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1、(10)授权公告号 CN 102001996 B (45)授权公告日 2012.10.24 CN 102001996 B *CN102001996B* (21)申请号 200910195105.6 (22)申请日 2009.09.03 C07D 215/56(2006.01) (73)专利权人 复旦大学 地址 200433 上海市邯郸路 220 号 (72)发明人 王洪海 张雪莲 郑保富 陆静宁 (74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 31268 代理人 吴桂琴 US 20060142294 A1,2006.06.29, Dayam Raveendra et a。
2、l.Discovery and atructrue-activity relationship studies of a unique class of HIV-1 integrase inhibitors.Chem.Med.Chem. .2006, 第 1 卷 ( 第 2 期 ),238-244. (54) 发明名称 一种抑制结核杆菌生长的化合物及其制备方 法 (57) 摘要 本发明属化学合成领域， 涉及一种抑制结 核杆菌生长的化合物及其制备方法。本发明的 针对日益严重的结核病疫情以及耐药结核病的 出现， 提供具有通式 (I) 结构的 1- 乙基 -4- 羟 基-2-氧-N - 十三甲酰基-。
3、1， 2- 二氢喹啉 -3- 甲 酰肼或其药学可接受的无毒盐。本发明的化合 物经体外结核杆菌抑制试验证实， 可以有效地抑 制结核杆菌的生长 MIC 范围 0.4-2ug/ml， 而且对 临床耐药结核杆菌的生长也有明显的抑制效果。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 孙文倩 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1 页 2 1. 式 （I） 的化合物或其药学可接受的无毒盐在制备治疗结核病药物中的用途 ； 2. 按权利要求 1 的用途， 其中所述的结核病由结核杆菌引起。 权 利 要 求 书 。
4、CN 102001996 B 2 1/5 页 3 一种抑制结核杆菌生长的化合物及其制备方法 技术领域 0001 本发明属化学合成领域， 涉及一种抑制结核杆菌生长的化合物及其制备方法。 背景技术 0002 肺结核是由结核分枝杆菌引起的慢性呼吸道传染病， 据调查， 目前由结核病引起 死亡人数占全球单一感染因素死亡人数的第一位。随着化疗药物的应用， 结核病曾得到有 效控制。但是受人类免疫缺陷病毒 (HIV) 感染的流行、 多重耐药结核分枝杆菌感染增多的 影响， 结核病疫情出现明显回升。 0003 当前我国结核病的疫情十分严重。在全球仅次于印度而居世界第二位。根据最新 全国结核病流行病学抽样调查结果分。
5、析 ： 全国有 5.5 亿人感染结核菌， 患活动性肺结核者 达 450 万， 其中传染性肺结核病人达 200 万， 75肺结核病人年龄在 15-50 岁， 严重影响劳 动生产力。 0004 调查显示， 由于耐药结核病的出现， 引发了全球第三次结核病的回升。全球 5000 万人感染的耐药菌中20为耐多药结核菌， 全球2000万肺结核病人中至少有2/3发展为耐 多药肺结核。 WHO/IUATLD的最新耐药监测估计， 在新病人中， 10.2的病人至少对一种抗结 核药物耐药， MDR-TB 耐药率 1.1 ； 在复治病人中， 18.4的病人至少对一种抗结核药物耐 药， MDR-TB 耐药率 7.0。由。
