一种番茄果实成熟基因Sl0658及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810418738.8 (22)申请日 2018.05.04 (71)申请人 昆明理工大学 地址 650093 云南省昆明市五华区学府路 253号 (72)发明人 韩芹芹靖乐宋玉竹张金阳 陈强 (51)Int.Cl. C12N 15/29(2006.01) C12N 15/82(2006.01) A01H 5/00(2018.01) A01H 6/82(2018.01) (54)发明名称 一种番茄果实成熟基因Sl0658及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种番茄果实成熟基。

2、因 Sl0658及其应用， 番茄Sl0658基因和甘酸序列如 SEQIDNO:1所示； 其具有典型的NAC家族保守结 构域， 编码NAC蛋白； 本发明采用功能基因组学相 关技术证实番茄Sl0658基因在番茄果实成熟中 发挥重要作用； 将本发明果实成熟基因Sl0658构 建到植物表达载体上并转入番茄中干涉表达， 转 基因番茄会表现出果实成熟延缓的能力， 可以直 接用于生产中控制果实的成熟进程。 权利要求书1页 说明书6页 序列表4页 附图5页 CN 108715852 A 2018.10.30 CN 108715852 A 1.一种番茄果实成熟基因Sl0658， 其核苷酸序列如SEQ ID NO。

3、:1所示。 2.权利要求1所述的番茄果实成熟基因Sl0658在控制番茄以及其他呼吸跃变型果实成 熟进程中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108715852 A 2 一种番茄果实成熟基因Sl0658及其应用 技术领域 0001 本发明属于分子生物学以及基因工程领域， 具体涉及一种从番茄 (Solanum lycopersicum ) 中获得一个新的果实成熟基因Sl0658及其应用。 背景技术 0002 番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)栽培历史悠久， 因其基因组小， 生长周 期短， 且与拟南芥、 水稻、 玉米等模式植物亲缘关系较远而成为研究肉质果实发育。

4、和成熟的 模式植物。 现已获得大量番茄种质资源、 突变体库、 高密度遗传图谱、 EST 资源， 且瞬时表达 和稳定转化技术成熟。 此外， 2012年5月完成的栽培番茄全基因组精细序列分析极大地推动 了番茄功能基因组学及分子遗传学研究。 果实成熟过程涉及到大量代谢途径的调节以及生 理生化属性的显著改变， 需要对一系列基因的时序性表达进行精密转录调控， 因此番茄成 熟相关转录因子的功能研究成为植物学领域的研究热点之一。 0003 转录因子是一群能与基因5 端上游特定序列(启动子区域)专一性结合， 从而保 证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达蛋白质分子， 通过对目标基因转录水平 的调节， 进。

5、而影响细胞的生物学行为。 通过生物信息学预测， 番茄中至少存在着62个转录因 子家族， 在植物激素合成、 组织细胞膨胀、 细胞壁物质代谢、 调节果实成熟及色素积累等多 个方面发挥着重要的调控作用 （Zhang et al., 2010） 。 NAC 转录因子， 其命名是基于最初 发现的该家族的几个基因首字母的缩写：NAM (NO APICAL MERISTEM) 、ATAF1-2 、CUC2 (CUP-SHAPED COTYLEDON)。 NAC 转录因子一般由两个内含子和三个外显子组成； 前两个外 显子主要编码NAC 的DNA 结合域， 而最后一个外显子编码转录激活域。NAC转录因子在植物 。

6、发育的不同阶段、 低温、 干旱、 病原体和机械损伤等各个方面都发挥极其重要的作用 （Souer et al.， 1996； Takada et al., 2001; Olsen et al., 2005; Hu et al., 2006; Catherineet al., 2010） 。 而它在果实成熟方面的报道迄今为止仅限于LeNAC-NOR (Cantu et al.， 2009)。 番茄突变体nor不能正常成熟， 在果实发育后期没有呼吸释放高峰 和乙烯合成高峰， 但是在受到伤害时可以合成乙烯 （Osorio et al., 2011） 。 0004 基于对番茄中LeNAC-NOR 类似的。

7、乙烯上游转录因子的探索， 本发明从番茄nor 突变体的芯片中克隆得到一个新的NAC基因-Sl0658。 干涉Sl0658的转基因番茄显示果实 成熟进程变慢， 通过合理利用这种转基因材料可以调节番茄的上市时间， 为生产服务， 目前 未见本发明基因的报道。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种番茄果实成熟基因Sl0658， 其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 其具有典型的NAC家族保守结构域， 编码NAC蛋白。 0006 本发明另一目的是将番茄果实成熟基因Sl0658应用在控制番茄以及其他呼吸跃 变型果实 （呼吸跃变型果实是指某些肉质果实从生长停止到开始进入衰老之间的时期， 其 呼。

