《一种检测活细胞内核酸的探针及其应用方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种检测活细胞内核酸的探针及其应用方法.pdf（16页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102220431 A (43)申请公布日 2011.10.19 CN 102220431 A *CN102220431A* (21)申请号 201110128762.6 (22)申请日 2011.05.18 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 中国药科大学 地址 211198 江苏省南京市龙眠大道 639 号 (72)发明人 顾月清 薛建鹏 (74)专利代理机构 南京苏科专利代理有限责任 公司 32102 代理人 孙立冰 (54) 发明名称 一种检测活细胞内核酸的探针及其应用方法 (57) 摘要 本发明涉及纳米技术和生物技术领域， 特别 涉及一种检。
2、测活细胞内核酸的探针及其应用方 法。其特征是 ： 探针由含有与靶核酸互补的碱基 序列且具有茎 - 环结构的发夹形寡核苷酸、 荧光 标记物质和纳米金三部分构成， 其中， 荧光标记 物质共价连接在发夹形寡核苷酸的一端， 纳米金 颗粒与发夹形寡核苷酸另一端修饰的巯基配位连 接。本发明的方法可以简便地实时检测活细胞样 品中的靶核酸， 并可以对靶核酸进行空间定位， 以 实现实时原位检测， 且无需使用任何转染和跨膜 试剂或技术， 在疾病发病机制、 肿瘤早期诊断和治 疗及药物靶点的开发方面具有重要的意义和广泛 的应用前景。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 。
3、权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 5 页 附图 3 页 CN 102220440 A1/1 页 2 1. 一种检测活细胞样品中靶核酸的探针， 其特征是 ： 探针由含有与靶核酸互补的碱基 序列且具有茎 - 环结构的发夹形寡核苷酸、 荧光标记物质和纳米金三部分构成， 其中， 荧光 标记物质共价连接在发夹形寡核苷酸的一端， 纳米金颗粒与发夹形寡核苷酸另一端修饰的 巯基配位连接。 2. 权利要求 1 的探针， 其中发夹形寡核苷酸序列中茎区的长度为 5 个碱基对 ； 发夹形 寡核苷酸序列中环区的长度为 15 25 个碱基 ； 靶核酸的序列不少于 15 个碱基。 3. 权利要求 1 的探针， 其。
4、中巯基通过 5 100 个腺嘌呤或胸腺嘧啶为连接桥梁修饰在 发夹形寡核苷酸的一端。 4. 权利要求 1 的探针， 其中荧光标记物质选自 5- 羟基荧光素、 6- 羟基荧光素、 异硫氰 酸荧光素、 罗丹明、 Cy3、 Cy5 或 Cy5.5。 5. 权利要求 1 的探针， 其中与靶核酸杂交的环区的解链温度为 55以上。 6. 权利要求 1 的探针， 其中纳米金颗粒粒径为 10 30nm， 每个纳米金颗粒连接 15 50 条发夹形寡核苷酸。 7. 权利要求 1 中所述的探针的制备方法， 包括 ： 合成发夹形寡核苷酸， 一端标记荧光 物质， 另一端修饰巯基， 然后发夹形核苷酸通过巯基配位连接到纳米金。
5、颗粒表面， 在磷酸 盐缓冲液中荧光物质标记和巯基修饰的发夹形寡核苷酸与二硫苏糖醇按摩尔比 1 1 1 100 混合反应 30 60 分钟， 再用 3 10 倍体积的乙酸乙酯重复 3 5 次萃取出反应 中的二硫苏糖醇， 然后按摩尔比为 10 1 10000 1 将上述反应液滴加入纳米金溶液 中， 混匀， 反应 12 24 小时， 加入吐温 20 至终浓度 0.1， 随后逐渐滴加 2 5mol/L 氯化 钠溶液至终浓度为0.150.3mol/L， 之后反应1224小时， 离心弃去上清液， 用磷酸盐缓 冲液溶解沉淀， 再离心， 弃去上清液， 最后将沉淀即探针溶于磷酸盐缓冲液即得。 8. 权利要求 7。