6、此估计全球每年新出现 30-60 万 MDR-TB 病人 (World Health Organization Tuberculosis Programme.http:/www.who.int/tb/en/)。我国 2000 年全 国结核病调查总耐药率为 27.8， 异烟肼、 利福平 (HR) 的耐药率为 10.7。治疗时间显 示， 耐多药肺结核 (MDR-TB) 的治愈率仅为敏感病例的 50 60， 死亡率高达 37 -89 ( 金周德， 于关成， 曹洪顺 . 吉林医学， 2008， 29(1) ： 72-74.)。研发出针对耐药菌株的药物 已是迫在眉睫。 0005 目前国内外聚焦于研究开发。
7、新型抗结核药物， 当前国际上取得较好研究进展的新 药有 ： 0006 (1) 新型氟喹诺酮类药物 0007 具有强有力的杀灭结核分枝杆菌的作用， 可进一步缩短结核病的化疗疗程， 治疗 耐多药结核， 对潜伏结核感染 (LTBI) 也有良好效果。在众多的新型氟喹诺酮类药物中目 前最为引人关注的是莫西沙星和加替沙星 (Alvirez-Freites EJ， Carter JL， Cynamon MH.Antimicrob.Agents Chemother， 2002， 46， 1022-1025. 0008 (2) 二芳基喹啉类药物 0009 最具代表性的是 R207910， 化学名为 1-(6- 。
8、溴基 -2- 甲氧基 - 喹啉 -3- 基 )-4- 二 甲氨基 -2- 萘 -1- 基 -1- 苯基 - 丁烷 -2- 苯， 分子式为 C32H31BrN2O2， 分子质量为 555.51。 R207910 在体外具有选择性的抗分枝杆菌的作用， 它对药物敏感株和耐药株都具有活 性， MIC 值为 0.03 0.12g/ml。它的作用靶点是 ATP 合成酶的质子泵 (Andries K， Verhasselt P， Guillemont J， et al.Science， 2005， 307 ： 223-7)， 研究表明它比现有的药 物更有效， 并且具有较长的半衰期和针对ATP合成酶的独特的作。
9、用机制。 临床前和I期临床 说 明 书 CN 102001996 B 3 2/5 页 4 实验数据显示药物没有明显的毒性， 在小鼠的感染模型中， R207910、 利福平和吡嗪酰胺联 合或 R207910、 异烟肼和吡嗪酰胺联合治疗一个月所得到的杀菌效果与异烟肼、 利福平和吡 嗪酰胺联合治疗两个月的效果相媲美， 显示了该药物可以有效缩短治疗时间 (Andries K， Verhasselt P， Guillemont J， et al Science， 2005， 307 ： 223-227)。此外， 小鼠和健康人 群对此药有很好的耐受性。R207910 目前现在正进行 II 期临床实验。 0。
10、010 (3) 硝基咪唑吡喃类药物 0011 该类药物中研究较为深入的为 PA-824。PA-824 是一种新的硝基咪唑吡喃类药 物， 分子质量为 359， 自 2002 年起全球结核联盟就对 PA-824 抗结核分枝杆菌的作用开展了 研究。其抗各种结核分枝杆菌敏感菌株的 MIC 值为 0.015 0.25g/ml， 与 INH 相仿 (0.03 0.06g/ml)， 在众多的分枝杆菌中该药仅对结核分枝杆菌复合群具有抗菌活性， 对革兰阳性和阴性菌无明显作用。PA-824 对非繁殖期结核分枝杆菌或持存菌和耐药菌株 均有较强的抗菌活性， 它是通过与 F420 共因子， 抑制蛋白和细胞壁脂类的合成而。