8、吸速率的突然升高， 例如苹果、 香蕉、 番茄、 鳄梨、 芒果等） 成熟进程中； 具体是将基因 说明书 1/6 页 3 CN 108715852 A 3 Sl0658构建到植物表达载体上并导入番茄中表达， 对获得的Sl0658干涉转基因番茄进行果 实成熟相关生理生化和分子生物学检测， 确认Sl0658可以改变番茄果实的成熟进程， 为后 期利用该基因改良番茄以及其他呼吸跃变型果实成熟进程的能力奠定基础。 0007 本发明克隆番茄Ailsa Craig中携带的一个番茄果实成熟基因的完整C-端特异性 末端序列片段， 利用农杆菌介导法使C-端特异性末端序列片段转入受体番茄中干涉表达， 进而通过实验验证该。

9、基因在番茄果实成熟过程中所起的作用， 为后期利用该基因改良番茄 以及其他呼吸跃变型果实成熟进程的能力奠定基础。 0008 对Sl0658基因进行序列分析， 结果表明Sl0658全长cDNA为1152 bp， 具有783 bp的 开放阅读框(ORF)， 50 bp的5 非翻译区和309bp的3 非翻译区， 编码含有260个氨基酸的蛋 白质。Sl0658编码蛋白具有NAC家族的保守结构域， 与来自苹果 (Malus domestica)、 桃 (Prunus persica)以及其他物种的NAC蛋白高度相似， 干涉表达Sl0658 3 端特异性末端可 以显著延迟番茄果实成熟的进程。 0009 上述。

10、基因可以用于控制番茄和其他呼吸跃变型果实的成熟进程， 具体操作如下： （1） 基因的获得： 以番茄野生型Ailsa Craig为材料， 提取红熟期番茄果实的总RNA， 利 用RT-PCR扩增得到Sl0658 3 端特异性末端， 然后将其连接到pMD18-T载体上， 经测序获得 具有目的片段的克隆。 0010 （2） 植物表达载体构建与遗传转化： 对序列进行酶切位点分析后， 将Sl0658 3 端特异性末端正向序列插入表达载体1300- 35S-X的多克隆位点BamHI-SpeI之间， 反向序列插入表达载体1300-35S-X的多克隆位点Sac I-KpnI之间， 并进行测序验证， 成功构建番茄。

11、干涉表达载体。 0011 提取重组表达载体菌液的质粒， 利用电转化法导入根癌农杆菌C58， 利用农杆菌介 导的遗传转化法转化野生型番茄Ailsa Craig， 对转基因番茄进行抗生素 （卡那霉素） 筛选 和RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) 筛选阳性转基因植株 进行后续分析， 以野生型和转化空载体的番茄植株作为对照。 0012 （3） 转基因番茄果实成熟特性分析： 将生长健壮的转基因植株和对照野生型植株， 分别种植于花盆中。 记录其果实达到成熟的时间， 检测果实成熟相关指标 （包括果实乙烯释 放量、 果实呼吸速率、 。

12、果实硬度、 可溶性固形物含量等） ， 并测定果实成熟相关基因的表达 量， 从而验证Sl0658干涉转基因番茄果实成熟显著延迟。 0013 本发明为控制番茄果实成熟进程提供了一种新的方法， 通过基因工程手段培育转 基因植物能克服传统育种的不足， 缩短育种周期。 将Sl0658基因在番茄中干涉表达， 能够显 著延缓果实成熟的进程， 适度增加果实硬度， 从而可以人为控制果实上市时间， 并且不改变 果实的口感特征， 相比用人工激素处理果实更加绿色环保， 效果也更加稳定， 因而具有明显 的优势和不可取代的重要性。 它可以为呼吸跃变型果实大规模生产提供便捷的途径， 可以 大量减少因果实软化腐烂造成的经济损。