6、 的制备方法， 发夹形寡核苷酸与二硫苏糖醇摩尔比为 1 10 ； 发夹形寡 核苷酸与纳米金颗粒摩尔比为 100 1 ； 反应液中氯化钠的终浓度为 0.15mol/L。 9. 一种检测活细胞样品中靶核酸的检测方法， 包括以下步骤 ： a. 待测活细胞样品培养 ； b. 权利要求 1 的探针与活细胞样品孵育 ； c. 使用激光共聚焦显微镜或荧光显微镜定性检测靶核酸或使用流式细胞仪相对定量 检测靶核酸。 10. 权利要求 9 的检测方法， 其中探针与活细胞样品孵育时， 探针浓度为 0.1 1000nM， 孵育时间为 1 72 小时， 孵育温度为 37， CO2浓度为 5。 权 利 要 求 书 CN 。
7、102220431 A CN 102220440 A1/6 页 3 一种检测活细胞内核酸的探针及其应用方法 技术领域 0001 本发明涉及纳米技术和生物技术领域， 特别涉及核酸杂交和检测技术。 背景技术 0002 核酸具有非常重要的生物功能， 主要是贮存遗传信息和传递遗传信息。原核生物 如微生物病原体大部分是细菌和病毒， 它们的细胞核无核膜包裹， DNA 或 RNA 裸露。细菌的 16S-23SrRNA 基因是位于 16S rRNA 基因与 23S rRNA 基因之间的区间序列， 具有较好的保 守性和相对的可变性， 被认为是细菌鉴定的合适部位， 而病毒的遗传物质为单一的 RNA 或 DNA， 。
8、结构简单。这些特点都有利于通过核酸检测方法对微生物病原体进行检测。再者， 生 命体内是以 mRNA 作为模板翻译蛋白的， 蛋白的信使核糖核酸 (Messenger RNA， mRNA) 是从 脱氧核糖核酸 (DNA) 转录合成的带有遗传信息的一类单链核糖核酸 (RNA)， 在核糖体上作 为蛋白质合成的模板， 决定肽链的氨基酸排列顺序。检测细胞内 mRNA 的水平可间接反映相 关蛋白的表达水平。因此， 活细胞内核酸检测技术可用于检测微生物病原体、 特异基因 ( 药 敏基因 ) 和功能蛋白的表达， 该技术在病原体检测、 药敏基因研究指导个体化用药、 疾病发 病机制及药物靶点开发中具有重要作用和意义。
9、。 0003 目前虽然已经有了几种成熟的检测核酸的技术， 如聚合酶链式反应 (polymerase chainreaction， PCR) 和原位杂交技术 (in situ hybridization， ISH)， 但这些技术操作繁 琐， 并需要对细胞裂解或固定， 不能进行活细胞的在位监测。 为了在分子水平上研究活细胞 内一些生化反应过程， 分子信标(molecular beacon)等活细胞成像探针也已成功用于细胞 内信使核糖核酸 (mRNA) 的实时成像。安瑞芳 ； 薛艳 ； 张永爱等使用分子信标技术可成功检 测宫颈癌细胞 survivin mRNA 的表达， 为宫颈癌的早期诊断提供了又一。
10、可能的手段。湖南 大学王柯敏课题组使用分子信标技术对肿瘤细胞 ING1 转录水平调控的定量检测以及基于 分子信标荧光增强速率检测活细胞内 p21 mRNA 表达。但这些分子信标技术需要一些特殊 的方法如电穿孔技术和跨膜转染试剂将探针转染至细胞内， 并且这些探针进入细胞后易被 酶解， 导致假阳性。 0004 寡核苷酸功能化的金纳米粒子作为一种新型的细胞探针突破了以往方法的限制， 不需要任何转染和跨膜试剂的辅助能直接进入活细胞而实现对 mRNA 的检测。这种探针荧 光背景较低， 并且不易被酶解破坏。目前 Mirkin 小组采用线形寡核苷酸修饰的金纳米粒子 探针成功地对活细胞内mRNA进行了实时成像。