11、发挥作用 的 (Stover CK， Warrener P， VanDevanter DR， et al.Nature， 2000， 405 ： 962-6 ； Tyagi S， Nuermberger E， Yoshimatsu T， et al.Antimicrob AgentsChemother， 2005， 49 ： 2289-93 ； Lenaerts AJ， Gruppo V， Marietta KS， et al.Antimicrob Agents Chemother， 2005， 49 ： 2294-301)， 其与传统的抗结核药物之间无交叉耐药性。 0012 (4) 二胺类药。
12、物 0013 其中 SQ109 最具代表性， SQ109 是在 EMB 的基础上发展起来的第二代抗生素， 但由 于其结构和细胞内作用靶位均与 EMB 有所不同， 因此， 它是一种全新的抗分枝杆菌药物， 而 非 EMB 的类似物。SQ109 的化学名为 N- 金刚烷基 -2- 基 -N -(3， 7- 二甲基辛 -2， 6- 二 烯 )- 乙烷 -1， 2- 二胺， 其作用机制可能作为一种细胞壁的抑制剂， 诱导启动子 Rv0341， 但 其作用的特异性靶位还不清楚。SQ109 抗结核分枝杆菌的 MIC 值为 0.1 0.63g/ml。 SQ109 在体外、 体内和药代动力学上都显示了很好的前景，。
13、 目前正进入临床实验 (Jia L， Tomaszewski JE， HanrahanC， et al.Pharmacol， 2005， 144 ： 80-87.)。 0014 (5)Tetrahydrobenzothiophene(AX20017) 0015 显示抑制结核分枝杆菌 pknG 激酶活性。pknG 的化学靶点导致了 BCG 在溶酶体的 定位， 消除巨噬细胞内的菌体(Walburger A， Koul A， Ferrari G， et al.Science， 2004， 304 ： 1800-4)。AX20017 代表一类靶向胞内持留分枝杆菌的新药的发展。 0016 (6)OPC-。
14、67683 0017 在体外对药物敏感株和耐药株都显示了极好的活性， 与当前一线药物没有交叉耐 药性(Matsumoto M.PLoS Med， 2006， 3 ： 2131-2144)， 且低剂量更有效。 OPC-67683具有较长 的半衰期， CYP 酶作用的缺失和其在免疫功能受损小鼠体内的作用显示该药也许可以治疗 结核与 HIV 共感染的病人。 发明内容 0018 本发明的目的是针对日益严重的结核病疫情以及耐药结核病的出现， 提供一种抑 制结核杆菌生长的化合物。 0019 所述的化合物是具有通式(I)结构的1-乙基-4-羟基-2-氧-N -十三甲酰基-1， 2- 二氢喹啉 -3- 甲酰肼。
15、或其药学可接受的无毒盐。 说 明 书 CN 102001996 B 4 3/5 页 5 0020 本发明另一个目的是提供上述 1- 乙基 -4- 羟基 -2- 氧 -N - 十三甲酰基 -1， 2- 二 氢喹啉 -3- 甲酰肼的制备合成方法。 0021 0022 本发明的化合物通过下述方法制备 ： 0023 0024 (1) 将仪器无水无氧处理， N2 保护， 化合物 A 16.3g 在搅拌下加入 200ml DMF 中， 冰浴下加入 NaH 4.4g， 有大量气泡产生， 然后加入 EtI 31.2g， 搅拌反应 30min， 撤去冰浴， 体系控制在 20-30， 搅拌过夜。溶液减压蒸馏至 2。
16、/3 体积， 加入冰水， 有大量固体析出， 过 滤得粗产品 B(17.13g， 90 )。 0025 (2) 仪器无水无氧处理， N2 保护。搅拌下将丙二酸二乙酯 61.7g 溶于 200ml DMF 中， 加入 NaH 6g， 有大量 H2 产生， 加入化合物 B 31.3g， 温度升至 110， 保温 4h。将 DMF 蒸 出， 加 NH4Cl aq.， 将体系用 HCl 调成酸性， 有白色固体析出， 过滤得产品 C(23g， 53 )。 0026 (3) 将化合物 C 26.3g 溶于 100ml EtOH， 搅拌下加入 N2H4H2O 15ml， 温度升至 EtOH 回流， 反应 3 。