13、失， 可为农业生产节约成本且提高管理水平， 因此 本发明具有广阔的市场应用前景。 附图说明 0014 图1 是本发明Sl0658全长片段和3 端特异性片段 （黑框中的序列） ， 其中， 起始密 码子 （ATG） 和终止密码子 （TAA） 用加粗标注； 说明书 2/6 页 4 CN 108715852 A 4 图2是本发明采用的干涉表达载体1300-35S-X的多克隆位点图 （A） 和目的片段插入表 达载体的示意图 （B） ； 图3是本发明干涉表达转基因番茄在再生阶段 （A） 、 组培苗阶段 （B） 、 对照番茄红熟期 （C） 和Sl0658干涉转基因番茄红熟期 （D） 图片； 图4是本发明对照。

14、番茄 （Wt） 和干涉表达(Sl0658-RNAi)转基因番茄果实不同成熟时期 （绿熟期、 破色期、 黄熟期、 红熟期） 开花后天数比较结果示意图 （A） 、 果实乙烯释放量比较结 果示意图 （B） ； 图5是本发明对照番茄 （Wt） 和干涉表达(Sl0658-RNAi)转基因番茄果实呼吸速率比较 结果示意图 （A） 、 果实硬度比较结果示意图 （B） ； 图6是本发明对照番茄 （Wt） 和干涉表达(Sl0658-RNAi)转基因番茄果实可溶性固形物 含量比较结果示意图 （A） 和成熟相关基因表达量示意图 （B） 。 具体实施方式 0015 下面结合附图， 用本发明的实施例进一步说明本发明的实。

15、质性内容， 但本发明保 护范围不局限于所述内容； 本发明中所用方法如无特别说明均为常规方法。 0016 实施例1：Sl0658 3 端特异性片段的克隆 用液氮将番茄Ailsa Craig红熟期果实研磨成粉末以后， 转入离心管中， 采用Trizol法 提取总RNA。 采用逆转录酶M-MLV (天根)以总RNA为模板合成cDNA 第一链， 反应体系和操作 过程为： 取5 g 总RNA， 依次加入50 ng oligo(dT) 15、 2 L dNTP (2.5mM each)， 最后添 加ddH2O (无RNA酶)至反应体积为13.5 L； 混匀后， 70加热变性5 min后迅速在冰上冷却 5 m。

16、in， 然后依次加入4 L 5First-stand buffer、 0.5 L RNA酶抑制剂 (200U)、 1 L 反转录酶 (200 U)、 1 L二巯基苏糖醇(0.1 M)， 混匀并短时离心， 42温浴1.5 h， 取出后 95加热5 min， 终止反应； cDNA第一链合成后置于-20保存备用。 0017 以合成的第一链cDNA为模板， 扩增Sl06583 端特异性片段 （引物序列为5 - TCGATGTTTATTCTGGGATCTG-3 和5 -TTTTCCCTAAATTTTTCCCTTTC-3 ） 。 采用大连宝生物的高 保真DNA聚合酶ex taq扩增出目的基因， PCR反应。

17、条件： 94 3 min； 94 45 s， 58 30 s， 72 45 s， 30cycles； 72 5 min。 反应体系(20 L)为1 L cDNA、 2 L 10Buffer、 0.4 L dNTP (10 mM each)、 0.1 L 正向引物(20 M)、 0.1 L 反向引物(20 M)、 0.2 L ex Taq DNA polymerase (5 U/ L)、 16.2 L ddH2O； PCR结束后， 取5 L用于琼脂糖凝胶电泳， 检测扩增到目的大小的片段。 0018 将PCR得到的Sl0658 3 端特异性片段 （如图1所示） 进行TA克隆， 使用的试剂盒为 pM。

18、D-18T vector kit (大连宝生物)， 反应体系和操作过程为： 取1.5 L PCR产物， 依次加 入1 L pMD18-T vector (50 ng/ L) 和2.5 L 2Ligation solution I， 混匀置于16 过夜反应。 采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5 中。 在涂于含有 -半乳糖苷酶(X- Gal)、 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、 氨苄青霉素(ampicillin， Amp)的LB固体培养基筛选阳 性克隆。 挑选若干个白色菌落， 摇菌后用扩增Sl0658 3 端特异片段的引物鉴定插入方向正 确的克隆载体。 0019 实施例2： 植物干涉表达载。

19、体构建 Sl0658 3 端特异性片段的PCR产物回收后， 溶于TE缓冲液， 进行BP反应。 反应体系中 说明书 3/6 页 5 CN 108715852 A 5 包括PCR产物50-100 ng， 1300-35S-X载体2 L， 5BP克隆酶反应缓冲液4 L， BP克隆酶混 合物4 L， 补充TE缓冲液 （PH8.0） 至20 L。 反应体系置25温育16 h后加入2 L蛋白酶K溶 液， 37温育10 min以终止BP反应。 从而获得携带有反向重复目的基因的片段 （如图2所 示） ； 筛选阳性克隆。 0020 采用液氮冻融法将构建的植物表达载体转入所制备的农杆菌C58感受态细胞中； 操作步。

