技术领域
本发明涉及用于生产纤维素酶混合物的发酵方法。更具体地，本发明 涉及包括使用经遗传修饰之丝状真菌宿主来生产纤维素酶混合物的发酵 方法。
背景技术
植物细胞壁主要由大的生物聚合物纤维素、半纤维素、木质素和果胶 组成。纤维素和半纤维素是生产可发酵糖的重要的可再生和低成本碳源。 纤维素由通过β-1，4糖苷键以线性链相连的D-葡萄糖单元组成。半纤维素 主要由线性木聚糖主链组成，其包含通过β-1，4糖苷键相连的D-木糖单元 以及通过β-1，2或β-1，3糖苷键或酯键与木糖单元相连的多个侧链(如L- 阿拉伯糖、醋酸、阿魏酸等)。
子囊菌门(Ascomycota)的丝状真菌(包括多种青霉菌属 (Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、伞菌属(Agaricus)、脉孢 菌属(Neurospora)、腐质霉属(Humicola)、镰刀菌属(Fusarium)、毛 壳菌属(Chaetomium)、稻瘟菌(Magnaporthe)、曲霉菌属(Aspergillus) 和木霉属(Trichoderma)物种)在降解自然界中发现的丰度最高之聚合 物(纤维素和半纤维素)方面起关键作用。里氏木霉(Trichoderma reesei， 红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性型)是纤维素酶和半纤维素酶的 重要工业来源。术语“纤维素酶”广义上指催化那些连接纤维素聚合物中 各葡萄糖单元之β-1，4糖苷键水解的酶。催化机理涉及内切葡聚糖酶(E.C. 3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)和β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21) 的协同作用。术语“半纤维素酶”广义上指催化那些连接半纤维素聚合物 中各种木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和其它部分之糖苷键水解的酶。 半纤维素酶包括例如：内切-1，4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、β-甘露聚糖酶 (EC 3.2.1.28)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)、1，4-β-木糖苷酶(EC 3.2.1.27)和α-葡糖醛酸酶(EC 3.2.1.139)。
里氏木霉是工业上用于生产生物质降解酶(如纤维素酶和半纤维素 酶)的常用丝状真菌菌种。对里氏木霉菌株RutC30之分泌蛋白质组的分 析显示：当培养在添加了经预处理之玉米秸秆的培养基中时，存在31种 分泌型糖基水解酶(Nagendran等，2009)。对培养在啤酒花细胞壁上的 禾谷镰刀菌(F.graminearum)的研究发现：至少45％的分泌型蛋白质参 与植物细胞壁降解，分别有25、19和11种不同的蛋白质参与半纤维素、 果胶和纤维素的降解(Phalip等，2005)。
对里氏木霉基因组的测序及分析显示，存在10种编码纤维素酶的基 因以及16种编码半纤维素酶的基因(Martinez等，2008)。这些包括两 种纤维二糖水解酶、八种内切葡聚糖酶、四种木聚糖酶、两种α-L-阿拉 伯呋喃糖苷酶和一种β-甘露聚糖酶。里氏木霉还产生多种辅助酶(其协助 从纤维素和半纤维素产生单糖)，包括乙酰木聚糖酯酶、β-木糖苷酶和几 种β-葡糖苷酶(de Vries和Visser，2001；Aro等，2005，及其参考文献)。 然而，当与其它丝状真菌的基因组相比时，里氏木霉基因组中具有出奇少 的编码糖苷水解酶的基因(总共有200种)(Martinez等，2008)。例如， 米曲霉(Aspergillus oryzae)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、构巢曲霉 (Aspergillus nidulans)和禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)分别编 码285、263、247和243种糖基水解酶(Martinez等，2008)。
丝状真菌产生植物细胞壁降解酶(如纤维素酶、半纤维素酶、木质素 酶和果胶酶)主要是响应于可用碳源在转录水平被调控。葡萄糖通过转录 调控因子(如cre1)的作用抑制纤维素酶基因表达(Strauss等，1995)。 在葡萄糖受限的条件下，纤维素酶转录去阻遏，而转录的充分激活需要有 诱导纤维素酶之碳水化合物或诱导物(如纤维素或β-连接的二糖(如纤维 二糖、槐糖、龙胆二糖和乳糖))的存在(Ilmen等，1997)，而半纤维素 酶转录的激活取决于生长培养基中木聚糖或其衍生物(木糖、木二糖和阿 拉伯糖)的存在情况(Margolles-Clark等，1997)。
最初在黑曲霉(Aspergillus niger)中鉴定出的转录调节因子XlnR(木 聚糖酶调节因子)控制编码半纤维素酶和纤维素酶的约20～30种基因的 转录(Stricker等，2008，及其参考文献)。此外，木聚糖的胞外降解和 D-木糖的细胞内代谢通过XlnR对xyrA(其编码D-木糖还原酶)基因的 转录调控而偶联(Hasper等，2000)。里氏木霉和米曲霉中的直系同源转 录因子(分别为Xyr1(木聚糖酶调节因子1)和Ao XlnR)也是纤维素 酶和半纤维素酶基因表达的通用调节因子(Striker等，2006；Marui等， 2002)。对真菌中一些其它经鉴定的木聚糖酶表达调节因子的研究局限于 半纤维素酶基因的调控(Tamayo等，2008；Rao等，2002；Calero-Nieto 等，2007)。例如，已显示，在禾谷镰刀菌中缺失Xyr1的直系同源转录 因子不影响木聚糖酶和纤维素酶的基础表达水平，但抑制高的可诱导表达 (Brunner等，2007)。这一发现与木霉属和曲霉菌属的研究结果相矛盾， 在后一研究结果中将对应的调节因子敲除彻底阻断了纤维素酶和木聚糖 酶的表达。这些结果催生了用于产生同源和/或异源蛋白质的系统，在该 系统中利用受XlnR调节的启动子连同来自多个基因拷贝的过表达的木聚 糖酶调节因子XlnR(美国专利No.6,177,261B1，2001)。
木聚糖酶调节因子(例如来自木霉属的Xyr1和来自曲霉菌属的 XlnR)属于仅在真菌中发现的第三类双核锌簇蛋白家族，并在蛋白质N- 端部分拥有保守的氨基酸基序(CX2CX6CX5-12CX2CX6-8C)(MacPherson 等，2006)。这类转录因子很独特，其只包含与两个锌原子结合的一个锌 指。木聚糖酶调节因子结合靶基因启动子上的5′-GGC(T/A)3-3′响应元件， 并且可以作为单体、同二聚体或异二聚体与DNA相互作用(MacPherson 等，2006；Stricker等，2008)。一些研究显示，里氏木霉Xyr1对于所有 主要(半)纤维素酶基因的表达是必需的(Stricker等，2006)，并且它 结合木聚糖酶1、2和3基因的启动子(Rauscher等，2006；Stricker等， 2007；Furukawa等，2009)。然而，最近才在体外证明了里氏木霉Xyr1 与纤维素酶基因启动子的结合(Furukawa等，2009；Ling等，2009)。计 算机分析表明，在里氏木霉中，5′-GGC(T/A)3-3′基序作为单一位点广泛 分布在所有受Xyr1调节之基因的5′上游区域中(Furukawa等，2009)。 然而，对Xyr1结合选定基序的体外研究显示，只有其中部分基序可被该 转录因子识别(Furukawa等，2009)。
通过对黑曲霉XlnR进行失活突变和理性设计诱变分析鉴定出另一些 功能结构域(Hasper等，2004)。这些研究表明，第二个推测卷曲螺旋 (coiled-coil)结构域参与蛋白质的核定位。蛋白质结构预测表明，在黑 曲霉XlnR和里氏木霉Xyr1中，两个卷曲螺旋结构域处于相似的位置。 因此，里氏木霉Xyr1的第二个卷曲螺旋结构域有可能也负责其转运入核。 XlnR的C-端对其转录调控是必需的；缺失C-端的78个氨基酸导致XlnR 靶基因的表达增加(甚至是在葡萄糖阻遏的条件下)，这表明该区域抑制 了XlnR的转录激活(Hasper等，2004)。然而，该区域中的某些单氨基 酸突变(例如Tyr864Phe、Leu823Ser和Tyr864Asp)导致XlnR激活的 严重抑制(Hasper等，2004)。
虽然黑曲霉XlnR和里氏木霉Xyr1在结构和共有结合位点上具有相 似性，但是有证据表明，这两种因子通过不同的机制与启动子相互作用。 例如，已显示，黑曲霉XlnR作为单体(Hasper等，2004)、而里氏木霉 Xyr1作为同二聚体或与Ace2(已知的里氏木霉纤维素酶的表达正调控因 子)形成的异二聚体(Stricker等，2006，2008)与被调控基因启动子中 的反向重复序列结合。还推测，在里氏木霉中由Xyr1和Ace2进行的半 纤维素酶和纤维素酶基因表达的调控可涉及另一些调节蛋白的磷酸化和 招募(Stricker等，2008)。里氏木霉Xyr1还与Ace1(纤维素酶基因的 负调控因子)具有相互拮抗的关系，并可能通过这两种因子对纤维素酶启 动子中同一结合位点的竞争来实现(Stricker等，2006)。已从若干其它 真菌物种(例如构巢曲霉、埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)和粗 糙脉孢菌(Neurospora crassa))中分离出推测的Ace1编码基因(Aro等， 2005)。但是，它们与XlnR可能的相互作用以及它们是否参与水解酶编 码基因的转录激活尚不清楚(Stricker等，2006)。
在纤维素酶诱导条件下，里氏木霉产生低水平的木聚糖酶活性；但是， 利用木聚糖、木糖和阿拉伯糖培养的里氏木霉培养物得到的酶系统富含半 纤维素酶活性(相比于纤维素酶活性而言)(Mach和Zeilinger，2003； Margolles-Clark等，1997；Xiong等，2004)。当目标是产生具有高的木 聚糖降解活性(相比于纤维素酶活性而言)时，例如在动物饲料、纸浆和 造纸工业中，这可能是有益的。美国专利No.6,300,112和5,298,405公开 了使用纤维素酶缺失菌株作为生产用于动物饲料以及用于生物漂白中的 富含半纤维素酶的酶制剂的替代性方法，
有些情况下，期望使用碳水化合物来源(主要含有源自半纤维素的木 糖和另一些戊糖，例如通过化学处理木质纤维素生物质而产生的那些)从 真菌培养物得到具有高纤维素酶比活性的纤维素酶混合物。这些可包含 HDC或CIC。然而，这样的碳源导致酶组合物具有高的半纤维素酶活性 以及降低的纤维素酶比活性，因此，需要较大量的总蛋白质以获得有效的 纤维素水解。此外，半纤维素酶的产生和分泌使用了细胞能量途径和分泌 途径的资源，从而限制了宿主细胞表达和分泌纤维素酶的能力。
据报道，源自木聚糖的碳水化合物与纤维素酶诱导物(例如纤维二糖 或乳糖)的组合可导致由里氏木霉分泌的蛋白质混合物中存在不同比例的 纤维素酶和半纤维素酶(Zeilinger，S.等，1996)。此外，已发现，8(检查)～ 15％的诱导物浓度(需要确定)可提高利用半纤维素来源之碳水化合物 (hemicellulose derived carbohydrate，HDC)的蛋白质产生，其几乎可达 到当使用诱导纤维素酶之碳水化合物作为碳源时产生的水平(参见共同待 决的美国申请No.12/200492)。然而，由于产生碳水化合物的成本较高， 因此大规模地使用此类混合物会显著增加酶生产成本。此外，这样的酶混 合物中仍含有相当比例的半纤维素酶。因此，由于半纤维素酶含量高且需 要添加诱导纤维素酶之碳水化合物，所以目前利用诱导半纤维素酶之碳水 化合物生产纤维素酶成本很高。
因此，在本领域需要费用低廉的利用丝状真菌生产含有低水平半纤维 素酶活性的纤维素酶混合物的方法，其主要利用半纤维素来源之碳水化合 物(HDC)，而不含有诱导纤维素酶之碳水化合物(例如，纤维素)或β- 连接二糖(例如纤维二糖、槐糖、龙胆二糖和乳糖)或含有低水平的此类 碳水化合物。
发明内容
本发明涉及一种使用经遗传改造之丝状真菌生产具有高比例之纤维 素酶组分的纤维素酶混合物的发酵方法，所提供的碳源包含半纤维素来源 之碳水化合物(HDC)，而不含有或含有低水平的传统的诱导纤维素酶之 碳水化合物(cellulase inducing carbohydrate，CIC)。本文描述的方法和 遗传改造可用于开发产生高产量高品质纤维素酶的真菌菌株，其中纤维素 酶的表达不依赖于诱导纤维素酶之碳水化合物的存在情况。
遗传改造丝状真菌宿主使其过表达Xyr1转录因子或Xyr1等价转录 因子。当向所述丝状真菌宿主提供含有半纤维素来源之碳水化合物及低水 平的诱导纤维素酶之碳水化合物的碳源时，这种遗传改造产生富含纤维素 酶活性的纤维素酶混合物。