11、， 但其探针与目的mRNA杂交后， 荧光染料被从 探针上释放下来， 荧光信号不能反映目的 mRNA 的位置， 进而不能对目标 mRNA 进行空间定 位。 0005 现在已有的专利CN1548551、 CN101603077和CN101812544所提供的探针和检测核 酸的方法比传统的方法有一定的改进， 但它们的探针及方法主要适用于检测溶液中的核酸 而不完全适用于活细胞样品， 特别是专利 CN101603077 主要适用于 PCR 检测技术中。专利 CN101384730 虽然提供了原位检测细胞或组织样品的探针及方法， 但需要用甲醛等有机试 剂对细胞固定和使用 Triton 试剂辅助， 操作繁琐。
12、。而专利 CN101245387 提供了一种高灵敏 说 明 书 CN 102220431 A CN 102220440 A2/6 页 4 度检测核酸的探针及方法， 但也局限于在溶液中检测， 而不适用于活细胞样品原位检测， 且 需要通过化学反应放大信号来提高灵敏度。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种活细胞中检测靶核酸的探针及其应用方法， 利用该探 针可以简便地实时检测活细胞样品中的靶核酸， 并可以对靶核酸进行空间定位， 以实现实 时原位检测， 且无需使用任何转染和跨膜试剂或技术。 0007 一种检测活细胞样品中靶核酸的探针， 其特征是 ： 探针由含有与靶核酸互补的碱 基序列且具有 “。
13、茎 - 环” 结构的发夹形寡核苷酸、 荧光标记物质和纳米金三部分构成， 其中， 荧光标记物质共价连接在发夹形寡核苷酸的一端， 纳米金颗粒与发夹形寡核苷酸另一端修 饰的巯基配位连接。 0008 其中发夹形寡核苷酸序列中茎区的长度优选为 5 个碱基对。 0009 其中发夹形寡核苷酸序列的环区探针序列长度优选为 15 25 个碱基。 0010 其中与靶核酸杂交的环区的解链温度 (Tm) 优选为 55以上。 0011 其中靶核酸的序列优选不少于 15 个碱基。 0012 其中巯基优选通过 5 100 个腺嘌呤 (A) 或胸腺嘧啶 (T) 为连接桥梁修饰在发夹 形寡核苷酸的一端。 0013 其中纳米金颗。
14、粒粒径优选为 10 30nm。 0014 探针中荧光物质优选自 5- 羟基荧光素、 6- 羟基荧光素、 异硫氰酸荧光素、 罗丹明、 Cy3、 Cy5 或 Cy5.5。 0015 本发明探针的制备方法 ： 合成发夹形寡核苷酸， 一端标记荧光物质， 另一端修饰巯 基， 然后发夹形核苷酸通过巯基配位连接到纳米金颗粒表面， 在磷酸盐缓冲液中荧光物质 标记和巯基修饰的发夹形寡核苷酸与二硫苏糖醇按摩尔比111100混合反应30 60 分钟， 再用 3 10 倍体积的乙酸乙酯重复 3 5 次萃取出反应中的二硫苏糖醇， 然后按 摩尔比为 10 1 10000 1 将上述反应液滴加入纳米金溶液中， 混匀， 反应。
15、 12 24 小 时， 加入吐温20至终浓度0.1， 随后逐渐滴加25mol/L氯化钠溶液至终浓度为0.15 0.3mol/L， 之后反应 12 24 小时， 离心弃去上清液， 用磷酸盐缓冲液溶解沉淀， 再离心， 弃 去上清液， 最后将沉淀即探针溶于磷酸盐缓冲液即得。 0016 发夹形寡核苷酸与二硫苏糖醇摩尔比优选为 1 10。 0017 发夹形寡核苷酸与纳米金颗粒摩尔比优选为 100 1。 0018 反应液中氯化钠的终浓度优选为 0.15mol/L。 0019 探针结构为每个纳米金颗粒连接 15 50 条发夹形寡核苷酸。 0020 本发明还公开了一种检测活细胞样品中靶核酸的的方法， 包括以下。