17、小时后以 TLC 检测反应结束。先将体系温度降至室温， 有大量固体析出， 过滤得产品， 将溶液旋干得大极性杂质。直接旋干得粗品 D(78 )。 0027 (4)冰浴下加入化合物D 2g和十三酸2.1g， 加入50ml CH2Cl2搅拌。 体系温度平衡 后， 加 1.9g EDC HCl 和 0.2g DMAP， 撤掉冰浴， 在室温下反应。加入稀 HCl 淬灭反应。收集 CH2Cl2 层， 水相用 CHCl3 萃取。合并有机相， 以 NaHCO3 饱和水溶液、 NaCl 饱和水溶液洗涤。 有机相以 Na2SO4 干燥， 抽滤， 旋干得产品 E。即得产品 1- 乙基 -4- 羟基 -2- 氧 -N。
18、 - 十三 甲酰基 -1， 2- 二氢喹啉 -3- 甲酰肼 (3.3g， 90 )。 0028 本发明的进一步目的是提供含 1- 乙基 -4- 羟基 -2- 氧 -N - 十三甲酰基 -1， 2- 二 说 明 书 CN 102001996 B 5 4/5 页 6 氢喹啉 -3- 甲酰肼或者其药学可接受的无毒盐用于治疗由结核杆菌 ( 包括耐药菌 ) 引起的 结核病。 0029 本发明进行了 1- 乙基 -4- 羟基 -2- 氧 -N - 十三甲酰基 -1， 2- 二氢喹啉 -3- 甲酰 肼体外抑制结核杆菌生长测定， 经体外结核杆菌抑制试验证实， 本发明所述的化合物可以 有效地抑制结核杆菌的生长 。
19、(MIC 范围 0.4-2ug/ml)， 而且对临床耐药结核杆菌的生长也有 明显的抑制效果。 本发明对日益严重的结核病疫情以及耐药结核病的出现提供了一种能有 效抑制结核杆菌生长的 1- 乙基 -4- 羟基 -2- 氧 -N - 十三甲酰基 -1， 2- 二氢喹啉 -3- 甲酰 肼。 具体实施方式 0030 下面结合具体实施例对本发现作进一步阐述， 但不限制本发明。 0031 实施例 1 ： 制备 1- 乙基 -4- 羟基 -2- 氧 -N - 十三甲酰基 -1， 2- 二氢喹啉 -3- 甲 酰肼 0032 0033 步骤一 ： 0034 将仪器无水无氧处理， N2 保护， 化合物 A 16.3。
20、g 在搅拌下加入 200ml DMF 中， 冰浴 下加入 NaH 4.4g， 有大量气泡产生， 然后加入 EtI 31.2g， 搅拌反应 30min， 撤去冰浴， 体系 控制在 20-30， 搅拌过夜。溶液减压蒸馏至 2/3 体积， 加入冰水， 有大量固体析出， 过滤得 粗产品 B(17.13g， 90 )。 0035 步骤二 ： 0036 仪器无水无氧处理， N2 保护。搅拌下将丙二酸二乙酯 61.7g 溶于 200ml DMF 中， 加入 NaH 6g， 有大量 H2 产生， 加入化合物 B 31.3g， 温度升至 110， 保温 4h。将 DMF 蒸出， 加 NH4Cl aq.， 将体系。
21、用 HCl 调成酸性， 有白色固体析出， 过滤得产品 C(23g， 53 )。 0037 步骤三 ： 0038 将化合物 C 26.3g 溶于 100ml EtOH， 搅拌下加入 N2H4H2O 15ml， 温度升至 EtOH 回流， 反应 3 小时后以 TLC 检测反应结束。先将体系温度降至室温， 有大量固体析出， 过滤 说 明 书 CN 102001996 B 6 5/5 页 7 得产品， 将溶液旋干得大极性杂质。直接旋干得粗品 D(78 )。 0039 步骤四 ： 0040 冰浴下加入化合物 D 2g 和十三酸 2.1g， 加入 50ml CH2Cl2 搅拌。体系温度平衡 后， 加 1.。