本发明提供了一种用于生产纤维素酶混合物的发酵方法，其包括：a) 提供经遗传改造过表达Xyr1转录因子或Xyr1等价转录因子的丝状真菌 宿主；以及b)在含有如下碳源的培养基中培养步骤a)所述的丝状真菌 宿主，所述碳源包含约60重量％至约100重量％的半纤维素来源之碳水 化合物和约0重量％至约3重量％的诱导纤维素酶之碳水化合物，或者所 述培养基包含含有约25重量％至约100重量％的半纤维素来源之糖醇、 约0重量％的诱导纤维素酶之碳水化合物以及约0重量％至约75重量％ 的葡萄糖、甘油或其组合的碳源，以产生纤维素酶混合物。由此产生的纤 维素酶混合物包含约40％至约100％的纤维素酶组分，并且与在同样培养 基中培养的不过表达Xyr1转录因子的亲本丝状真菌相比，其纤维素酶活 性提高到至少1.7倍。
本发明发酵方法中使用的丝状真菌宿主中过表达的Xyr1转录因子是 包含SEQ ID NO：27氨基酸序列的蛋白质、氨基酸序列与SEQ ID NO：27 氨基酸序列表现出约90％至约100％同一性的蛋白质。Xyr1等价转录因 子是氨基酸序列与SEQ ID NO：27氨基酸序列表观出约45％至约99％同 一性的蛋白质；氨基酸序列与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO： 33、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35氨基酸序列表现出约90％至约99 ％同一性的蛋白质，或者具有双核锌簇的蛋白质，其具有与含有SEQ ID NO：27氨基酸序列之蛋白质等价的特异性针对纤维素酶和/或半纤维素酶 启动子序列中GGC(T/A)3-样基序共有序列的DNA结合活性。
本发明发酵方法中使用的丝状真菌宿主可以是属于盘菌亚门 (Pezizomycotina)的纤维素分解真菌物种。例如，丝状真菌宿主可以是 木霉属、肉座菌属(Hypocrea)、曲霉菌属、镰刀菌属、青霉菌属或脉孢 菌属的物种。优选地，丝状真菌宿主是里氏木霉或红褐肉座菌。
在本发明发酵方法的第一个实施方案中，丝状真菌宿主包含Xyr1基 因构建物，其中编码Xyr1转录因子或Xyr1等价转录因子的核酸序列与 启动子核酸序列有效连接。丝状真菌宿主可通过用Xyr1基因构建物转化 并筛选含有该基因构建物的转化子来获得。
对于编码Xyr1转录因子的核酸序列来说，启动子核酸序列可以是本 源的(native)或异源的。所述启动子核酸序列可以源自这样的基因，即 在含有半纤维素来源之碳水化合物的碳源条件下，该基因在丝状真菌宿主 生长过程中被诱导表达。例如，如果丝状真菌宿主是里氏木霉，则启动子 核酸序列可以来自编码β-木糖苷酶1、β-木糖苷酶2、木聚糖酶1、木聚 糖酶2、木聚糖酶3的里氏木霉基因的一个或多个或者其任意组合。启动 子核酸序列还可以是来自两种或更多种启动子的核酸序列组合。或者，启 动子核酸序列可以源自这样的基因，所述基因在丝状真菌宿主生长过程中 组成型表达，并且其表达水平不依赖于发酵方法所用的碳源。
在本发明发酵方法的第二个实施方案中，对所述经改造丝状真菌宿主 进行进一步改造以使其在一种或多种半纤维素酶表达方面具有部分或完 全地缺陷，所述半纤维素酶包括但不限于：木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-阿 拉伯呋喃糖苷酶、β-甘露聚糖酶、α-葡糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶及其任 意组合。例如，经改造丝状真菌宿主可以在一种或多种木聚糖酶、一种或 多种β-木糖苷酶、一种或多种α-阿拉伯呋喃糖苷酶或其任意组合的表达 方面具有缺陷。如果经改造丝状真菌宿主是里氏木霉或红褐肉座菌的菌 株，则该宿主可以被改造以使木聚糖酶1、木聚糖酶2、β-木糖苷酶1、β- 木糖苷酶2、α-阿拉伯呋喃糖苷酶1、α-阿拉伯呋喃糖苷酶2或其任意组 合具有部分或完全地缺陷。
在本发明发酵方法中提供给丝状真菌宿主的碳源可在半纤维素来源 之碳水化合物的基础上包含其它碳源。例如，所述碳源可包括甘油或其它 糖醇(例如木糖醇或阿拉伯糖醇)或有机酸(例如醋酸或葡萄糖醛酸)。
与不过表达Xyr1的丝状真菌宿主的发酵方法的单位生产率(specific productivity，qp)相比，本发明发酵方法的qp可以提高到至少约两倍。
本发明的发酵方法可以在约20℃至约35℃温度下以及pH值约3.0 至约6.5的条件下实施，并且该方法可以分批、分批补料或连续方法来进 行。任何这些模式均可以在有氧(存在氧气)或无氧(不存在氧气)的条 件下操作。
本发明部分地基于这样的发现，即在碳源包含半纤维素来源之碳水化 合物(HDC)或半纤维素来源之糖醇(HDSA)且不含有或含有低水平的 诱导纤维素酶之碳水化合物的发酵方法中，过表达Xyr1转录因子的丝状 真菌宿主可以产生纤维素酶组分比例高的纤维素酶混合物。本发酵方法的 生产率明显高于使用不过表达Xyr1转录因子和/或具有半纤维素酶野生 型产生水平的丝状真菌宿主时的同样方法。
与不过表达Xyr1的亲本丝状真菌产生的纤维素酶混合物的纤维素酶 活性相比，本发明的发酵方法所产生的纤维素酶混合物的纤维素酶活性提 高到至少约1.7倍。本发明发酵方法生产的纤维素酶混合物包含占总蛋白 质约40重量％至约100重量％的纤维素酶组分。如此生产的纤维素酶混 合物可用于将纤维素底物水解以生产葡萄糖。例如，所述纤维素酶混合物 可用于水解包含在预处理的木质纤维原料中的纤维素。
附图说明
图1.A-用于内切葡聚糖酶2(cel5a)缺失和制备P285-6菌株的里 氏木霉转化载体。B-使用cel5a编码序列作为探针证实cel5a在P285-6 和P285-4转化子中成功缺失的Southern杂交。上图显示了本源cel5a基 因座和转化载体靶向整合后被破坏的cel5a基因的示意图。用于消化基因 组DNA的限制性位点标示于底部。用于Southern杂交的探针的位置标示 于顶部。下图显示Southern杂交，菌株名称或质粒名称标示于顶部，片 段大小标示于左侧。
图2.A-用于木聚糖酶2缺失和制备P491P菌株的里氏木霉转化载 体。B-在木糖作为碳源的微培养中生长的亲本和转化菌株中木聚糖酶2 的产生。由亲本菌株(M2C38和M2C38aux5)和转化子(P43W、P491N、 P491P、P509A-G)产生的总分泌蛋白等分样品(10μg)利用SDS-PAGE 进行分离，转移至PVDF膜并使用针对里氏木霉木聚糖酶2得到的抗体 进行免疫印迹。纯化的Xyn2(泳道1)用作对照。箭头指示了对应于Xyn2 的蛋白条带。以kD为单位的蛋白质分子量标记标示于左侧。
图3.基因cel7a(条纹柱)、xyr1(黑柱)和ace1(灰柱)的相对转 录物水平。用于分离总RNA的生物质样品采集自里氏木霉P59G菌株发 酵42小时时，其利用100％阿拉伯糖、98％木糖+2％纤维二糖或65％葡 萄糖+35％诱导纤维素酶之混合物(cellulase-inducing cocktail，CIC)作为 培养用碳源。通过实时qRT-PCR对相对转录物水平进行评估，并使用 Ntf2基因的转录水平归一化。
图4.A-用于制备过表达xyr1之里氏木霉转化子的转化载体。B-从 含有Pbxl:xyr1表达盒的经改造丝状真菌宿主及其亲本丝状真菌菌株分离 的基因组DNA中PCR扩增嵌合的xyr1基因片段。Xyr1表达盒的图示显 示于每幅图的底部。PCR扩增所用引物用箭头标示。泳道1加载了DNA 分子量标记(DNA ladder)，且每个标记的大小显示于左侧。PCR产物从 以下模板扩增：从亲本P285-6aux(泳道2)和经改造丝状真菌宿主菌株 P692A(泳道3)、P692B(泳道4)、693A(泳道5)、693B(泳道6)分 离的基因组DNA，作为阴性对照的水(泳道7)和作为阳性对照的 pPbxl:xyr1-pyr4载体(泳道8)。
图5.A-亲本丝状真菌(里氏木霉P285-6)以及过表达xyr1之经改 造丝状真菌宿主(里氏木霉P692菌株)中基因xyr1、cel7a、cel7b、xyn1、 xyn2和bxl1的相对表达水平。B-在诱导纤维素酶表达48和72小时后， 亲本丝状真菌(里氏木霉RutC30菌株)以及过表达xyr1之经改造丝状 真菌宿主(里氏木霉RutC30-R3菌株)中基因xyr1和cel7a的相对表达 水平。用于总RNA提取的生物质样品按实施例4.2所述制备。通过实时 qRT-PCR对相对转录水平进行评估，并使用Ntf2基因对转录水平进行归 一化。发酵运行编号标示于柱的顶部。
图6.过表达Xyr1的经改造丝状真菌宿主(里氏木霉P692B)(A) 和亲本丝状真菌(里氏木霉P285-6菌株)(B)在pH 3.5、以100％木糖 作为碳源培养的发酵中蛋白质(实线)和生物质(虚线)的积累(表示为 g/L)。
图7.过表达Xyr1的经改造丝状真菌宿主(里氏木霉RutC30-R3)(A) 和亲本丝状真菌(里氏木霉RutC30菌株)(B)在pH 3.5、以100％木糖 作为碳源培养的发酵中蛋白质(实线)和生物质(虚线)的积累(表示为 g/L)。
图8.里氏木霉菌株P1194E(A)、P1197B(B)、P491P(C)和M2C38 (D)在pH 3.5、以100％木糖作为碳源培养的发酵中蛋白质(实线)和 生物质(虚线)的积累(表示为g/L)。
图9.(A)显示了由亲本丝状真菌P285-6菌株和经改造丝状真菌宿 主菌株P692B(xyr1+)和P692A(xyr1+)分泌的纤维素酶混合物的相对 纤维素水解活性。根据用于这些菌株中每一种发酵的碳源将纤维素酶混合 物分组。发酵参考编号示于柱的顶部。(B)显示了利用100％木糖、100 ％阿拉伯糖、25％木糖/50％葡萄糖/25％甘油或25％木糖醇/50％葡萄糖 /25％甘油培养的亲本丝状真菌宿主(P285-6菌株)和经改造丝状真菌宿 主(P692B和P692A菌株)产生的纤维素酶混合物中各纤维素酶和木聚 糖酶组分Cel7A、Cel6A、Cel7B、Xyn1和Xyn2的相对丰度(以总分泌 蛋白的重量百分比表示)。
图10.(A)显示了由亲本丝状真菌RutC30菌株和经改造丝状真菌宿 主RutC30-R3菌株(xyr1+)分泌的纤维素酶混合物的相对纤维素水解活 性。根据用于这些菌株中每一种发酵的碳源将纤维素酶混合物分组。发酵 参考编号示于柱的顶部。(B)显示了利用100％木糖或25％木糖醇/50％ 葡萄糖/25％甘油培养的亲本丝状真菌宿主(RutC30)和经改造丝状真菌 宿主(RutC30-R3)产生的纤维素酶混合物中各纤维素酶和木聚糖酶组分 Cel7A、Cel6A、Cel7B、Cel5A、Xyn1和Xyn2的相对丰度(以总分泌蛋 白的重量百分比表示)。
图11.显示了由利用含有100％木糖或35％CIC+65％葡萄糖的碳源 培养的亲本丝状真菌菌株RutC30、M2C38和P491P以及经改造丝状真 菌宿主菌株RutC30-R3、P1194E、P1194F和P1197B(xyr1)分泌的纤 维素酶混合物的相对纤维素水解活性。发酵参考编号示于柱的顶部。
图12.(A)显示了相对纤维素水解活性与纤维素酶混合物中纤维素 酶组分(Cel7A+Cel6A+Cel7B)之相对比例之间的关系，该纤维素酶混合 物由利用100％木糖、100％阿拉伯糖、25％重量木糖/50％重量葡萄糖/25 ％甘油或25％木糖醇/50％葡萄糖/25％甘油作为碳源发酵的菌株P285-6、 P692B(xyr1+)和P692A(xyr1+)产生。虚线表示P285-6、P692B和 P692A纤维素酶混合物的所有相对活性与纤维素酶组分百分比的线性回 归分析。线性回归的r-平方值为0.75。(B)显示了相对纤维素水解活性 与纤维素酶混合物中纤维素酶组分(Cel7A+Cel6A+Cel7B+Cel5A)之相 对比例之间的关系，该纤维素酶混合物由菌株RutC30和RutC30-R3 (xyr1+)产生。虚线表示RutC30和RutC30-R3纤维素酶混合物的所有 相对活性与纤维素酶组分百分比的线性回归分析。
图13.里氏木霉Xyr1(SEQ ID NO：27)与Xyr1等价转录因子之氨 基酸序列的比对，所述等价转录因子来自黑曲霉(同一性为46.65％，SEQ ID 25)、构巢曲霉(同一性为46.24％，SEQ ID 28)、白曲霉(Aspergillus kawachii)(同一性为47.06％，SEQ ID 29)、米曲霉(同一性为46.55％， SEQ ID 30)、土曲霉(Aspergillus terreus)(同一性为42.83％，SEQ ID 31)、 尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)(同一性为59.30％，SEQ ID 32)、粗 糙脉孢菌(同一性为58.65％，SEQ ID 33)、变灰青霉(Penicillum canescens)(同一性为50.91％，SEQ ID 34)和小麦德氏霉有性型 (Pyrenophora tritici-repentis)(同一性为42.11％，SEQ ID 35)。两个序 列之间一致的氨基酸用黑色阴影的白色字体表示；两个序列之间相似的氨 基酸用灰色阴影的黑色字体表示。SEQ ID NO各序列与里氏木霉Xyr1 的同一性百分比在括号中列示。使用DNAman程序(其中空位罚分为3 且K-tuple为2)计算同一性。