20、骤为： 取2 g 表达载体质粒加入含有200 L感受态细胞的离心管中， 轻轻混匀后冰 浴5 min， 接着转入液氮中冷冻1 min， 然后迅速置于37水浴5 min， 之后立即冰浴2 min， 加入800 L LB液体培养基， 28振荡培养4 h。 将活化后的农杆菌涂于含有50 mg/L 卡那 霉素的LB固体培养基上， 28静止培养； 挑选单菌落摇菌， 用扩增Sl0658 3 端特异片段的 引物进行PCR， 检测表达载体是否转入农杆菌中； 对于阳性克隆， 加入甘油后置于-80保存 备用。 0021 实施例3： 番茄的遗传转化 采用的遗传转化体系为农杆菌介导的遗传转化方法， 农杆菌菌株是C58，。

21、 转化受体材料 是番茄野生种Ailsa Craig。 将番茄饱满的种子经过次氯酸钠溶液(有效氯含量2%) 浸泡15 min， 然后将种子用蒸馏水洗净播于1/2 MS的培养基上， 置25， 光周期为16 h光/8 h暗的 条件下进行培养， 至无菌苗长至7-9 d时切取子叶， 在1/2 MS的培养基上暗培养一天。 取重 悬浓度为OD6000.5的农杆菌浸染叶片5 min， 用灭菌滤纸将多余菌液吸干后重新放置在 铺有滤纸的预培养基上， 暗培养2 d后转移至筛选培养基 (基础培养基MS+玉米素2.0 mg/L +卡那霉素100 mg/L +头孢100 mg/L) 对叶片进行分化培养， 两周继代一次， 。

22、等形成愈伤组 织后转移至筛选培养基 (基础培养基MS+玉米素0.2 mg/L+卡那霉素100 mg/L+头孢霉素 100 mg/L)， 至抗性芽长到一定大小后将其切下放入生根培养基中使其生根， 把生根后的抗 性苗转移至灭菌的基质中驯化培养一周， 最后将番茄苗转移至温室或大棚中栽培 （如图3所 示） 。 0022 实施例4： 转基因番茄植株的PCR阳性检测 再生幼苗移栽成活后， 提取转基因单株以及对照Ailsa Craig的幼嫩叶片总RNA， 逆转 录生成第一链cDNA， Ailsa Craig的cDNA作为阴性对照， 用表达载体所含NPT II引物 （引物 序列为5 -AGACAATCGGCT。

23、GCTCTGAT-3 以及 5 -TCATTTCGAACCCCAGAGTC-3 ） 对得到的转基 因材料进行阳性检测； PCR反应总体系为25 l， 包含1 PCR buffer (含Mg2+)、 dNTPs 0.38 mmol/l、 正反向引物各0.62 mol/L、Taq酶1.2 U、 模板约60 ng； 反应程序为95 预 变性5 min、 94 45 s、 58 45 s、 72 1 min， 32个循环， 72 延伸10 min； 最终的 PCR产物用浓度为0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行分析， 凝胶成像系统对电泳图谱进行观察并 记录， 选择阳性转基因植株。 0023 实施例5： 果实开。

24、花后成熟时间统计 在番茄材料开花后进行人工辅助授粉并挂牌标注日期， 统计不同转基因材料达到果 实不同成熟时期 （绿熟期， 破色期， 黄熟期和红熟期） 的时间 （如图4A所示） 。 干涉表达转基因 番茄的果实成熟相比对照显著延迟， 最终成熟时间比对照番茄延迟了10天； 这说明干涉 Sl0658基因以后番茄果实的成熟进程显著延迟。 0024 实施例6： 果实乙烯释放的测定 随机采摘转基因材料和对照不同成熟期果实进行乙烯测定。 用聚丙烯薄膜将果实密 说明书 4/6 页 6 CN 108715852 A 6 封后置于25 48 h， 用注射器从中吸取1 ml气体， 注入气相色谱仪 (Agilent 6。