16、步骤 ： 0021 a. 待测活细胞样品培养 ； 0022 b. 本发明的探针与活细胞样品孵育 ； 0023 c. 使用激光共聚焦显微镜或荧光显微镜定性检测靶核酸或使用流式细胞仪相对 定量检测靶核酸。 0024 其中探针与活细胞样品孵育时， 探针浓度优选为 0.1 1000nM， 孵育时间优选为 1 72 小时， 孵育温度优选为 37， CO2浓度优选为 5。 说 明 书 CN 102220431 A CN 102220440 A3/6 页 5 0025 其中用于定性检测的活细胞样品优选培养在激光共聚焦显微镜专用培养皿中 ； 用 于相对定量检测的活细胞样品优选培养在细胞培养板中。 0026 其。
17、中使用激光共聚焦显微镜对活细胞样品进行定性检测时， 优选细胞与探针在激 光共聚焦显微镜细胞培养皿中孵育， 且以不含有或含有微量的靶核酸的活细胞样品为对 照。 0027 其中使用流式细胞仪对活细胞样品进行相对定量检测， 优选以不含有或含有微量 的靶核酸的活细胞样品为对照。 0028 本发明的探针能被细胞主动摄取且特异性好。 通过在金纳米表面偶联多个探针序 列可极大地增强检测灵敏度。 由于该探针的探针序列是发夹结构， 与目的序列杂交后， 荧光 染料不被释放， 故可以对目标核酸片段进行空间定位， 以实现活细胞内实时原位检测。 0029 本发明的探针可用于检测活细胞样品中具有靶序列的靶核酸。 所述靶核。
18、酸是具有 靶序列的单链核酸。本发明探针最好应用于特别是信使核糖核酸 (mRNA) 的检测。在本发 明优选模式中， 所述靶核酸是定性和相对定量检测的。 0030 所述靶序列通常是特异性针对所述靶核酸的序列， 所述靶序列在序列上并无具体 限制， 只要所述靶序列的长度不少于 15 碱基且可与探针形成特异性杂交即可， 所述探针具 有与所述靶序列互补的序列。 0031 含有所述靶核酸的活细胞样品并无具体限制， 它们包含各种正常组织细胞、 各种 肿瘤细胞和被病毒或细菌感染的细胞。 0032 在本发明中， 所述探针用荧光标记物质标记， 所述标记物质产生可以检测出探针 与靶核酸杂交反应发生的信号。 所述的荧光。
19、标记物质为能量供体， 金纳米粒子为能量受体， 它们分别连接在发夹形靶向序列的两端。 所述能量供体和能量受体包括例如荧光物质和猝 灭剂， 所述猝灭剂能猝灭荧光物质所产生的荧光。当所述的猝灭剂靠近荧光物质时猝灭荧 光， 但当荧光物质和猝灭剂之间的距离等于或大于某一距离时， 它将不再猝灭荧光。 本发明 中金纳米粒子为荧光标记物质的猝灭剂， 当探针没有与靶核酸杂交时， 荧光标记物质的荧 光被金纳米粒子猝灭， 而当探针与靶核酸杂交时， 荧光标记物质与金纳米粒子的距离等于 或大于某一距离， 荧光不再被猝灭。 因此测定荧光标记物质的荧光， 则可以测定杂交反应的 发生。 0033 在本发明中， 所述探针与活细。
20、胞样品孵育， 所述活细胞样品培养于细胞培养板 (6 孔 ) 或玻底皿 ( 激光共聚焦显微镜成像专用细胞培养皿 ) 中， 每孔培养 105 106个细胞， 加入含有探针的培养基， 培养基体积为2mL4mL， 探针浓度为0.11000nM， 优选是0.5 2nM。然后将探针与细胞在温度为 37， CO2浓度为 5下孵育 1 72 小时， 优选是 6 24 小时。同时设立对照组样品， 除培养基中不含有探针外， 其它操作和条件与上述相同。 0034 在本发明中， 所述探针与细胞孵育后， 分别进行如下实验 ： 0035 A) 移去培养基， 用磷酸盐缓冲液 (PBS， pH 7.4) 清洗培养皿 2 次，。