图14.显示了里氏木霉Xyr1的343-940位氨基酸对应的区域与来自 黑曲霉、米曲霉、构巢曲霉、土曲霉、白曲霉、粗糙脉孢菌、变灰青霉、 尖孢镰刀菌、小麦德氏霉有性型的Xyr1等价转录因子和里氏木霉Xyr1 343-940氨基酸相应区域两两之间的氨基酸序列同一性百分比。使用 DNAman程序(其中空位罚分为3且K-tuple为2)计算同一性。
发明详述
本发明涉及用于从经改造丝状真菌宿主生产纤维素酶的发酵方法。
如下仅以举例的方式描述优选的实施方案，而对为实施本发明必需的 特征组合无限制。
经改造丝状真菌宿主
增加一两句有关结构域构成以及各结构域在何处起始和终止的描述。
对本发明发酵方法中使用的丝状真菌宿主进行改造以提高Xyr1转录 因子或Xyr1等价转录因子的表达。本文使用的“Xyr1转录因子”是一种属 于真菌双核锌簇转录因子家族的蛋白质，其氨基酸序列与SEQ ID NO：27 具有约90％至约100％的同一性或显示与里氏木霉Xyr1等价的DNA结 合活性。例如，该蛋白可与SEQ ID NO：27具有90％、92％、94％、95 ％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何数值)的序列同一性。
本文使用的Xyr1等价转录因子是一种属于真菌双核锌簇转录因子家 族、其氨基酸序列与SEQ ID NO：27氨基酸序列具有约45％至约99％同 一性的蛋白质；其氨基酸序列与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO： 33、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35中任一个表现出约90％至约99％ 同一性的蛋白质；或者具有双核锌簇的蛋白质，其具有与含有SEQ ID NO： 27氨基酸序列之蛋白质等价的特异性针对纤维素酶和/或半纤维素酶启动 子序列中GGC(T/A)3-样基序共有序列的DNA结合活性。
图13显示了的里氏木霉Xyr1转录因子(SEQ ID NO：27)与来自其 它真菌物种的Xyr1等价转录因子的比对。所有这些酶均与SEQ ID NO： 27表现出约42％至约59％的氨基酸序列同一性(表1)。此外，如图14 所示，在来自盘菌亚门的其它纤维素水解丝状真菌的Xyr1等价转录因子 与里氏木霉Xyr1的343-940位氨基酸相对应的氨基酸与里氏木霉Xyr1 (SEQ ID NO：27)的343-940位氨基酸表现出约48％至约66％的同一性。
表1：Xyr1等价转录因子
比对氨基酸序列以及确定氨基酸序列之间序列同一性的方法是众所 周知的并且是那些本领域技术人员可获得的，包括可用于比对两个序列的 BLAST(基本局部比对检索工具(Basic Local Alignment Search Tool)， 参见URL：blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi；Altschul等，J.Mol.Biol. 215：403-410，1990)和用于比对两个或更多个序列的CLUSTALW(见 URL：ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)。序列同一性也可通过手动比 对和肉眼检查来确定。
“等价的DNA结合活性”是指由Zn2Cys6双核锌簇或锌指结构域介导 的Xyr1或Xyr1等价转录因子与GGC(T/A)3样共有基序的DNA结合。 该簇在所有真菌双核锌簇蛋白家族成员中非常保守，并由Cys Xaa(2)Cys Xaa(6)Cys Xaa(5-12)Cys Xaa(2)、Cys Xaa(6-8)、Cys氨基酸基序组成。 此外，被Xyr1或Xyr1等价转录因子中双核锌簇识别的DNA共有序列可 以单次、两次或三次重复的形式存在于受控基因启动子中。Xyr1或Xyr1 等价转录因子可以单体或者以同二聚体或异二聚体形式之蛋白质复合物 与所述基因启动子结合，不希望受到理论的约束，Xyr1或Xyr1等价转录 因子在DNA结合过程中可与其它基因特异性的和/或通用的转录因子(例 如Ace1和Ace2蛋白)相互作用。Xyr1或Xyr1等价转录因子对GGC(T/A)3样共有基序的DNA结合活性可通过使用本领域技术人员已知的一种或多 种方法进行测量，包括电泳迁移实验(electrophoretic mobility-shift assay， EMSA)或DNA足迹法(DNA footprinting)。Furukawa等(2009)描 述了这些方法。
为本文所述目的，“表达增加”或“过表达”是指与在同样的培养基组 成、温度、pH、细胞密度和培养物生长时期条件下培养的亲本丝状真菌 中同一基因的转录物水平相比，在经改造丝状真菌宿主中对于给定基因的 转录物水平至少提高约50％。
为本文所述的目的，当涉及测定Xyr1基因表达水平时，术语“亲本 丝状真菌”是指没有为增加Xyr1或Xyr1等价转录因子的表达而进行遗传 改造的丝状真菌，其在其它方面与经改造丝状真菌宿主相同。
Xyr1或Xyr1等价转录因子表达增加或过表达可通过本领域技术人 员已知的方法来实现，包括经典的突变及筛选方法或基因工程技术。例如， 可通过用Xyr1基因构建物转化宿主细胞的方法以增加Xyr1或Xyr1等价 转录因子的表达来遗传改造宿主细胞。
本文所用的“基因构建物”是指包含蛋白质表达和筛选含有该基因构 建物之宿主细胞必需的核酸元件的分离的核酸序列。这些元件包括但不限 于：包含编码蛋白质产物之核酸序列的编码区域以及包含指导编码区转录 之核酸序列的启动子。如本领域普通技术人员理解地，这些核酸元件可源 自宿主细胞或不同的生物，和/或在体外合成。这些核酸序列元件也可通 过对一个或多个核酸进行取代、替换、添加或去除来改变或改造。本发明 的实践不受制于基因构建物所包含核酸元件的所述来源或对其进行的上 述改变。
“Xyr1基因构建物”是指包含与启动子有效连接之Xyr1或Xyr1等价 转录因子的编码区的分离的核酸序列。例如，所述启动子可源于当宿主细 胞与含有HDC的碳源一起培养时高表达的基因。例如，如果丝状真菌宿 主是里氏木霉，则启动子核酸序列可来自编码β-木糖苷酶(JGI Protein ID 3264)、β-木糖苷酶2(JGI Protein ID 105276)、木聚糖酶1(JGI Protein ID 74223)、木聚糖酶2(JGI Protein ID 23246)或木聚糖酶3(JGI Protein ID 2034)(所有这些可在如下网址获得： genome.jgi-psf.org/cgi-bin/browserLoad？db-Trire2)或者其任意组合一种 或多种里氏木霉基因。或者，启动子可源于组成型表达基因。里氏木霉组 成型启动子的一个实例是来自磷酸甘油激酶(phosphoglycerate kinase， pgk)基因的启动子。但是，应当理解，本发明的实践不受Xyr1基因构 建物中启动子之选择的限制。
本文涉及核酸序列时使用的“分离的”是指通过从部分或全部天然核 酸序列分离核酸序列而改变后者的自然状态，所述部分或全部天然核酸与 所分离核酸在自然条件下是相关联的。
本文在涉及核酸序列元件时所使用的“源自”是指使用一种或多种本 领域技术人员已知的分子生物学技术对靶标核酸序列元件进行分离，所述 技术包括但不限于：克隆、亚克隆、PCR扩增、体外合成等。术语“源自” 同时适用于经改造的和本源的(或野生型)核酸序列元件。在本源核酸序 列元件的情况下，“源自”是指未向靶标核酸序列元件引入一个或多个插 入、缺失或替换(如同其自然存在形式一样，除了可在分离元件的5′和 3′端加入必要的核酸以方便克隆以外)而对靶标核酸序列元件进行分离。 在经改造的核酸序列元件的情况下，“源自”还包括向野生型或本源序列引 入一个或多个插入、缺失或替换。
基因构建物可包含用于确定宿主细胞转化的选择标记。选择标记可存 在于Xyr1或其它基因构建物上，或者选择标记可以是与所述基因构建物 共转化的单独的分离核酸。对选择标记的选择是本领域技术人员熟知的， 包括赋予转化细胞以利用代谢物(其通常不被该微生物所代谢)的能力的 基因(合成的或天然的)(例如，构巢曲霉amdS基因编码乙酰胺酶，其 赋予在乙酰胺作为唯一氮源的条件下生长的能力)或抗生素耐药性(例如 大肠杆菌hph基因编码潮霉素-β-磷酸转移酶，其赋予潮霉素抗性)。如果 宿主菌株缺乏针对所选标记的功能基因，那么该基因可用作标记。这些标 记的实例包括trp、pyr4、pyrG、argB、leu等等。因此，相应的宿主菌株 须缺乏对应于所选标记的功能基因，即，缺乏trp、pyr、arg、leu等的表 达。
基因构建物可以包含在宿主细胞中有功能的转录终止子，如本领域技 术人员已知地。转录终止子可位于紧邻编码区的下游。本发明的实践不受 制于转录终止子的选择，所述转录终止子需足以在宿主细胞中指导RNA 聚合酶转录终止。
可以使用额外的基因构建物改造真菌细胞，以提高或降低一种或多种 同源或异源蛋白质的表达和分泌。例如，根据美国专利No.6,015,703，可 以改造真菌细胞以过表达β-葡萄糖苷酶。根据共同待决的美国专利公开 No.US 2008/0057541A1和美国专利申请No.60/969046，也可改造宿主 细胞以产生优化的纤维素酶组分和辅助组分混合。例如，可以用一种或多 种基因构建物改造真菌细胞，所述基因构建物含有与受Xyr1转录因子调 控之启动子(如来自纤维素酶或木聚糖酶基因的启动子)有效连接的纤维 素酶编码基因。本发明的实践不受制于是否有额外的指导一种或多种同源 或异源蛋白质表达的基因构建物被先于、同时或在改造之后引入，从而导 致宿主过表达Xyr1或Xyr1等价转录因子。
编码用于表达和分泌除Xyr1或Xyr1等价转录因子以外的蛋白质的 基因构建物还包含分泌信号序列。本文使用的“分泌信号序列”是编码存在 于分泌型蛋白氨基末端之肽序列的核酸序列，其指导蛋白质进入内质网 (ER)，然后，分泌信号可被信号肽酶从成熟的分泌蛋白上切除。
本发明发酵方法中使用的经改造丝状真菌宿主中的一种或多种半纤 维素酶(例如，木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、甘露聚糖酶、 α-葡糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶或其组合)的产生可部分或完全地缺陷。 另外，经改造丝状真菌宿主过表达Xyr1或Xyr1等价转录因子。然而， 应当理解，经改造的丝状真菌宿主可先于、同时或在改造后引入一种或多 种半纤维素酶表达的部分或完全缺陷，从而导致Xyr1或Xyr1等价转录 因子的过表达。
“一种或多种半纤维素酶表达的部分或完全地缺陷”是指与在相同培 养基组成、温度、pH、细胞密度和培养物生长时期等条件下培养的相应 半纤维素酶缺陷亲本丝状真菌产生的纤维素酶混合物中同一半纤维素酶 组分相比，由经改造丝状真菌宿主分泌的纤维素酶混合物中至少一种半纤 维素酶组分的相对比例表现出约50％至约100％的下降。例如，与在相同 培养基组成、温度、pH、细胞密度和培养物生长时期等条件下培养的相 应半纤维素酶缺陷亲本丝状真菌产生的纤维素酶混合物中同一纤维素酶 组分的相对比例相比，由经改造丝状真菌宿主分泌的一种或多种半纤维素 酶的相对比例可表现出50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、 85％、90％、95％或100％的下降。
在用于确定纤维素酶混合物中半纤维素酶比例的情况下，“半纤维素 酶缺陷的亲本丝状真菌”是尚未实施使其一种或多种半纤维素酶的表达产 生部分或完全缺陷而进行的遗传改造的丝状真菌，而在经改造丝状真菌宿 主中这些半纤维素酶的表达发生了部分或完全的缺陷。
可通过本领域普通技术人员已知的多种不同手段实现一种或多种半 纤维素酶表达的部分或完全缺陷。例如，可以在所改造丝状真菌宿主的一 个或多个半纤维素酶基因中引入突变(插入、缺失或二者皆有)。在一个 非限制性实例中，经改造丝状真菌宿主含有编码木聚糖酶2或β-木糖苷酶 1之基因的缺失或两者皆缺失。
