌诱导 48h 培养基浓缩上清液蛋白 ； 3.EG95-1 重组酵母菌诱导 72h 的培养基浓缩 上清液蛋白 ； 4.EG95-1 重组酵母菌诱导 96h 培养基浓缩上清液蛋白。 0015 图 4 为本发明的重组 tEG95 蛋白的 PMF 质谱出峰结果。出峰情况决定质谱结果好 坏， 本图峰值显示质谱测定结果良好。。
17、 0016 图 5 为本发明的重组 tEG95 蛋白的 PMF 质谱检测数据库检索结果。图中提到蛋白 评分大于 85 分的结果可信， 检索蛋白评分最高的均为细粒棘球蚴 EG95 蛋白序列， 表达蛋 白为 EG95 蛋白高度可信。 0017 图 6 为本发明的重组 tEG95 蛋白的糖基化分析结果。其中 ： M. 蛋白质分子质量标 准 ； 1. 未进行酶切的两蛋白条带 ； 2、 3. 接受 Endo H 酶切的蛋白条带， 酶切后目的蛋白由原 说 明 书 CN 102731641 A 4 3/4 页 5 来的两条蛋白带变为一条蛋白带， 因为引入Endo H杂蛋白， 因而在66.0Ku附近出现一条蛋。
18、 白带。 具体实施方式 0018 1 表达载体 pPIC9K-tEG95 的构建方法 0019 1.1 按照 SEQ 1 提供的经密码子优化并截短的 tEG95 基因序列进行序列合成， 并连接到 pMD18T-Simple 载体 (TRKARA， Dalian， Liaoning) 上构建 pMD18-tEG95 克隆载体， 将 pMD18-tEG95 和表达载体 pPIC9K 分别用 EcoR I 和 Not I 进行双酶切， 胶回收目的产物， T4DNA 连接酶连接， 获得表达载体 pPIC9K-tEG95。 0020 1.2 将 pPIC9K-tEG95 用 Sal I 酶切进行线性化，。
19、 准备与毕赤酵母感受态细胞混匀 进行电转化。 0021 2 重组酵母转化子的构建方法 0022 2.1 挑取毕赤酵母 GS115 单菌落， 接种至 YPD 培养基， 所用的 YPD 培养基参见前述 内容， 28下培养至OD600达到1.31.5， 离心收集菌体， 用冰预冷的无菌水和1mol/L的山 梨醇溶液将菌体沉淀各洗涤两次， 最后用 1mL 冰预冷的 1mol/L 的山梨醇溶液悬浮， 制成感 受态细胞。将 10pg 的经 Sal I 线性化的 EG95 基因与 80 的感受态细胞混匀， 采用 1500V， 200， 25F 电击 5ms 将酶切产物转化毕赤酵母 GS115。转化液涂布 MD。
20、 平板， 其 MD 培养基配 方为 ： 1.34 YNB， 410-5生物素和 1葡萄糖， 置 28恒温培养 36h 左右。然后转接含 有 1mg/mL 的 YPD 平板上培养， 所用的 YPD 培养基配方为 ： 1酵母提取物， 2蛋白胨和 2 葡萄糖， 然后转至 2mg/mL YPD 平板获得抗性菌株。将抗性菌转接含 2mg/mL YPD 液体培养 基， 96 孔细胞培养板上进行有限稀释获取抗性酵母工程菌单克隆。 0023 3 酵母抗性转化子单克隆的 PCR 鉴定。 0024 3.1 挑取上述获得的抗性单克隆菌落置于无菌水中混匀， 在 56水浴中加热 2min， 再置于 -70冰箱中， 冷冻。
21、 10min， 如此重复三次。离心后取上清液为模板进行 PCR 扩 增鉴定， 扩增引物序列见附录 3。 0025 3.2 扩增产物在 2的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。在以 G418 抗性毕赤酵母菌基 因组 DNA 为模板的反应管中， 扩增出大小为 333bp 的片段， 而普通酵母菌及 pPIC9K 空载体 转化菌中则无， 表明 tEG95 基因已整合到 GS115 的酵母基因组中， 参见附图 2。如此得到了 重组菌株EG95-1， 该菌株于2012年02月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心 ( 简称 CGMCC)， 保藏号为 CGMCC No5764。 0026 4 摇瓶表。