21、 再加入 1 2mLPBS， 使用激光共聚焦显微技术对细胞样品成像， 从而对活细胞样品中的靶核酸进行定 性检测。 0036 B) 移去培养基， 用胰蛋白酶 1mL 消化收集细胞， 使用流式细胞技术检测阳性组和 对照组细胞样品的荧光信号， 从而对活细胞样品中的靶核酸进行相对定量检测。 0037 与专利 CN1548551、 CN101603077 和 CN101812544 相比， 本发明的探针可简便地实 说 明 书 CN 102220431 A CN 102220440 A4/6 页 6 时原位定性和相对定量检测活细胞样品中的靶核酸 ； 与专利 CN101384730 相比， 本发明的 方法不。
22、需要使用任何转染和跨膜试剂或技术， 探针可被活细胞主动摄取进行检测 ； 本发明 的探针是每个纳米金颗粒连接有 15 50 条发夹形寡核苷酸， 则一个探针可以同时检测多 条靶核酸， 是一种高灵敏度检测核酸的探针。与专利 CN101245387 相比， 本发明的探针不仅 适用于活细胞样品实时原位检测， 而且不需要任何反应来放大信号便可以进行检测。本发 明提供一种活细胞中检测靶核酸的探针及方法， 利用该方法可以简便地实时检测活细胞样 品中的靶核酸， 并可以对靶核酸进行空间定位， 以实现实时原位检测， 且无需使用任何转染 和跨膜试剂或技术， 在疾病发病机制、 肿瘤早期诊断和治疗及药物靶点的开发方面具有。
23、重 要的意义和广泛的应用前景。 附图说明 0038 图 1 是实施例 1 中探针与目标序列杂交反应荧光光谱图 0039 图 2 是实施例 1 中探针在活细胞内的荧光照片 ： STAT5B mRNA 探针在鼠胶质瘤细 胞 C6( 不表达人的 STAT5B 的 mRNA) 中荧光成像 ( 左图 ) 和探针在人乳腺癌细胞 MCF-7 中 荧光成像 ( 右图 )。 0040 图3是实施例1中流式细胞仪检测活细胞内荧光信号强度 ： STAT5B mRNA探针在鼠 胶质瘤细胞 C6 的荧光信号 ( 上图 ) 和探针在人乳腺癌细胞 MCF-7 中的荧光信号 ( 下图 )。 0041 图 4 是实施例 2 中。
24、探针与目标序列杂交反应荧光光谱图 0042 图5是实施例2中探针活细胞内荧光照片 ： ERCC1mRNA探针在鼠胶质瘤细胞C6(不 表达人的 ERCC1 的 mRNA) 中荧光成像 ( 左图 ) 和探针在人结直肠癌细胞 HCT116 中荧光成 像 ( 右图 )。 0043 图 6 是实施例 2 中流式细胞仪检测活细胞内荧光信号强度 ： ERCC1mRNA 探针在鼠 胶质瘤细胞 C6 的荧光信号 ( 上图 ) 和探针在人结直肠癌细胞 HCT116 中的荧光信号 ( 下 图 )。 具体实施方式 0044 实施例 1 0045 信号转导子与转录激活子 5B(STAT5B) 与乳腺癌、 前列腺癌和白血。
25、病等多种疾病 有关， 因此检测 STAT5B 的 mRNA(SEQ ID NO ： 1) 表达有助于肿瘤的早期诊断的研究。 0046 探针的制备 ： 针对人的 STAT5B 的 mRNA 合成探针， 请生工生物 ( 上海 ) 有限公司合 成探针中的发夹形寡核苷酸(SEQ ID NO ： 2)和目标序列(SEQ ID NO ： 3)， 用FITC标记发夹 形靶向核酸的3端， 用巯基修饰5端。 在磷酸盐缓冲液(PBS， 0.02mol/L， pH8.0)中荧 光物质标记和巯基修饰的发夹形寡核苷酸与二硫苏糖醇 (DTT) 按摩尔比 1 10 混合反应 45 分钟， 再用 4 倍体积的乙酸乙酯重复 4。
26、 次萃取出反应中的 DTT。然后按摩尔比为 100 1 将上述反应液滴加入金纳米溶液中， 混匀， 反应 24 小时， 加入吐温 20 至终浓度 0.1， 随后 逐渐滴加 2mol/L 氯化钠溶液至终浓度为 0.15mol/L， 此过程需 6 小时， 之后反应 24 小时。 离心弃去上清液， 用 PBS(0.02mol/L， pH 7.4) 溶解沉淀， 再离心， 弃去上清液， 重复 2 3 次。最后将沉淀即探针溶于 PBS(0.02mol/L， pH 7.4) 中， 4保存备用。 0047 探针的核酸序列中碱基 6 25 与所述靶寡核苷酸碱基 251 270 互补， 碱基 1 说 明 书 CN 。