还可以通过修饰功能性半纤维素酶特异性转录调控因子的表达或功 能来实现一种或多种半纤维素酶表达的部分或完全缺陷。对于正调控因子 或活化剂来说，可将其编码基因序列缺失或改变以产生活性减弱的调节因 子。对于负调控因子或抑制剂来说，可将其编码基因过表达或改变以产生 活性增强的调节因子。例如，可通过插入、缺失或两者联用来改造半纤维 素酶特异性转录调控因子基因的编码序列，和/或编码半纤维素酶特异性 转录调控因子的基因还可包含氨基酸替换，这些氨基酸替换改变了蛋白质 功能从而降低或增强其DNA结合活性、其与另一些转录因子的相互作用、 其核定位等。
缺失核酸序列可通过将包含来自靶标核酸序列自身的序列(具有改变 的形式)引入构建物来实现。将所述构建物转化进表达宿主之后，所述改 变的靶标核酸序列将发生重组，从而引起经改变序列的插入并导致本源核 酸序列的破坏。由于其序列被间插，在大多数情况下经改变基因将被翻译 成无功能的蛋白质，或根本无法被翻译。可用于从宿主细胞缺失靶标核酸 序列的方法的实例包括但不限于美国专利No.5,298,405描述的方法，其 通过参考并入本文。
半纤维素酶缺陷也可通过化学或物理(例如紫外线)诱变以及筛选不 产生半纤维素酶之细胞来实现。此外，利用天然自发突变或可遗传的半纤 维素酶基因沉默也可分离出半纤维素酶缺陷细胞。
基因构建物可在本文所述的各核酸元件之间包含额外的序列。这些序 列(可以是天然的或合成的)可向构建物编码的蛋白质添加一个或多个氨 基酸。本发明的实践不受制于宿主细胞中存在的基因构建物各核酸元件之 间的额外DNA序列。
本发明的实践是不受制于向宿主细胞引入基因构建物的方法。向宿主 细胞引入DNA构建物的方法是本领域技术人员所熟悉的，其包括但不限 于：氯化钙处理细菌细胞或真菌原生质体以削弱细胞膜、添加聚乙二醇以 允许融合细胞膜、利用电穿孔使细胞膜去极化或使用粒子枪通过微粒轰击 使DNA穿透细胞壁和细胞膜。
培养基
在本发明的发酵方法中，培养基包含碳源、氮源(自然存在的有机和 /或无机氮源)以及本领域技术人员已知的其它必需矿物质和营养物。有 机氮源(例如氨基酸和肽)还可作为碳源。但是，在发酵方法中，这些有 机氮源并未计入到提供给宿主细胞的碳源当中。
在第一个实施方案中，在本发明发酵方法中提供给真菌细胞的碳源包 含半纤维素来源之碳水化合物(HDC)。本文使用的术语“半纤维素来源 之碳水化合物”或“HDC”是指由半纤维素经化学或酶促解聚产生的一种 或多种寡糖、二糖或单糖，其可被宿主微生物用于生长、酶生成或二者皆 有。HDC的非限制性实例包括低聚木糖(xylo-oligosaccharide)、低聚阿 拉伯糖基木糖(arabinoxylo-oligosaccharide)、D-木糖、木二糖、L-阿拉 伯糖、D-甘露糖、D-半乳糖及其组合。例如，HDC包含D-木糖和/或L- 阿拉伯糖。在发酵过程中，HDC占向真菌细胞补充之碳源的约60重量％ 至约100重量％。例如，在发酵过程中，HDC可占向真菌细胞补充之碳 源的60、65、70、75、80、85、90、95、97、98、99或100重量％(或 其间任意值)。例如，在发酵过程中，HDC可占向真菌细胞补充之碳源的 约80重量％至约100重量％。
在第二个实施方案中，在本发明发酵方法中向真菌细胞提供的碳源包 含半纤维素来源之糖醇(hemicellulose-derived sugar alcohol，HDSA)、甘 油和/或葡萄糖。本文使用的术语“半纤维素来源之糖醇”或“HDSA”是指 可来源于半纤维素经化学或酶促解聚产生之寡糖、二糖或单糖的一种或多 种糖醇，其可被宿主微生物用于生长、酶生成或二者皆有。HDSA的非限 制性实例包括木糖醇、甘露醇、阿拉伯糖醇、半乳糖醇及其组合。优选地， HDSA是木糖醇或阿拉伯糖醇。在发酵过程中，HDSA占向真菌细胞补充 之碳源的约25重量％至约100重量％。例如，在发酵过程中，HDSA可 占向真菌细胞补充之碳源的25、30、40、50、55、60、65、70、75、80、 85、90、95、97、98、99或100重量％(或其间任意值)。例如，在发酵 过程中，HDC可占向真菌细胞补充之碳源的约80％至约100％。除了 HDSA以外，所述碳源还包含约0重量％的诱导纤维素酶之碳水化合物以 及约0重量％至约75重量％的葡萄糖、甘油或其组合。
除了HDC或HDSA，向本发明发酵方法提供的碳源还包含约0重量 ％至约3重量％(或其间任意值)的诱导纤维素酶之碳水化合物 (cellulose-inducing carbohydrate，CIC)。本文使用的术语“诱导纤维素酶 之碳水化合物”或“CIC”是指诱导宿主细胞产生纤维素酶的一种或多种 寡糖或二糖。“诱导”是指响应于CIC而开启一种或多种纤维素酶基因的 表达。诱导纤维素酶之碳水化合物的非限制性实例包括纤维素、乳糖、纤 维二糖、槐糖、龙胆二糖及其组合。诱导纤维素酶之碳水化合物(CIC) 可通过用一种或多种纤维素酶将纤维素酶促转化成β键连接的葡萄糖二 聚体来产生。或者，可通过化学方法或酶促方法使高浓度葡萄糖浆缩合以 形成葡萄糖二聚体混合物。例如，将葡萄糖转换成CIC的缩合反应可通 过稀酸催化并在120～150℃以上的温度下进行，或者通过β-葡萄糖苷酶 或纤维素酶在约40～70℃的较温合的温度下进行(美国专利公开No. US2004/0121446A1)。
除了HDC和CIC以外，在发酵过程中向宿主细胞提供的约0.1重量 ％至约40重量％(或其间任意值)的碳源可包含葡萄糖、甘油、糖醇(例 如木糖醇或阿拉伯糖醇)、有机酸(例如醋酸或葡萄糖醛酸)或其它可被 宿主细胞利用的碳源中的一种或多种。例如，在发酵过程中向宿主细胞提 供的总碳源的约0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、 4.5、5.0、7.0、8.0、10.0、15、20、25、30、35、40％(或其间任意值) 可包含葡萄糖、甘油、糖醇(例如木糖醇或阿拉伯糖醇)、有机酸(例如 醋酸或葡萄糖醛酸)或其它可被宿主细胞利用的碳源中的一种或多种。
本领域技术人员应理解，可以向发酵培养基中添加另外的营养物、维 生素和矿物质以提高宿主细胞的生长和酶生成。这些另外的培养基组分可 以在宿主细胞接种之前、同时或之后被加入。
产生纤维素酶混合物
纤维素酶混合物通常通过在适于宿主细胞的温度和pH下将生长活跃 的真菌培养物接种至培养基(固体或液体)而产生，所述培养基几乎不含 或根本不含葡萄糖和诱导纤维素酶之碳水化合物以及细胞生长所需的其 它营养物。在本发明的发酵方法中，纤维素酶混合物通过将生长活跃的、 过表达Xyr1的经改造丝状真菌宿主接种至培养基(固体或液体)而产生， 其中碳源包含约60重量％至约100重量％的半纤维素来源之碳水化合物 和约0重量％至约3重量％的诱导纤维素酶之碳水化合物，或者所述培养 基包含含有约25重量％至约100重量％的半纤维素来源之糖醇、约0％ 诱导纤维素酶之碳水化合物和约0重量％至约75重量％的葡萄糖、甘油 或其组合。
可通过本领域普通技术人员已知的技术在转录水平上检测纤维素酶 的表达，这些技术包括但不限于：Northern印迹杂交或实时定量PCR (qRT-PCR；见实施例1.3)。可通过本领域技术人员已知的几种方法检 测纤维素酶蛋白的表达，这些技术包括酶活性测定或蛋白质免疫检测。实 施例7中提供了针对纤维素酶混合物的活性和免疫检测方法的非限制性 实例。
木霉和相关丝状真菌的液体深层发酵一般可通过分批、分批补料或连 续方法来进行。在分批方法中，除了需氧方法中的氧气以外，所有必需的 材料在操作开始时被置于反应器中，发酵一直进行至结束，并于此时收获 产物。在分批发酵方法中，碳源可以在接种之前或接种同时被加至发酵培 养基中。
在分批补料方法中，用一种或多种培养基组分连续或顺序地向培养物 补料，伴随着去除培养液。在连续方法中，新鲜培养基的供给和培养液的 去除保持同样的体积速率，从而维持培养物稳定的生长速率。在分批补料 或连续操作的情形中，还可以在发酵过程中连续地或间歇地提供碳源。优 选地，补料速率为0.2～2.5g(碳)/L(培养物)/小时(或其间任意值)。 更优选地，补料速率为0.4～1.6g(碳)/L(培养物)/小时(或其间任意 值)。
本发明的发酵方法可在约20℃至约35℃(或其间任何温度)下进行， 例如约25℃至约30℃(或其间任何温度)或者20℃、22℃、25℃、26℃、 27℃、28℃、29℃、30℃、32℃、35℃(或其间任何温度)。
本发明的发酵方法可在pH值约3.0～6.5(或其间任何pH值)下进 行，例如约pH 3.5～pH 5.5或其间任何pH值，例如约pH 3.0、pH 3.2、 pH 3.4、pH 3.5、pH 3.7、pH 3.8、pH 4.0、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4、pH 4.5、pH 4.6、pH 4.7、pH 4.8、pH 4.9、pH 5.0、pH 5.2、pH 5.4、 pH 5.5、pH 5.7、pH 5.8、pH 6.0、pH 6.2、6.5或其间任何pH值。
本发明的发酵方法可在3～30天(或其间任何天数)内进行，例如3～ 10天(或其间任何天数)、4～8天(或其间任何天数)或者3、4、5、6、 7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30天(或其间任 何天数)。
本发明的发酵方法可在至少1升培养体系中进行，例如约1至约 400000升或其间任意值，例如10至约400000升(或其间任意值)、1000 至约200000升(或其间任意值)或10000至约200000升(或其间任意值)， 或者约1、10、50、100、200、400、600、800、1000、2000、4000、6000、 8000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、 55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、 100000、150000、200000、300000、400000升的体积(或其间任意值)。
本发明的发酵方法可在存在氧气的有氧条件下或在不存在氧气的无 氧条件下进行。优选地，该方法在有氧条件下进行。
经过发酵，由此产生的纤维素酶混合物可直接使用，或者可将纤维素 酶混合物与真菌细胞分离(例如通过过滤或离心来实现)。发酵培养基中 的低分子量溶质(例如未消耗的组分)可通过超滤去除。可将纤维素酶混 合物浓缩，例如通过蒸发、沉淀、沉降或过滤来实现。可加入诸如甘油、 蔗糖、山梨醇等化学物质来稳定纤维素酶。可向纤维素酶混合物加入其它 化学物质(例如苯甲酸钠或山梨酸钾)以防止污染微生物的生长。
本发明的发酵方法可产生这样的纤维素酶混合物，与碳源仅含有 HDC并且使用未经改造或选择(针对Xyr1或Xyr1等价转录因子的过表 达)的真菌菌株的相应方法相比，其含有多出至少约两倍的分泌蛋白。例 如，与碳源仅含有HDC且使用未经改造或选择(针对Xyr1或Xyr1等价 转录因子的过表达)的真菌菌株的相应方法相比，本文所述方法可产生多 出2.5至约10倍(或其间任意值)的分泌蛋白，例如多出约2.5、2.6、2.8、 3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、 5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、 8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10倍(或其间任意值)或10倍以上 的分泌蛋白。因此，本发酵方法的特征在于，与碳源仅含有HDC并且使 用未经改造或选择(针对Xyr1或Xyr1等价转录因子的过表达)的真菌 菌株的相应方法相比，单位生产率(表示为mg(所产生的分泌纤维素酶) /g(生物质)/h)提高到约2倍以上(例如约5倍以上)，或其间任意值。 表2显示在不同量的本文所述HDC、诱导纤维素酶之碳水化合物(CIC) 或者HDC、CIC两者存在下蛋白质产生的单位生产率的提高。
表2：来自利用不同碳源的亲本和经改造丝状真菌深层液体培养物的蛋白 质和真菌细胞产生
a这些发酵中的CIC诱导产生混合物，其含有(以总碳水化合物计)56％龙胆 二糖、14％槐糖、6％纤维二糖、10％海藻糖、6％麦芽三糖、4％葡萄糖和14 ％其它碳水化合物。
纤维素酶混合物
本发明的发酵方法产生纤维素酶混合物。本文所用的“纤维素酶混合 物”是包含由经改造丝状真菌宿主在发酵过程中分泌的纤维素酶组分、半 纤维素酶组分和其它蛋白质的混合物。相对于纤维素酶混合物中存在的总 蛋白质来说，由本发明发酵方法产生的纤维素酶混合物含有约40重量％ 至约100重量％的纤维素酶组分。例如，纤维素酶组分可占纤维素酶混合 物中总蛋白质的约40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或100重量％(或其间任意值)。表3显示使用本发明的发酵方法由经改 造丝状真菌宿主产生的纤维素酶混合物中纤维素酶组分的相对比例。