25、890N, USA) 检测乙烯含量， 记录出峰时间和峰面积， 并与标准乙烯对比计算样品的乙烯释放量， 以ul/L表示。 每时期每样品测定三个果实， 并做三次生物学重复 （如图4B所示） ； 检测结果显 示， 对照番茄在果实成熟的过程中有显著的乙烯释放高峰， 而干涉转基因番茄果实成熟过 程中， 乙烯释放量没有显著的释放高峰， 这表明Sl0658基因被干涉以后， 其果实成熟进程受 到显著抑制。 0025 实施例7： 果实呼吸速率的检测 对转基因果实成熟期进行观察， 并随机采摘转基因材料和对照果实不同成熟时期 （绿 熟期， 破色期， 黄熟期和红熟期） 的果实， 采用CEA-800型红外线CO2分析仪。

26、测定果实的呼吸 强度， 结果表示为CO2 ml/kg/h， 每时期每样品测定三个果实， 并做三次生物学重复 （如图5A 所示） 。 结果显示， 对照番茄在果实成熟的过程中有一个显著的呼吸释放高峰， 显示了呼吸 跃变型果实的典型特征； 然而在干涉转基因番茄果实发育成熟的整个过程中， 呼吸速率都 没有发生显著的变化， 也没有呼吸跃变高峰的出现。 表明Sl0658基因被干涉以后， 其果实成 熟进程受阻。 实施例8： 果实硬度的检测 采取转基因和对照不同成熟时期 （绿熟期， 破色期， 黄熟期和红熟期） 的果实， 用硬度计 （Model GY-1, Cany Precision Instruments 。

27、Co., Ltd, Shanghai, China） 测定每个果 实果顶和赤道对称的四个点， 以柱形探头刺破5 mm果皮时所消耗的力 （N） 表示 （如图5B所 示） 。 结果表明在干涉表达转基因番茄发育的前期， 其果实硬度与对照番茄相比无显著差 异， 但到了果实发育的最终阶段果实硬度是对照的一半， 表明干涉转基因番茄在发育的后 期阶段软化速度减慢。 这表明干涉转基因番茄果实的成熟软化受到抑制。 0026 实施例9： 果实可溶性固形物含量的测定 用手持折光仪 （Atago PAL-1, Co. Ltd., Tokyo, Japan） 测定转基因和对照果实不同 成熟时期 （绿熟期， 破色期， 黄。

28、熟期和红熟期） 果实的可溶性固形物含量， 以百分比表示 （如 图6A所示） 。 结果显示对照番茄随着果实的成熟， 果实的可溶性固形物含量之间升高， 而干 涉转基因番茄的可溶性固形物含量虽然也有所增加， 但是增幅相比对照显著偏小； 在果实 的红熟期， 干涉转基因番茄的可溶性固形物含量是对照的81%。 0027 实时荧光定量 PCR 检测的引物用在线软件Primer 5 设计， 扩增的目的基因片段 的长度控制在80-200 bp 之间， 成熟基因选择ACO1、 ACS2、 ACS4、 PE、 PG2A、 RIN、 NOR。 引物序 列见下表； 提取番茄材料的RNA 后进行反转录得到cDNA。 将该。

29、cDNA 稀释10 倍后用做反应 的模板。 Real time RT-PCR 的扩增选用实时荧光定量PCR仪 (Roche， 美国)， 仪器型号为 Light Cycler 480。 反应总体积为20 l、 包含5 l 模板、 10 l Fast SYBR Green I Master Mix (Roche, 美国)、 正反向引物各1.0 l (10 M)、 3.0 l PCR 水； PCR 反应条 件为9510 min； 95 10s， 58 15 s， 72 20 s， 共45 个循环。 番茄的看家基因 - actin 作为内参 （如图6B所示） 。 结果显示， 干涉转基因番茄中果实成熟基。

30、因ACO1、 ACS2和PE 的表达相比对照显著降低， 分别降低至对照的14%、 54.5%和27%。 PG2A降低至对照的80%。 RIN 和NOR相比对照变化不显著。 这说明Sl0658与番茄果实的成熟存在极其重要的关系， Sl0658 在番茄果实中发挥重要作用； 说明书 5/6 页 7 CN 108715852 A 7 。 说明书 6/6 页 8 CN 108715852 A 8 序列表 昆明理工大学 一种番茄果实成熟基因Sl0658及其应用 21 SIPOSequenceListing 1.0 1 1152 DNA 番茄(Lycopersicon esculentum) 1 aaaaa。

31、gtaga tttttatttt ttaatttcaa agaaaaaaaa aaggattaaa atggtggaaa 60 ttatttcacc aggatttaga ttttatccaa cagaagaaga attaatatct ttttatttac 120 ataaaaagct tgaaggaaaa aagccagagc ttgatagagt aattccagtt gttactattt 180 atgattttga tccttggcat cttccaaaat ttcatgggga attgtgcatg ggagatagag 240 agcaatggtt tttctttgtg ccaa。