27、102220431 A CN 102220440 A5/6 页 7 5 与碱基 26 30 互补可形成双链茎区。 0048 探针的荧光表征 ： 1nM 的探针和 1M 的目标序列在含有 0.1吐温 20 的 PBS 缓冲 液中置于 70反应 30 分钟， 然后逐渐冷却至室温， 以缓冲液代替目标序列为对照， 使用荧 光分光光度计检测溶液荧光信号， 激发波长 450nm， 检测波长 520nm。加入目标序列后溶液 的荧光信号明显增强， 约是对照的3.2倍(图1)， 说明所需的探针已合成并且探针对目标序 列有特异性响应。 0049 探针用于活细胞样品检测 ： 本实例以不表达人的 STAT5B 的鼠的。
28、胶质瘤细胞 C6 为 对照组， 以人的乳腺癌细胞 MCF-7 为阳性组。将细胞培养在玻底皿中， 温度为 37， CO2浓 度为 5培养至约 105 106个细胞时移去培养基， 加入含有纳米探针的培养基 2mL 继续培 养 18 小时。移去培养基， 用磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 洗 2-3 次， 用激光共聚焦显微镜进行 成像， 激发光波长为488nm。 结果发现对照组细胞C6内荧光较弱， 而MCF-7中荧光信号明显 强于对照组， 表明探针与人的STAT5B的mRNA在细胞内发生杂交(见附图2)， 探针特异性检 测到活细胞内的 STAT5B 的 mRNA。 0050 将细胞培养在培养板 (6 。
29、孔 ) 中， 温度为 37， CO2浓度为 5培养至约 106个细胞 时移去培养液， 再加入含有纳米探针的培养基 2mL， 培养 12 小时。同时设立对照组样品， 除 培养基中不含有探针外， 其它操作和条件与上述相同。将培养基移去， 用磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)洗2-3次， 将细胞用胰蛋白酶消化后收集， 使用流式细胞仪进行检测， 激发光波长为 488nm， 检测波长 520 530nm。结果对照组细胞 C6 的荧光信号值是 37， MCF-7 细胞的荧光 信号值是 126， 约是对照组的 3.4 倍 ( 见附图 3)。 0051 实施例 2 0052 临床研究显示， ERCC1 阴性的患者。
30、使用顺铂药物后具有较好的疗效， 而 ERCC1 阳性 的患者则无明显效果， 所以 ERCC1 基因是一种药物敏感基因。因此检测 ERCC1 的表达可以 指导肿瘤治疗的临床用药。 0053 探针的制备 ： 针对ERCC1的mRNA(SEQ ID NO ： 4)合成探针， 请生工生物(上海)有 限公司合成探针中的发夹形寡核苷酸 (SEQ ID NO ： 5) 和目标序列 (SEQ ID NO ： 6)， 用 FITC 标记发夹形靶向核酸的 3端， 用巯基修饰 5端。在磷酸盐缓冲液 (PBS， 0.02mol/L， pH 8.0) 中荧光物质标记和巯基修饰的发夹形寡核苷酸与二硫苏糖醇 (DTT) 按。
31、摩尔比 1 10 混合反应 45 分钟， 再用 4 倍体积的乙酸乙酯重复 4 次萃取出反应中的 DTT。然后按摩尔比 为 100 1 将上述反应液滴加入金纳米溶液中， 混匀， 反应 24 小时， 加入吐温 20 至终浓度 0.1， 随后逐渐滴加2mol/L氯化钠溶液至终浓度为0.15mol/L， 此过程需6小时， 之后反应 24 小时。离心弃去上清液， 用 PBS(0.02mol/L， pH 7.4) 溶解沉淀， 再离心， 弃去上清液， 重复 2 3 次。最后将沉淀即探针溶于 PBS(0.02mol/L， pH 7.4) 中， 4保存备用。 0054 探针的核酸序列中碱基 6 25 与所述靶寡。