本文使用的术语“纤维素酶组分”包括内切葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)、 纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)及其混合物。 术语“纤维素酶组分”还包括另外的蛋白质，例如参与或提高纤维素之酶 促降解的膨胀素(swollenin)。应当理解，本发明的实践不受制于对纤维 素酶混合物中纤维素组分的鉴定。纤维素酶组分是称为“糖基水解酶“的 更大酶家族的一部分。糖基水解酶分为不同的家族并被列于 Carbohydrate-Active Enzymes数据库(Coutinho，P.M.和Henrissat，B.， 1999；另见：afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)中。该数据库和命名法是本领域 技术人员所熟知的。最常见的纤维素酶组分是糖基水解酶家族1、3、5、 6、7、12、45或61的成员。当涉及由里氏木霉产生的天然纤维素酶混合 物时，术语“纤维素酶组分”是指以下的部分或全部：纤维二糖水解酶1 (Cel7A)、纤维二糖水解酶2(Cel6A)、内切葡聚糖酶1(Cel7B)、内切 葡聚糖酶2(Cel5A)、内切葡聚糖酶3(Cel12A)、内切葡聚糖酶4(Cel61A)、 内切葡聚糖酶5(Cel45A)、β-葡糖苷酶1(Cel3A)和β-葡糖苷酶2(Cel3B)、 CipI和膨胀素。
参与半纤维素降解的酶在本文中称为“半纤维素酶”或“半纤维素酶组 分”(综述见于Saha，B.C.，2003)。半纤维素酶包括但不限于：内切木聚 糖酶(E.C.3.2.1.8)、β-木糖苷酶(E.C.3.2.1.37)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶(E.C. 3.2.1.55)、α-葡糖醛酸酶(E.C.3.2.1.139)、乙酰木聚糖酯酶(E.C.3.1.1.72)、 阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73)、β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78)和β-甘露糖 苷酶(E.C.3.2.1.15)。木聚糖是丰度最高的半纤维素。本文使用的术语“木 聚糖酶”或“木聚糖酶组分”是指具有内切木聚糖酶、外切木聚糖酶或β-木 糖苷酶活性的酶。木聚糖酶可属于糖基水解酶家族3、5、10和11。当涉 及由里氏木霉产生的天然纤维素酶混合物时，术语“木聚糖酶”或“木聚糖 酶组分”是指以下来自里氏木霉之酶的部分或全部：β-木糖苷酶1(Bxl1)、 β-木糖苷酶2(Bxl2)、木聚糖酶1(Xyn1)、木聚糖酶2(Xyn2)、木聚糖 酶3(Xyn3)和木聚糖酶4(Xyn4)。
表3：由亲本和经改造丝状真菌利用不同碳源的深层液体培养物分泌的纤 维素酶混合物的组成。
a这些发酵中的CIC诱导产生混合物，其含有(以总碳水化合物计)56％龙胆 二糖、14％槐糖、6％纤维二糖、10％海藻糖、6％麦芽三糖、4％葡萄糖和14 ％的其它碳水化合物。
b比值基于ELISA测定结果，如实施例5.3所述。比值是纤维素酶Cel7A、Cel7B、 Cel6A和Cel5A的浓度之和比木聚糖酶xyn1和xyn2的浓度之和，如图12所 示。
c如实施例5.4所述的对经预处理之木质纤维素底物的相对水解活性。
纤维素底物的水解
使用本发明发酵方法产生的纤维素酶混合物可用于纤维素或纤维素 底物的水解。术语“纤维素底物”是指来源于植物生物质且含有纤维素的任 何底物，其包括但不限于：用于生产乙醇或其它高价值产品、动物饲料、 林业废弃物(例如浆和木片)和纺织品的预处理木质纤维素原料。表3 显示由本发明发酵方法产生的纤维素酶混合物对经预处理之木质纤维素 原料的水解活性。
通过本发明发酵方法产生的纤维素酶可用于酶促水解“经预处理的木 质纤维素原料”。经预处理的木质纤维素原料是植物来源的材料，其在预 处理前含有至少20％的纤维素(干重)，更优选地高于约30％的纤维素， 更优选地高于40％的纤维素，以及至少10％的木质素(干重)，更通常地 至少12％(干重)，并且其已经过物理和/或化学加工以使纤维更容易获得 和/或易于被纤维素酶作用。预处理方法的非限制性实例包括使用硫酸或 亚硫酸或其它酸；氨、石灰、氢氧化铵或其它碱；乙醇、丁醇或其它有机 溶剂；或加压水化学处理木质纤维素原料(见美国专利No.4,461,648、 5,916,780、6,090,595、6,043,392、4,600,590；Weil等，1997，Appl.Biochem. Biotechnol.681：21-40以及K.，等，2005，Appl.Biochem. Biotechnol.Spring(121-124)：1055-1067；其通过参考并入本文)。
例如，可将纤维素底物与采用本文所述方法产生的纤维素酶一起孵 育，其浓度为每升反应混合物约1至约200g纤维素(或其间任何值)， 例如约1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、 140、160、180、200g(或其间任何值)，所用纤维素酶剂量为每克纤维 素约0.1至约100mg蛋白质(或其间任何值)，例如每克纤维素约0.1、 0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mg蛋 白(或其间任何值)。可将反应混合物孵育约4小时至约120小时(或其 间任何值)，温度为约30℃至约60℃(或其间任何温度)，例如约30、35、 40、45、50、55、60℃，pH值为约3.5至约7.0(或其间任何值)，例如 约pH 3.5、pH 4.0、pH 4.5、pH 5.0、pH 5.5、pH 6.0、pH 6.5、pH7.0(或 其间任何值)。孵育之后，可对包含半纤维素来源之碳水化合物、诱导纤 维素酶之碳水化合物、葡萄糖和/或寡糖的反应产物进一步加工(例如用 作生产乙醇、丁醇、糖醇、乳酸、醋酸的底物)，或者可使用本领域已知 的标准方法浓缩和纯化最终产物。
总之，本发明提供了高产的发酵方法，其产生可用于纤维素底物水解 的含有低半纤维素酶的纤维素酶。
上述描述并不旨在以任何方式限制所主张权利的本发明。此外，所讨 论的特征组合并不是本发明技术方案所绝对必需的。
实施例
实施例1：用于克隆和表达Xyr1转录因子的宿主菌株
实施例1.1：用于过表达Xyr1转录因子的木霉宿主菌株
用于过表达Xyr1转录因子的里氏木霉宿主菌株包括RutC30、 P285-6aux和P491P6。
RutC30菌株(ATCC#56765)是从QM6A前体菌株分离获得的纤 维素酶高产衍生菌株(Montenecourt和Eveleigh，1979)。通过对RutC30 菌株随机突变和/或选择产生了纤维素酶超高产菌株。通过利用含1％酸膨 胀纤维素(acid swollen cellulose)和4g L-1 2-脱氧葡萄糖的基本琼脂培养 基，将与RutC30相比能产生更大澄清(clearing)区域的M2C38菌株分 离出来。然后对M2C38进一步随机诱变，通过利用含有0.2μg/mL多菌 灵(carbendazim)的乳糖培养基筛选而获得BTR213菌株。
P285-6aux菌株是BTR213菌株的衍生株，其中编码内切葡聚糖酶2 的基因缺失并且其不能在缺乏尿苷的培养基上生长。内切葡聚糖酶2基因 的缺失通过使用图1所示的p^EG2-hph-TV3载体转化BTR213菌株来实 现。用潮霉素抗性盒替换p^EG2-hph-TV3载体中cel5a基因的编码区， 所述盒中里氏木霉pgk基因的启动子和里氏木霉纤维二糖水解酶1基因的 转录终止子与潮霉素磷酸转移酶基因(hygromycin phosphotransferase gene，hph)有效连接(如美国专利No.6,015,703所述)。在潮霉素抗性盒 两侧的5′和3′端分别是内切葡聚糖酶2基因的约2.8kb和2.4kb，从而在 里氏木霉基因组中的内切葡聚糖酶2基因座内发生同源重组。按照实施例 4所述的PEG介导的原生质体转化法，利用经限制性内切酶XbaI消化而 被线性化的p^EG2-hph-TV3转化BTR213菌株。利用含有20U/ml潮霉 素的PDA培养基选择转化子。以内切葡聚糖酶2的编码序列作为探针， 通过Southern杂交验证内切葡聚糖酶2基因的缺失(图1B)。根据在添 加有5mM尿苷和0.15(重量/体积)％的5-氟乳清酸的基本琼脂培养基 上的生长能力，分离出尿嘧啶合成存在缺陷的P285-6菌株之pyr4营养缺 陷型(P285-6aux菌株)。
P491P6菌株是M2C38菌株的衍生株，其包含木聚糖酶2基因中的 缺失并且其不能在缺乏尿苷的培养基上生长。木聚糖酶2基因的缺失通过 使用图2所示的pXBG2-pyr4-DR载体转化M2C38aux5菌株来实现，所 述M2C38aux5菌株是针对在含有5mM尿苷和0.15％(重量/体积)5- 氟乳清酸的基本培养基上生长的能力选择出来的M2C38菌株之pyr4营养 缺陷型。用含有里氏木霉cel3a基因(编码β-葡糖苷酶1)的大插入片段 替换pXBG2-pyr4-DR中木聚糖酶2基因的编码区，所述插入片段中插入 了两侧为同向重复序列的粗糙脉孢菌pyr4基因。以四环素基因为模板(671 bp-990bp)，使用以下引物通过PCR扩增得到同向重复序列：DR1-F GCGTGCTGCTAGCGCTATATGC(SEQ ID NO：28)，DR1-R GGCCTGGTACCATACCCACG(SEQ ID NO：29)，DR2-F GCGTGCTGGTACCGCTATATGC(SEQ ID NO：30)和DR2-R GGCCTGCTAGCATACCCACG(SEQ ID NO：31)。在pXBG2-pyr4-DR 中cel3A-pyr4同向重复序列盒两侧的5′和3′端分别是木聚糖酶2基因的 约2.1kb和1.9kb，从而在里氏木霉基因组中木聚糖酶2基因座内发生同 源重组。按照实施例4所述的PEG介导的原生质体转化法，利用经限制 性酶Cla1消化而被线性化的pXBG2-pyr4-DR转化M2C38aux5菌株。通 过如实施例4所述的基本琼脂培养基选择转化子。使用与木聚糖酶2编码 区互补的引物，对所有稳定的转化子进行基因组DNA PCR扩增以筛选木 聚糖酶2基因的缺失(数据未显示)。为了验证其无法产生木聚糖酶2蛋 白，将所有转化子在如实施例5.1中所述的含有木糖的木霉微培养培养基 中培养。通过12％SDS-PAGE将总分泌蛋白(10μg)分离出来，而后将 其转移至PVDF膜并使用针对木聚糖酶2的抗体进行免疫印迹检测。一 些转化株的总分泌蛋白样品中xyn2特异性条带的缺失证实了xyn2基因的 成功缺失(图2B)。根据在添加有5mM尿苷和0.15％(重量/体积)5- 氟乳清酸的基本琼脂培养基上的生长能力，分离出尿嘧啶合成存在缺陷的 P491P菌株之pyr4营养缺陷型(P491P6菌株)。
实施例2：在使用不同给料的木霉发酵中酶的产生与转录调节因子xyr1 和ace1的表达水平
在使用不同碳源的分批补料发酵中，使用里氏木霉P59G菌株评估蛋 白质、生物质产生、qp与cbh1(纤维二糖水解酶1)、xyr1(木聚糖酶调 节因子1)和ace1(纤维素酶活化因子1)的表达水平。P59G菌株是BTR213 菌株的遗传改造菌株(例如实施例1所述)，前者产生和分泌高水平的由 里氏木霉bgl1编码的β-葡糖苷酶，如美国专利No.6,015,703所述。
实施例2.1：使用含CIC的戊糖的发酵
在含有马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)的标准85mm 培养皿上接种经15％甘油冷冻(-80℃)保藏的木霉P59G菌株孢子。将 这些平板在28℃孵育3～5天使新鲜绿孢子汇合生长。为了制备用于发酵 试验的接种物，将来自单个PDA平板的孢子转移到含750mL液体 Berkley培养基(pH 5.5)的2L带档板Erlenmeyer瓶中，该培养基中添 加了5.1g/L玉米浸液(corn steep liquor)粉末和10g/L葡萄糖。将瓶用 轨道摇床(Model G-52New Brunswick Scientific Co.)以100rpm在28℃ 孵育3天。
瓶中所用的Berkley培养基
*痕量元素溶液含有5g/L FeSO4·7H2O；1.6g/L MnSO4·H2O；1.4g/L ZnSO4·7H2O。