22、达 0027 将高效表达的重组工程菌株 EG95-1( 菌株为 EG95-1， 重组蛋白为 tEG95) 接种于 15mL BMGY 液体培养基中， 28培养 24h 左右， 当 OD600 5 6 时， 室温 1500r/min 离心 5min 收获细胞。这里所用的 BMGY 培养基配方为 ： 1酵母提取物， 2蛋白胨， 1.34 YNB， 410-5生物素， 1甘油， 100mmol/L 的磷酸盐缓冲液 (pH 6.0)。将收获的细胞用 20mL BMMY 培养基悬浮于 250mL 的三角瓶中， 无菌培养容器透气封口膜扎口， 28诱导表达， 每 24h 向培养基中补加甲醇至终浓度为 0.5。
23、 1左右， 以保证持续的诱导表达。在诱导后 24h 开始取菌， 每隔 24h 取菌一次， 检测目的蛋白表达情况。这里所用的 BMMY 培养基配方 为 ： 1酵母提取物， 2蛋白胨， 1.34 YNB， 410-5生物素， 0.5甲醇， 100mmol/L 的磷 说 明 书 CN 102731641 A 5 4/4 页 6 酸盐缓冲液 (pH 6.0)。 0028 5 重组蛋白 tEG95 的检测与鉴定 0029 5.1 重组蛋白 tEG95 的 SDS-PAGE 分析 0030 重组毕赤酵母EG95-1在BMMY培养基中28诱导表达完成后， 离心收集上清液， 上 清液用丙酮沉淀， 变性后进行 。
24、12 SDS-PAGE 分析， 结果显示在 14ku 左右处出现蛋白质条 带， 参见附图 3， 表明目的蛋白在酵母表达系统内进行 了可溶性分泌表达。 0031 5.2 重组蛋白 tEG95 的质谱分析 0032 从考马斯亮蓝染色凝胶上切下重组蛋白带， 送北京华大中生科技发展有限公司进 行肽指纹图谱分析(PMF)。 通过对质谱测定结果进行数据库检索， 测定蛋白序列为SEQ2， 与数据库 EG95 蛋白序列信息高度一致， 表明发酵上清中的重组蛋白为细粒棘球蚴 EG95 蛋 白， 参见附图 4 和附图 5。 0033 5.3 重组蛋白 EG95-1 的糖基化分析 0034 根据 NEB 公司的 N-。
25、 糖苷内切酶 (Endo H) 的使用说明， 将糖蛋白在糖蛋白变性缓 冲液中 100煮沸 10min 使糖蛋白变性， 加入 1G5 反应缓冲液， 于 37温育 1 3h。酶切 完成后进行 SDS-PAGE 电泳分析 ( 见图 6)， 发现目的蛋白原来的两条带中偏大的条带变小， 目的蛋白变为一条带， 由此确定目的蛋白的糖链被切除。同时说明目的蛋白在酵母表达系 统中表达时进行了糖基化， 表达蛋白更加接近 EG95 天然蛋白的结构， 其生物学活性应较未 进行糖基化的蛋白要高。 0035 以上表明， 经本发明的密码子优化和截短处理后构建的表达 tEG95 蛋白的重组酵 母菌 EG95-1， 可对目的蛋。
26、白， 即 tEG95 蛋白， 进行高效可溶性分泌表达， 完全克服了现有技 术的表达产物多以不可溶的包涵体形式存在， 难以维持蛋白的天然结构和缺乏蛋白质翻译 后加工修饰过程的不足， 从理论上来说， 这会提高疫苗的免疫保护效果。 说 明 书 CN 102731641 A 6 1/2 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 102731641 A 7 2/2 页 8 序 列 表 CN 102731641 A 8 1/4 页 9 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102731641 A 9 2/4 页 10 图 4 说 明 书 附 图 CN 102731641 A 10 3/4 页 11 图 5 说 明 书 附 图 CN 102731641 A 11 4/4 页 12 图 6 说 明 书 附 图 CN 102731641 A 12 。