22、9g EDC HCl 和 0.2g DMAP， 撤掉冰浴， 在室温下反应。加入稀 HCl 淬灭反应。收集 CH2Cl2 层， 水相用 CHCl3 萃取。合并有机相， 以 NaHCO3 饱和水溶液、 NaCl 饱和水溶液洗涤。 有机相以 Na2SO4 干燥， 抽滤， 旋干得产品 E。即得产品 1- 乙基 -4- 羟基 -2- 氧 -N - 十三 甲酰基 -1， 2- 二氢喹啉 -3- 甲酰肼 (3.3g， 90 )。 0041 产品 1- 乙基 -4- 羟基 -2- 氧 -N - 十三甲酰基 -1， 2- 二氢喹啉 -3- 甲酰肼的检 测方法为 ： C18 柱， 5um， 154.6 ； 流动相。
23、 ： 20 CH3CN-80 CH3CN 从 0min-15min ； 流速为 0.8ml/min ； 检测波长为 215nm。 0042 实施例 2 ： 1- 乙基 -4- 羟基 -2- 氧 -N - 十三甲酰基 -1， 2- 二氢喹啉 -3- 甲酰肼 体外抑制结核杆菌生长测定 ： 0043 (1) 结核杆菌的接种 ： 取制备的 lmg/ml 结核杆菌 H37Ra 株菌悬液 5ul， 含菌数量 1-5105， 分别接种于每支含 500ul7H9 的液体培养基 (7H9 干粉 4.7g/L， 含 2ml/L(v/v) 甘 油和 10 ADC， ) 中。 0044 (2)1- 乙基 -4- 羟基。
24、 -2- 氧 -N - 十三甲酰基 -1， 2- 二氢喹啉 -3- 甲酰肼体外最小 抑菌浓度(MIC)的测定 ： 将1-乙基-4-羟基-2-氧-N -十三甲酰基-1， 2-二氢喹啉-3-甲 酰肼进行倍比梯度稀释 (100ug/ml， 75ug/ml， 50ug/ml， 37.5ug/ml， 25ug/ml， 18.25ug/ml， 12.5ug/ml， 6.25ug/ml， 3ug/ml， 1.5ug/ml， 0.75ug/ml)， 于按上述方法接种的结核杆菌的培 养管中添加各浓度梯度的化合物。接种完毕后， 置 37恒温孵箱内培养， 3 周观察结果。 0045 本发明中， 将能抑制培养基中细菌。
25、生长的最低浓度定为该化合物的最小抑菌浓度 (MIC)。 0046 本发明中， 体外抗菌活性所测定的菌株范围包括无毒株H37Ra， H37Rv以及10株临 床耐药分离菌株。 0047 所述的化合物的体外抑菌活性结果显示， 最小抑菌浓度的范围为 0.4-2ug/ml。 0048 实施例 3 ： 啮齿类鼠的急毒试验 0049 实验动物为昆明鼠种， 清洁级 ICR 小鼠， 雌雄各半， 体重为 18-22g。实验饲养环境 为温度为 252， 相对湿度为 30 -70， 在生物二级环境中实验。小鼠实验实验前一周 放置在此条件下以适应环境。 0050 急毒实验前， 小鼠禁食 16h， 小鼠采用单次灌胃给药，。
26、 每组 10 只小鼠， 雌雄各半， 给 药后继续禁食 2h， 整个实验过程中不禁水。通式 (I) 化合物的给药剂量为 (mg/kg) ： 3200， 4000， 5000， 6250， 7812， 给药后小鼠观察 7 天。给药 7 天后， 对所有小鼠进行解剖， 高于或等 于 5000mg/kg 剂量组的小鼠中， 部分小鼠脏器显示了一定的药物毒性， 低于这一剂量的小 鼠脏器没有明显的毒性反应。经分析， 通式 (I) 化合物灌胃的半数致死量 LD50在 5000mg/ kg 左右。 0051 上述实施例中， 所用的试验材料及其来源包括 ： 0052 H37Ra 菌株标准株为本实验室保存菌种， 所有有毒株和耐药菌株购自上海市肺科 医院检验科惠赠 ； 7H9干粉和7H10干粉购自DIFCO公司 ； 其他涉及的化学试剂均为分析纯， 并从化学试剂公司购得。 说 明 书 CN 102001996 B 7 。