将接种物瓶中的内容物移至盛有10L初始中试培养基(pH 5.5)的 14L中试规模发酵罐(Model MF114 New Brunswick Scientific Co.)。以 分批模式运行该发酵罐，直至培养基中的葡萄糖耗尽。此时，以连续的方 式从储料添加碳源，该储料为35.5％(重量/体积)的溶于水之固体。以 每小时每升培养物0.4g碳的速度，使用蠕动泵输送补料中的碳源。在运 行的分批部分和分批补料部分过程中的运行参数为：通过叶轮搅拌以500 rpm混合，以每分钟8标准升喷射空气，温度为28℃。在分批培养阶段 培养物pH保持在4.0～4.5，在纤维素酶生产阶段pH值保持为3.5，其使 用与实时pH探头和能够添加10％氢氧化铵溶液的泵相连的自动控制器 来实现。定期地，吸取100mL培养液样品用于分析生物量和蛋白质。总 发酵时间通常为96～144小时。
用于分批补料发酵的初始培养基
*痕量元素溶液含有5g/L FeSO4·7H2O；1.6g/L MnSO4·H2O；1.4g/L ZnSO4·7H2O。
使用经称重、通过玻璃微纤维滤器真空过滤以及于100℃烘干4～24 小时的5～10mL等分样品来测定培养液中的生物质含量。生物量浓度根 据下列公式确定。
使用Bradford测定来确定培养滤液的蛋白质浓度。根据595nm处 的吸光度测量，使用分光光度法定量考马斯亮蓝G-250染料的颜色强度变 化(其构成了该测定的基础)。所用的标准测定对照是已知组成和浓度的 纤维素酶混合物。单位生产率(qp)表示每小时发酵每克生物量产生的蛋 白质毫克数。
图1显示了利用不同碳源时里氏木霉P59G菌株的发酵模式。如所预 期地，经过164小时的培养，利用诱导纤维素酶之混合物(CIC)产生的 总蛋白量显著高于利用含2％纤维二糖的木糖或阿拉伯糖发酵中产生的 总蛋白量。相反地，利用戊糖的生物质产生显著更高，从而导致了在整个 发酵期间单位生产率的降低(表4)。通过向补料中加入8～15％的CIC， 可提高利用半纤维素来源之碳水化合物(HDC)时的纤维素酶产量(表4)。
表4.里氏木霉P59G菌株利用不同补料类型时的蛋白质和生物质产生。
a-五次发酵的平均值
b-两次发酵的平均值
实施例2.2：在不同碳源中xyr1、ace1和cel7a的表达水平
在纤维素酶诱导后72小时，从上述发酵获得生物质样品。将发酵样 品通过GF/A超细纤维纸过滤，用无菌水清洗，并在液氮中冷冻。在液氮 中研磨粉碎冷冻的菌丝体，使用Strategene RNA分离试剂盒(VWR货 号CA99900-134)列出的方案提取总RNA。使用OD260nm＝1.0表示40 μg/mL的浓度转换来定量RNA。利用来自每个转化子样品的刚好10μg 总RNA来制备第一链cDNA。将RNA与1.5μL的100μM AncT引物 (Invtrogen)、2μL的25mM dNTP(每种dNTP 6.25mM)相混合，并 添加来自GIBCO的不含RNase和DNase的水至终体积25μL。65℃加热 RNA混合物5分钟，然后在冰浴快速冷却2分钟。向该混合物中加入8μL 5×第一链缓冲液(Invitrogen)、4lμL的0.1M DTT(Invtrogen)和1μL 的RNasein(Invitrogen)。将试管混匀后于42℃孵育2分钟。此后，加入 2μL SuperScriptII(Invitrogen)。将所有样品在42℃孵育60分钟进行合 成反应。将第一链cDNA保存于-20℃。
使用Strategene MX3000P qRT-PCR系统通过实时定量PCR (qRT-PCR)测定编码转录调节因子xyr1和ace1基因及其靶标基因cbh1 的表达水平。除了扩增子特异性引物以外，所有qRT-PCR试剂均购自于 Stratagene并按照制造商的说明使用。使用标准曲线法测定转录物水平的 量值。标准曲线是根据编码核转运因子2(nuclear transport factor 2， Ntf-2)的组成型表达参照基因建立的，用于xyr1、ace1和cel7a扩增子的 引物示于表5(SEQ ID 1至8)。为了得到标准曲线，将所有收集到的cDNA 样本等量的等分样品合并，并用无菌水进行1∶10、1∶100和1∶1000的稀释 并用于接下来的qRT-PCR。为了测定每种基因cDNA的相对转录物水平， 对稀释样品进一步实施1∶20稀释，将2μL等分样品一式三份加入96孔 qRT-PCR阵列微孔板中。向每孔加入18μL的SYBR Green Master混合 液，其含有：2×Brilliant SYBR Green(10μL)、1/500稀释(0.75μL) 的ROX参照染料、10pmol的等量的正向和反向引物(1μL)以及6.25μL 的GIBCO水。PCR方案由以下步骤组成：I)1个循环的25℃15分钟， 95℃10分钟；II)40个循环的95℃30秒，55℃20秒，72℃20秒；III) 1个循环的95℃1分钟，55℃30秒，95℃30秒。按照Stratagene MX3000P 手册中所述的对数据进行分析，其中将可靠测定为指数产生的部分循环 (Ct)转换为拷贝数。为每一基因绘制标准曲线以测定拷贝数。然后，根 据参照基因Ntf-2将这些数值归一化。最终数值是相对于参照基因的靶基 因相对表达水平。
表5：qRT-PCR所用引物列表：
cbh1基因利用98％木糖+2％纤维二糖或98％阿拉伯糖+2％纤维二糖 时的表达水平低于利用65％葡萄糖+35％CIC时的表达水平(图3)。这 与蛋白质产生模式(表4)和转录激活因子xyr1编码基因的表达水平(图 3)是相关的。相反地，负转录调节因子ace1的转录物水平与向发酵提供 的碳源无关(图3)。不希望受理论约束，有可能正转录调控因子Xyr1的 较低水平是限速因素，继而导致利用HDC时纤维素酶和总蛋白质的较低 产生。
实施例3：里氏木霉xyr1基因的克隆
实施例3.1：里氏木霉基因组DNA的分离和xyr1的扩增
对于基因组DNA分离来说，将从马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板收 集的里氏木霉孢子接种到50mL马铃薯葡萄糖培养液(Potato Dextrose Broth，PDB)(Difco)中。在28℃以200rpm振摇培养2～3天。用玻璃 纤维圆片(glass fiber circle，GFA，Fisher货号09-804-424)过滤菌丝体并 用冷的去离子水进行清洗。使用液氮冷冻真菌块，接着用预冷研钵和研杵 将菌块粉碎；将0.5g粉末状生物质重悬于5mL缓冲液(含有100mM Tris、50mM EDTA，pH 7.5和1％十二烷基硫酸钠(SDS))。将裂解物 在4℃以5000g离心20分钟，以沉淀细胞碎片。用等体积的TE缓冲液 (10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0)饱和酚萃取上清液，而后使用等 体积的缓冲液饱和的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)萃取。通过加入0.1体积 的3M醋酸钠(pH 5.2)和2.5体积冷的95％乙醇从溶液中沉淀出基因组 DNA。在-20℃孵育至少1小时后，在4℃以5000g离心20分钟沉淀出 DNA，用10mL 70％酒精漂洗，在空气中干燥，然后用1mL TE缓冲液 重悬。加入核糖核酸酶A(Sigma-Aldrich)(终浓度为0.1mg/mL)并在 37℃孵育1小时以消化RNA。用等体积的缓冲液饱和酚以及等体积的缓 冲液饱和的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)萃取以除去核糖核酸酶。通过加入 0.1体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2.5体积冷的95％乙醇从溶液中沉淀 出DNA，离心沉淀，用70％乙醇漂洗，在空气中干燥，并用50μL的TE 缓冲液重悬。通过测量在260nm处溶液的吸光度来确定DNA的浓度(p. C1，Sambrook等，1989)。
使用PlatinumTaq DNA聚合酶(Invitrogen)以及如下引物从里氏 木霉基因组DNA中扩增包含xyr1编码序列和本源终止子(SEQ ID NO： 23)的DNA片段：正向-CH25 CATATGTTGTCCAATCCTCTCCG(SEQ ID NO：9)和反向-CH26 GCGGCCGCGGTACCTACAGCCATGCTCATCGTGC(SEQ ID NO： 10)。分别在xyr1编码序列和本源终止子片段的5′和3′端添加了NdeI和 KpnI-NotI限制性位点。根据酶制造商提供的方案进行PCR，引物退火温 度为60℃，延伸时间为4分钟，循环数为30。然后PCR反应产物利用1 ％琼脂糖TAE凝胶跑胶，使用Wizard SV凝胶及PCR纯化系统 (Promega)提取3.5Kb扩增子。
实施例3.2：质粒构建
将包含xyr1编码区(SEQ ID NO：24)的PCR产物连接到pGEM- T Easy载体(Promega)中，从而得到pGEM-xyr1-t。使用PlatinumTaq DNA聚合酶(Invitrogen)和如下引物从里氏木霉基因组DNA中扩增诱 导型β-木糖苷酶1启动子(Pbxl1，SEQ ID 26)：正向-CH27 5′-GGTACCCAATTGAGAGCTTGTCTGCCTTGATTACCATCC-3′ (SEQ ID NO：13)和反向-CH25′ -AAGCTTGCGGCCGCCATATGCGTCCGGCTGTCCTTCAATGG-3′ (SEQ ID NO：14)。这些引物还分别在扩增的启动子片段的5′和3′端引 入了KpnI和NdeI-NotI-HindIII限制性位点。根据酶制造商推荐的方案进 行PCR，引物退火温度为51.5℃，延伸时间为2.5分钟，循环数为30。 使用Wizard SV凝胶及PCR纯化系统(Promega)纯化出1.5kb的Pbxl PCR产物，并将其克隆到pGEM-T Easy载体(Promega)中，从而得 到pGEM-Pbxl1。将该载体用KpnI和HindIII限制性酶消化后，使用 Wizard SV凝胶及PCR纯化系统(Promega)凝胶提取Pbxl1启动子片 段，并将其克隆到pUC119载体的相应位点中，从而得到pUC119-Pbxl1 质粒。将pGEM-xyr1-t质粒用NdeI和KpnI限制性酶消化，使用琼脂糖 凝胶电泳分离xyr1片段，并用Wizard SV凝胶及PCR纯化系统 (Promega)进行凝胶提取。将该片段克隆到pUC119-Pbxl1质粒的相应 位点中，得到pUC119-Pbxl1-xyr1-t质粒。
使用XhoI和BglII限制性酶从pHPT136(美国专利No.6,015,703所 述)分离赋予潮霉素抗性的选择标记盒。凝胶纯化Ppgk-hph-Tcbh1片段 并将其连接到pSP72载体的XhoI和BamHI位点之间，从而得到pSP-hph 载体。使用限制性酶KpnI消化pUC119-Pbxl-xyr1-t，凝胶纯化含有xyr1 表达盒的～5.0kb片段，并将其连接到pSP-hph载体的KpnI位点中，得 到pSP-bxl:xyr1-hph里氏木霉转化载体(图4A)。
pPbxl:xyr1-pyr4里氏木霉转化载体如下产生。用KpnI限制性酶部分 消化含有粗糙脉孢菌pyr4基因的pNcBgl-NSN(r)*质粒(见美国专利 No.7,456,005)。使用1％琼脂糖凝胶电泳分离6.2kb的线性化质粒，并用 Wizard SV凝胶及PCR纯化系统(Promega)纯化。使用限制性酶KpnI 彻底消化pUC119-Pbxl-xyr1-t后分离Pbxl-xyr1-t片段，并如上所述进行 凝胶纯化。将5.0kb的xyr1表达盒连接到线性化的pNclBgl-NSN(r)*中，得到最终转化载体pPbxl:xyr1-pyr4(图4A)。
实施例4：过表达Xyr1转录因子的经改造丝状真菌宿主的制备
使用PEG介导的原生质体转化法将pPbxl-xyr1-pyr4转化载体引入里 氏木霉P285-6aux菌株和P491P6菌株中，以及将pPS-bxl:xyr1-hph转化 载体引入野生型RutC30菌株中。将所选菌株的约5×106孢子铺板到置于 PDA(含5mM尿苷)的无菌玻璃纸上，于30℃孵育20小时。将带有菌 丝体的玻璃纸圆片转移到10mL原生质体制备溶液(其在50mM磷酸钾 缓冲液(pH 6.5，含有0.6M硫酸铵)(缓冲液P)中含有7.5g/L的崩溃 酶(Driselase)和4g/L β-葡聚糖酶(InterSpex Products Inc.，货号分别 是0465-1和0439-2)。将菌丝体于28℃以60rpm轻轻搅拌消化5小时。 在室温下以1000～1500×g离心10分钟收集原生质体，并用5mL缓冲液 P清洗。用1mL STC缓冲液(1.2M山梨醇，10mM CaCl2，10mM Tris-HCl，pH 7.5)重悬沉淀，通过无菌的60号MIRACLOTHTM过滤将 其与未消化的菌丝体分离，并收集到无菌的微量离心管中。对于转化来说， 将0.1mL原生质体悬液(约5×106原生质体)与10μg线性化的载体DNA 及25μL PEG溶液(25％PEG 4000，50mM CaCl2，10mM Tris-HCl，pH 7.5)混合。将混有DNA的原生质体在冰上孵育30分钟，然后加入1mL PEG溶液，将混合物在室温下孵育5分钟。用2mL含1.2M山梨醇的 PEG溶液稀释转化混合物。