32、核苷酸碱基 577 596 互补， 探针的核 酸序列中碱基 1 5 与碱基 26 30 互补可形成双链茎区。 0055 探针的荧光表征 ： 1nM 的探针和 1M 的目标序列在含有 0.1吐温 20 的 PBS 缓冲 液中置于 70反应 30 分钟， 然后逐渐冷却至室温， 以缓冲液代替目标序列为对照， 使用荧 光分光光度计检测溶液荧光信号， 激发波长 450nm， 检测波长 520nm。加入目标序列后溶液 的荧光信号明显增强， 约是对照的5倍(图4)， 说明所需的探针已合成并且探针对目标序列 有特异性响应。 说 明 书 CN 102220431 A CN 102220440 A6/6 页 8 。
33、0056 探针应用于活细胞样品检测 ： 本实例以不表达人的ERCC1的鼠的胶质瘤细胞C6为 对照组， 以人的结直肠癌细胞 HCT116 为阳性组。将细胞培养在玻底皿中， 温度为 37， CO2 浓度为 5培养至约 105 106个细胞时移去培养基， 加入含有纳米探针的培养基 2mL 继续 培养 18 小时。移去培养基， 用磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 洗 2-3 次， 用激光共聚焦显微镜进 行成像， 激发光波长为 488nm。结果 HCT116 细胞内的荧光强度明显高于 C6 细胞中的， 表明 探针特异性检测到了 HCT116 中的 ERCC1 的 mRNA( 见附图 5)。 0057 将细。
34、胞培养在培养板 (6 孔 ) 中， 温度为 37， CO2浓度为 5培养至约 106个细胞 时移去培养液， 再加入含有纳米探针的培养基 2mL， 培养 12 小时。同时设立对照组样品， 除 培养基中不含有探针外， 其它操作和条件与上述相同。将培养基移去， 用磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 洗 2-3 次， 将细胞用胰蛋白酶消化后收集， 使用流式细胞仪进行检测， 激发光波长 为 488nm， 检测波长 520 530nm。结果 C6 细胞的荧光信号是 34， 而 HCT116 的荧光信号是 106， 约是 C6 的 3.1 倍 ( 见附图 6)。 说 明 书 CN 102220431 A CN 。
35、102220440 A1/5 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 102220431 A CN 102220440 A2/5 页 10 0003 序 列 表 CN 102220431 A CN 102220440 A3/5 页 11 0004 序 列 表 CN 102220431 A CN 102220440 A4/5 页 12 0005 序 列 表 CN 102220431 A CN 102220440 A5/5 页 13 序 列 表 CN 102220431 A CN 102220440 A1/3 页 14 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102220431 A CN 102220440 A2/3 页 15 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102220431 A CN 102220440 A3/3 页 16 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102220431 A 。