32、gacaag aaagagaagc tagaggagga agaccatgta 300 gaacaacaaa ttgtggttat tggaaggcaa ctggttcacc aagttatgtt tattcatcaa 360 ataataaagt tattggagtt aaaaaaagta tggtatttta taaaggaaaa gcaccaactg 420 gtaaaaaaac taagtggaaa atgaatgaat atagagctat tcaagaagaa gttaattcaa 480 ctcttgctat tccaaagtta aggcatgaaa tgagtttatg tc。

33、gaatttac gttatatcgg 540 gaagttttcg agcgttcgat cggagaccaa ttgcaccaac aataacaagg gaaccatcaa 600 aatcaattat aaatcaaggt ggaatttcta tggaaaatgt cactaaaatg gaggcaataa 660 gtgatgaaaa cttatttatg gaagaacaag attatgttaa tcttaatcat aatgatcaaa 720 tccctattat taatcaagaa attaacatca actcacacaa caacaagagg gttaaaagta 。

34、780 atcttcatga tgagactcta attagtggtt gggaacaatt taattggatg taaactcgat 840 gtttattctg ggatctgatt aaatttgatt tatgttcgta taaaatttat catagaaaaa 900 atcactcgat attgaatttt ttccagaaac tgaactcgaa acaacaaagt agagagattt 960 tatccgtctg atataactat cgatagtaaa attaatttct atttcttaag ggttaagaaa 1020 gggaaaaatt tagg。

35、gaaaat attaggatga tttcattata aaatcaaaca tgtaacttgt 1080 actattttga taagaatatt ttattataat atttataatt tttatgaaag taaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aa 1152 2 22 DNA 人工序列(Artificial) 2 tcgatgttta ttctgggatc tg 22 3 23 序列表 1/4 页 9 CN 108715852 A 9 DNA 人工序列(Artificial) 3 ttttccctaa atttttccct ttc 23 4 20 DNA 人工序。

36、列(Artificial) 4 agacaatcgg ctgctctgat 20 5 20 DNA 人工序列(Artificial) 5 tcatttcgaa ccccagagtc 20 6 20 DNA 人工序列(Artificial) 6 taacgggaag tacaagagtg 20 7 22 DNA 人工序列(Artificial) 7 ctaccataca taagaagagc aa 22 8 20 DNA 人工序列(Artificial) 8 gaagagcatg gcgaaaactc 20 9 20 DNA 人工序列(Artificial) 9 序列表 2/4 页 10 CN 。

37、108715852 A 10 gcaatggcct tgaatgattt 20 10 29 DNA 人工序列(Artificial) 10 cgatgatcaa acaatggaga tcgcacttg 29 11 24 DNA 人工序列(Artificial) 11 caataatttt gtttgctcgc acta 24 12 20 DNA 人工序列(Artificial) 12 ggaagctgat ggagagttcg 20 13 20 DNA 人工序列(Artificial) 13 ttccctgttc catcttttgc 20 14 25 DNA 人工序列(Artificial。

38、) 14 acaaactttc catgtgaagg aatta 25 15 26 DNA 人工序列(Artificial) 15 tatacaaaag agcttcatcc tctgaa 26 16 24 序列表 3/4 页 11 CN 108715852 A 11 DNA 人工序列(Artificial) 16 aaacatcatg gcattgtggt gagc 24 17 24 DNA 人工序列(Artificial) 17 atggtgctgc attttcgggt tgta 24 18 20 DNA 人工序列(Artificial) 18 acaacgagga cgatggactt。

39、 20 19 19 DNA 人工序列(Artificial) 19 gtcgaaagac gaccccatc 19 20 20 DNA 人工序列(Artificial) 20 gtcctcttcc agccatccat 20 21 22 DNA 人工序列(Artificial) 21 accactgagc acaatgttac cg 22 序列表 4/4 页 12 CN 108715852 A 12 图 1 说明书附图 1/5 页 13 CN 108715852 A 13 图 2 说明书附图 2/5 页 14 CN 108715852 A 14 图 3 图 4 说明书附图 3/5 页 15 CN 108715852 A 15 图 5 说明书附图 4/5 页 16 CN 108715852 A 16 图 6 说明书附图 5/5 页 17 CN 108715852 A 17 。