将含有pPbxl-xyr1-pyr4质粒和P285-6aux或P491P6菌株原生质体 的转化混合物的四个0.75ml等分样品加至25mL冷却到约47～50℃的熔 融MMSS琼脂培养基中(见下文)，再将原生质体悬液倒在MM琼脂上 (见下文)。将平板置于30℃孵育直至可观察到菌落生长。将转化子转移 到含有MM琼脂的各板并使其形成孢子。收集孢子，将其高度稀释并铺 板在MM琼脂上以分离同核体转化子，然后将其铺板到PDA(Difco)上 并于30℃孵育以形成孢子用于后续遗传分析。
将含有RutC30原生质体和pSP-bxl:xyr1-hph质粒的转化混合物的四 个0.75ml等分样品加至25mL冷却到约47～50℃的PDA培养基中，再 将原生质体悬液倒入150mm直径培养皿中。于30℃孵育5小时后，加 入25mL含有80U/mL潮霉素的覆盖培养基。将平板于30℃孵育直至可 见菌落生长。将转化子转移到含有40U/mL潮霉素的各PDA琼脂板用于 进行二次选择。将分离出的稳定转化子转移到PDA培养基并使其形成孢 子。收集孢子，将其高度稀释并铺板在含有40U/mL潮霉素的PDA上以 分离同核体转化子，然后将其铺板到PDA(Difco)上并于30℃孵育以形 成孢子用于后续遗传分析。
基本琼脂培养基(minimal medium，MM)：
*除含有MM琼脂的同样组分以外，MMSS琼脂还含有1.2M山梨醇、4mM MgSO4、1g/L YNB(不含氨基酸的酵母氮源，DIFCO，货号291940)和0.12 g/L氨基酸(-Ura DO补充物，CLONTECH，货号8601-1)。
实施例5：经改造丝状真菌宿主的遗传特征
实施例5.1：验证载体整合至里氏木霉基因组中
使用如下所述的特异性引物，通过对分离的基因组DNA样品进行 PCR评估分离的经改造丝状真菌宿主中是否存在Pbxl:xyr1表达盒。对于 基因组DNA提取来说，使有丝分裂稳定的转化子在马铃薯葡萄糖琼脂上 形成孢子。用1ml的马铃薯葡萄糖培养液(PDB)培养基覆盖PDA平板 来收集孢子，然后在30℃孵育(无需振摇)24～36小时使之萌发。在微 量离心管中以10000rpm离心菌丝体并丢弃上清。将沉淀重悬于0.25mL RNA裂解缓冲液(Stratagene RNA分离试剂盒，货号400800)，并向各 细胞悬液中加入等体积的玻璃珠。以最大速度涡旋振摇微量离心管3分钟 以剪切菌丝体。加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇，将微量离心管涡旋振摇 30秒。最后，加入0.4mL的TE缓冲液(pH 7.5)，将微量离心管涡旋振 摇30秒。以13000rpm离心10分钟分离水相，将其转移到新管中。通过 加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2.5倍体积的100％乙醇沉淀出 基因组DNA。以13000rpm离心10分钟沉淀出DNA。用70％乙醇清洗 沉淀，在室温下干燥，然后溶解于30～40μL含有RNaseA(0.005mg/mL) 的无菌水中。将1μL基因组DNA用于后续的PCR反应。
使用分离自推定经改造丝状真菌宿主的基因组DNA进行PCR分析 以验证Pbx:xyr1表达盒的整合。该PCR所使用的引物为：AC 124(Pbxl 正向)TTGAGCGCAGCATCACTGTGTAGA(SEQ ID NO：17)和AC127 (xyr1反向)AACGGATCTGCGTCTGTGTCTGAT(SEQ ID NO：18)。 还使用了GoTaq DNA聚合酶(Promega)，退火温度为55℃，延伸时间 为1.5分钟，扩增循环数为30。通过从基因组DNA中扩增出含有Pbx:xyr1 表达盒的1kb PCR产物来鉴定阳性转化子。亲本菌株P285-6aux(图4B)、 RutC30和P491P6未检出1kb的PCR产物(数据未显示)，表明不存在 重组DNA。菌株P692B、P692A、RutC30-R3、P1194E、P1194F、P1197B 被鉴定为阳性经改造丝状真菌宿主，并选用于进一步分析。
实施例5.2：xyr1和(半)纤维素酶基因的表达水平
为了确定xyr1和所选(半)纤维素酶基因的转录水平，从培养于液 体生长培养基中的经改造丝状真菌宿主和亲本菌株的菌丝体分离总 RNA。
液体生长培养基
向含5mL液体生长培养基的培养管接种经改造丝状真菌宿主的孢 子，并在30℃振摇4天。通过GF/A超细纤维纸过滤生物质，用无菌水 清洗，并在液氮中冷冻。按实施例2.2中所述进行RNA分离和qRT-PCR 反应。用于评估xyr1、cel7a、cel7b、xyn1、xyn2和bxl1基因转录水平的 引物对列于表6中。
表6.用于对过表达Xyr1转录因子丝状真菌宿主和亲本丝状真菌进行 qRT-PCR分析的引物
相比于用同样碳源培养的相应亲本丝状真菌中的xyr1转录水平，所 测试的含Pbxl:xyr1表达盒的所有经改造丝状真菌宿主(利用包含葡萄糖、 HDC(木糖)和CIC(纤维二糖)的碳源培养)均显示xyr1转录水平至 少2倍的提高。例如，当经改造丝状真菌宿主P692B菌株和RutC30-R3 菌株利用100％木糖和100％阿拉伯糖培养时，与其亲本丝状真菌P285-6 菌株和RutC30菌株相比，获得高出至少2倍的xyr1转录物水平(图5A 和B)。这导致，当发酵碳源为100％HDC(木糖或阿拉伯糖)时，相比 于相应的亲本菌株，Xyr1过表达菌株中的cel7a、cel7b和xyn1转录物水 平显著增加。观察到xyr1过表达对bxl1和xyn1转录物水平略有影响。
实施例6：xyr1过表达对经改造丝状真菌宿主产生纤维素酶的影响
在14L发酵中使用了不同类型的碳源(例如，葡萄糖+CIC、100％ 木糖、100％阿拉伯糖以及50重量％甘油、25重量％葡萄糖和25重量％ 木糖醇的混合物)。按照实施例2.1中所述进行所有发酵以及对qp、生物 质和蛋白质产生进行评估。在14L的中试规模发酵中，高产里氏木霉菌 株利用葡萄糖+CIC在160～180小时内通常产生30～45g/L总蛋白质。 在发酵进行至40～60小时时qp达到最大值，并在发酵结束时下降。亲本 菌株P285-6、P491P和RutC30利用葡萄糖+CIC时显示通常的发酵表现 指标(表2)，这表明引入受bxl1启动子调控的额外xyr1基因拷贝未在这 些条件下显著影响纤维素酶基因表达。然而，由于在P692B中表达了受 bxl1启动子调控的额外xyr1拷贝，并且在利用葡萄糖+CIC作为补料的发 酵中bxl1基因表达微弱，有可能Xyr1转录因子的表达水平没有显著增加， 并因此不足以提高纤维素酶产生。
与相应的亲本丝状真菌菌株P285-6、RutC30和P491P相比，由经改 造丝状真菌宿主菌株P692B、P692A、RutC30-R3、P1197B、P1194E和 P1194F在利用100％木糖的发酵过程中得到的最大qp和总蛋白量(g/L) 分别增加约4倍和3倍(表2)。此外，与相应亲本丝状真菌相比，经改 造丝状真菌宿主利用100％木糖作为碳源的发酵过程中积累了显著较少 的生物质(表2)。
与各自的亲本丝状真菌P285-6和RutC30相比，经改造丝状真菌宿 主P692A和RutC30-R3当利用其它HDC(100％阿拉伯糖或者50重量 ％甘油/25重量％葡萄糖和25重量％木糖醇的混合物)作为碳源培养时也 观察到qp和蛋白质产量增加的类似益处(表2)。在某些情况下，例如当 使用阿拉伯糖作为碳源时，使用经改造丝状真菌宿主(P692A菌株)的发 酵方法产生了比相应亲本丝状真菌(P285-6菌株)更多(而非更少)的 生物质，并且获得更高的蛋白质产量(图10)。这导致更高的qp平均值， 表明xyr1过表达不仅激活了阿拉伯糖补料培养中的纤维素酶基因表达， 而且还整体促进了阿拉伯糖的有效代谢。
实施例7：分析由过表达Xyr1之经改造丝状真菌宿主产生的纤维素酶混 合物中纤维素酶和半纤维素酶的组分
实施例7.1：测定在14L分批补料发酵中产生的纤维素酶混合物中纤维素 酶和半纤维素酶组分的相对比例
通过ELISA测定四种纤维素酶组分(Cel7A、Cel6A、Cel7B、Cel5A) 以及两种木聚糖酶组分(Xyn1和Xyn2)的相对浓度(占总分泌蛋白的重 量百分比)。用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2)将来自14L发酵的培养滤 液和纯化的标准组分稀释到0.01～10μg/mL，并于4℃在微量滴定板 (Costar EIA#9018)中孵育过夜。用含0.1％吐温20的PBS(PBS/Tween) 清洗这些板，然后用含1％牛血清白蛋白的PBS(PBS/BSA)在室温下孵 育1小时。用PBS/Tween清洗经封闭的微量滴定孔。用PBS/BSA稀释特 异性针对Cel7A、Cel6A、Cel7B、Cel5A、Xyn1和Xyn2的兔多克隆抗血 清，将其加至各微量滴定板并在室温下孵育2小时。清洗板，并与经辣根 过氧化物酶偶联的山羊抗兔抗体(Sigma#A6154)(用PBS/BSA进行 1/2000稀释)一起在室温下孵育1小时。清洗后，向各板加入四甲基联苯 胺并在室温下孵育30分钟。测量每孔中360nm处的吸光度，并使用 Cel7A、Cel6A、Cel7B、Cel5A、Xyn1和Xyn2的标准曲线将其转换成蛋 白质浓度。每种组分的浓度表示为组分占总分泌蛋白质的质量百分数。在 一种分析结果的方法中，将各酶中Cel7A、Cel6A、Cel7B和Cel5A的浓 度相加并在表3中统称为“纤维素酶”。类似地，将各酶中Xyn1和Xyn2 的浓度相加并在表3中统称为“木聚糖酶”。使用这些术语并不意味着不 存在其它未经ELISA测试的分泌蛋白(其也可作为纤维素酶或木聚糖 酶)。
图9B、10B和11b显示了ELISA结果。这些结果显示利用含HDC 或CIC之碳源的经改造或丝状真菌宿主亲本丝状真菌产生的纤维素酶混 合物中Cel7A、Cel6A、Cel7B、Cel5A、Xyn1和Xyn2的相对比例(表示 为占总分泌蛋白的重量百分比)。表3中显示了代表性纤维素酶(Cel7A+ Cel6A+Cel7B+Cel5A)和代表性木聚糖酶(Xyn1+Xyn2)的相对比例(表 示为占总分泌蛋白的重量百分比)。
与使用包含葡萄糖+CIC之碳源的发酵方法中产生的相比，在使用仅 含HDC之碳源的发酵方法中，由亲本丝状真菌P285-6和RutC30菌株产 生的纤维素酶组分的相对比例降低3～5倍(图9B、10B和表3)。特别地， 木聚糖酶(Xyn1+Xyn2)的比例从使用葡萄糖+CIC时占总分泌蛋白的2 重量％提高至使用HDC时的约35重量％(图9B、10B和表3)。
与利用同样碳源的相应亲本丝状真菌(P285-6和RutC30菌株)产生 的纤维素酶组分相比，过表达xyr1的经改造丝状真菌宿主(P692B和 RutC30-R3菌株)与100％木糖或阿拉伯糖一起发酵时纤维素酶组分 (Cel7A、Cel6A和Cel7B)的产生增加到1.5～3倍(图9B、10B和表3)。 此外，与使用葡萄糖+CIC作为碳源的发酵方法中由同样菌株产生的纤维 素酶混合物相比，当向发酵方法提供的碳源为100％阿拉伯糖或木糖时， 由过表达xyr1的经改造丝状真菌宿主(P692B和RutC30-R3菌株)产生 的纤维素酶混合物中纤维素酶组分的相对比例降低不显著，并且木聚糖酶 比例增加不显著(图9B、10B和表3)。
利用纯糖和甘油混合物作为碳源的发酵表明，与使用50％葡萄糖/25 ％甘油/25％木糖作为碳源时产生的半纤维素酶相比，使用50％葡萄糖/25 ％甘油/25％木糖醇作为碳源时半纤维素酶的产生显著降低(表3，图9B)。
实施例7.2：由经改造丝状真菌宿主和亲本丝状真菌产生的纤维素酶混合 物中β-木糖苷酶的含量。
使用安捷伦2100生物分析仪(Agilent Bioanalyzer 2100)和蛋白质 试剂盒230(Protein Kit 230)，按制造商所述的方案计算β-木糖苷酶的相 对浓度。表3列出了每个发酵产生的β-木糖苷酶(表示为占总蛋白质的重 量百分比)。如预期地，在使用HDC作为碳源的发酵方法中，所有亲本 丝状真菌(P285-6菌株、RutC30菌株和P491P菌株)所产生的纤维素酶 混合物均具有相对较高比例的β-木糖苷酶。在同样使用HDC作为碳源的 发酵方法中，由过表达xyr1的经改造丝状真菌宿主(P692B、RutC30-R3、 P1194E、P1194F和P1197B菌株)产生的纤维素酶混合物中β-木糖苷酶 的相对比例降低达15倍(表3)。然而，在这些由经改造丝状真菌宿主产 生的纤维素酶混合物中Cel74A(木葡聚糖酶(xyloglucanase))的相对比 例提高达总蛋白质的12重量％，而在由相应亲本丝状真菌利用测试的所 有类型碳源培养时产生的纤维素酶混合物中则未检测到该蛋白质(数据未 显示)。
与碳源为100％木糖或50重量％甘油/25重量％葡萄糖/25重量％木 糖的发酵方法相比，当培养在碳源为50重量％甘油/25重量％葡萄糖/25 重量％木糖醇的发酵方法中时，经改造丝状真菌宿主(P692B和 RutC30-R3菌株)所产生的纤维素酶混合物具有相对更低比例的β-木糖 苷酶(表3)。
实施例8：由亲本和经改造丝状真菌宿主产生的纤维素酶混合物的纤维素 水解活性。
根据美国专利申请No.11/846,653所述，评估在使用不同碳源的发酵 方法中由过表达xyr1的经改造丝状真菌宿主和相应亲本丝状真菌产生的 纤维素酶混合物的纤维素水解活性。在0.25mL混合纤维素水解测定中对 由各发酵方法产生的纤维素酶混合物进行测试。用添加了从黑曲霉制备之 β-葡糖苷酶并含有0.5％苯甲酸钠的柠檬酸缓冲液稀释纤维素酶混合物， 并将其与酸预处理的小麦秸秆共同孵育。预处理按照Foody，美国专利 No.4,461,648描述的方法进行。孵育在50℃进行24小时，靶标纤维素转 化水平大于70％。通过确定达到靶标纤维素转化水平所需酶的量来计算 纤维素酶混合物的活性。参照由亲本丝状真菌(P285-6菌株)利用葡萄 糖+CIC作为碳源(发酵编号2404)产生的纤维素酶混合物的纤维素水解 活性，对亲本和经改造丝状真菌宿主(P285-6、P692A和P692B菌株) 发酵产生的纤维素酶混合物的相关活性进行归一化。类似地，参照由亲本 丝状真菌(RutC30菌株)利用葡萄糖+CIC作为碳源(发酵编号4279) 产生的纤维素酶混合物的纤维素水解活性，对亲本和经改造丝状真菌宿主 (RutC30、RutC30-R3、M2C38、P491P、P1194E、P1194F和P1197B 菌株)发酵产生的纤维素酶混合物的相关活性进行归一化。这些结果在图 9A、11A、12A和表3中成为“相对活性”。
当使用葡萄糖+CIC作为碳源进行发酵时，相比于P285-6纤维素酶混 合物的活性，由P692B(发酵编号3796和3963)产生的纤维素酶混合物 的活性略有增加(图9a和表3)。这可能反映了在总分泌蛋白中纤维素酶 组成略有提高，如实施例7.1所讨论地。
由于在使用100％木糖或阿拉伯糖的发酵方法中由P692B菌株产生 的纤维素酶蛋白质混合物中纤维素酶组分比例的显著增加，与在类似发酵 方法中由亲本P285-6菌株产生的纤维素酶混合物相比，纤维素水解活性 分别提高4倍和2倍(图9A和表3)。
类似地，与由亲本丝状真菌(P285-6菌株)在类似发酵方法中产生 的纤维素酶混合物相比，在碳源含有木糖醇(而非木糖)的发酵方法中 P692B菌株产生的改善的纤维素酶组成在该经改造丝状真菌宿主产生之 纤维素酶混合物的纤维素水解活性方面提高达2倍(表3和图9A)。
与其亲本菌株M2-C38产生的纤维素酶混合物中的相比，P491P菌株 中木聚糖酶2的缺失并未改变纤维素酶混合物中纤维素酶组分的相对比 例。这可能是由于在低发酵pH下主要表达木聚糖酶1所致。然而，如在 经改造丝状真菌宿主P692B和RutC30-C3菌株中所观察到地，过表达 Xyr1可能导致pH依赖性表达的丧失以及两种木聚糖酶以相似丰度产生。 此外，在过表达Xyr1的情况下缺失xyn2导致在纤维素酶混合物中纤维 素酶组分的比例提升到约3倍，并因此改善了纤维素酶活性(表3)。
另外，在由M2-C38和P491P菌株产生的纤维素酶混合物中纤维素 酶组分的比例没有显著差异，这反映在相似的纤维素酶水解活性方面。与 亲本菌株M2-C38及P491P产生的纤维素酶混合物的纤维素酶活性相比， 在xyn2缺失的条件下过表达Xyr1使由经改造丝状真菌宿主P1194E、 P1194F和P1197B转化子产生的纤维素酶混合物中纤维素酶活性提高约2 倍。
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权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.用于生产纤维素酶混合物的发酵方法，所述方法包括：
a)提供过表达Xyr1转录因子或Xyr1等价转录因子的经改造丝状真 菌宿主，其中所述Xyr1转录因子包含SEQ ID NO：27氨基酸序列，所述 Xyr1等价转录因子包含与SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO： 28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、 SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35表现出约90％至约 99.9％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；以及
b)在包含碳源的培养基中培养步骤a)所述的经改造丝状真菌宿主 以产生纤维素酶混合物，其中所述碳源含有约60重量％至约100重量％ 的半纤维素来源之碳水化合物以及约0重量％至约3重量％的诱导纤维素 酶之碳水化合物，其中所述半纤维素来源之碳水化合物选自D-木糖、可 溶性低聚木糖、L-阿拉伯糖或其组合，所述诱导纤维素酶之碳水化合物选 自纤维素、槐糖、纤维二糖、乳糖、龙胆二糖或其组合；
其中，与在同样培养基中培养时不过表达Xyr1转录因子或Xyr1等 价转录因子的亲本丝状真菌产生的纤维素酶混合物相比，所述纤维素酶混 合物的纤维素酶活性至少提高到约1.7倍。
2.权利要求1的发酵方法，其中所述经改造丝状真菌宿主在一种或 多种半纤维素酶表达方面具有部分或完全地缺陷。
3.权利要求2的发酵方法，其中所述一种或多种半纤维素酶选自木 聚糖酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、β-甘露聚糖酶、α-葡糖醛酸 酶、乙酰木聚糖酯酶及其组合。
4.权利要求3的发酵方法，其中所述一种或多种半纤维素酶选自木 聚糖酶、β-木糖苷酶及其组合。
5.用于生产纤维素酶混合物的发酵方法，其包括：
a)遗传改造丝状真菌宿主，使其过表达Xyr1转录因子或Xyr1等价 转录因子，其中所述Xyr1转录因子包含SEQ ID NO：27氨基酸序列，所 述Xyr1等价转录因子包含与SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO： 32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35表现出约90％至 约99.9％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；以及
b)在包含碳源的培养基中培养步骤a)所述的丝状真菌宿主以产生 纤维素酶混合物，其中所述碳源含有约60重量％至约100重量％的半纤 维素来源之碳水化合物以及约0重量％至约3重量％的诱导纤维素酶之碳 水化合物，其中所述半纤维素来源之碳水化合物选自D-木糖、可溶性低 聚木糖、L-阿拉伯糖或其组合，所述诱导纤维素酶之碳水化合物选自纤维 素、槐糖、纤维二糖、乳糖、龙胆二糖或其组合；
其中，与在同样培养基中培养时不过表达Xyr1转录因子或Xyr1等 价转录因子的亲本丝状真菌产生的纤维素酶混合物相比，所述纤维素酶混 合物的纤维素酶活性至少提高到约1.7倍。
6.权利要求5的发酵方法，其中所述遗传改造步骤包括：
a)用Xyr1基因构建物转化所述丝状真菌宿主，在所述Xyr1基因构 建物中编码Xyr1转录因子或Xyr1等价转录因子的核酸序列与启动子核 酸序列有效连接；以及
b)从步骤a)的转化子中选出含有Xyr1基因构建物的转化子。
7.权利要求6的发酵方法，其中所述启动子核酸序列相对于丝状真 菌宿主来说是本源的或异源的。
8.权利要求6或7的发酵方法，其中所述启动子核酸序列源自这样 的基因，所述基因的表达在利用含有半纤维素来源之碳水化合物的碳源培 养丝状真菌宿主的过程中被诱导。
9.权利要求8的发酵方法，其中所述启动子核酸序列源于选自以下 的基因：里氏木霉(T.reesei)bxl1、里氏木霉xln1和里氏木霉xln2。
10.权利要求6的发酵方法，其中所述启动子核酸序列来自这样的基 因，所述基因在所述丝状真菌宿主生长过程中组成型表达。
11.权利要求5的发酵方法，其中所述遗传改造步骤还包括修饰所述 丝状真菌宿主中编码半纤维素酶的一种或多种基因，从而使所述丝状真菌 宿主在所述一种或多种半纤维素酶的表达方面部分或完全地缺陷，所述半 纤维素酶选自木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、β-甘露聚糖 酶、α-葡糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶及其组合。
12.权利要求11的发酵方法，其中所述一种或多种半纤维素酶选自 木聚糖酶和β-木糖苷酶。
13.权利要求1至12中任一项的发酵方法，其中所述方法产生含有 约40重量％至约100重量％纤维素酶组分的纤维素酶混合物。
14.权利要求1至13中任一项的发酵方法，其中，与使用不过表达 Xyr1或Xyr1等价转录因子之亲本丝状真菌的等价方法相比，所述方法的 特征在于其单位生产率(qp)提高到至少约两倍。
15.权利要求1至14中任一项的发酵方法，其中所述丝状真菌宿主 是木霉属(Trichoderma)、肉座菌属(Hypocrea)、曲霉菌属(Aspergillus)、 腐质霉属(Humicola)、镰刀菌属(Fusarium)、青霉菌属(Penicillium)、 脉孢菌属(Neurospora)、平革菌属(Phanerochaete)、伞菌属(Agaricus)、 毛壳菌属(Chaetomium)或稻瘟菌(Magnaporthe)的物种。
16.权利要求15的发酵方法，其中所述丝状真菌宿主是里氏木霉 (Trichoderma reesei)或红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)。
17.权利要求1至16中任一项的发酵方法，其中所述培养基包含一 种或多种额外的碳源。
18.权利要求17的发酵方法，其中所述一种或多种额外的碳源是甘 油、一种或多种糖醇、有机酸或其组合。
19.权利要求18的发酵方法，其中所述一种或多种糖醇是木糖醇。
20.权利要求1至19中任一项的发酵方法，其中所述培养步骤在约 20℃至约35℃温度下以及pH为约3.0至约6.5的条件下进行。
21.权利要求1至20中任一项的发酵方法，其中所述方法采用分批 补料方式或连续方式。
22.权利要求1至21中任一项的发酵方法，其中所述方法在有氧条 件下进行。
23.权利要求1至22中任一项的发酵方法，其中所述碳源包含0重 量％的诱导纤维素酶之碳水化合物。
24.用于生产纤维素酶混合物的发酵方法，所述方法包括：
a)提供过表达Xyr1转录因子或Xyr1等价转录因子的经改造丝状真 菌宿主，其中所述Xyr1转录因子包含SEQ ID NO：27氨基酸序列，所述 Xyr1等价转录因子包含与SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO： 28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、 SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35表现出约90％至约 99.9％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；以及
b)在包含碳源的培养基中培养步骤a)所述的经改造丝状真菌宿主 以产生纤维素酶混合物，其中所述碳源含有约25重量％至约100重量％ 木糖醇或阿拉伯糖醇、约0重量％的诱导纤维素酶之碳水化合物以及约0 重量％至约75重量％的葡萄糖、甘油或其组合，其中所述诱导纤维素酶 之碳水化合物选自纤维素、槐糖、纤维二糖、乳糖、龙胆二糖或其组合；
其中，与在同样培养基中培养时不过表达Xyr1转录因子或Xyr1等 价转录因子的亲本丝状真菌产生的纤维素酶混合物相比，所述纤维素酶混 合物的纤维素酶活性至少提高到约1.7倍。
25.权利要求24的发酵方法，其中所述碳源包含约0重量％至约25 重量％甘油和约0重量％至约50重量％葡萄糖。