技术领域
本发明涉及PCR检测领域，尤其涉及PCR病毒检测领域。
背景技术
人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）是一种嗜上皮性病毒，有高 度的特异性，定向感染人体皮肤及粘膜的复层鳞状上皮。HPV可以通过多种途径 感染生殖道，从而导致尖锐湿疣以及宫颈病变，甚至可能引起宫颈癌的发生。 2003年发表的研究结果认为与宫颈癌密切相关的基因型有15种，即HPV16、18、 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82，及三种可能的致癌 型HPV26、53、66。2004年发布的HPV handbook中国际上公认的导致宫颈癌的 HPV高危型有18种，分别为HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、 53、56、58、59、66、68、73、82。从高危型HPV的持续感染到一般的宫颈癌 前病变并最终发展为宫颈癌大约需要5-10年。因此，有针对性地对此18种高 危型HPV进行全面检测，对于宫颈癌的早期诊断和治疗具有重要的意义。
目前常见的HPV检测方法有荧光定量PCR法、杂交捕获法、PCR-反向点杂 交法、流式荧光杂交法即液态芯片法、表面等离子谐振法（SPR）等；生产厂家 主要有QIAGEN、亚能生物技术（深圳）有限公司、港龙生物技术（深圳）有限 公司、凯普生物科技有限公司、上海透景生命科技有限公司、中山大学达安基 因股份有限公司等。国内临床常用的方法为PCR-反向点杂交法、荧光定量PCR 法和杂交捕获法。
现有荧光定量PCR法产品虽然检测时间短，成本低，但其存在以下缺点：
1、现有荧光定量PCR检测试剂多数检测基因型少，大部分为13种或者以 下高危型。仅广州锐达生物科技有限公司为14种高危型（HPV16、18、31、33、 35、39、45、51、52、56、58、59、67、68），且分3管检测，港龙《诊断人类 乳头状病毒（HPV）感染的荧光聚合酶链式反应（PCR）的方法和试剂盒》专利 中检测18种高危型HPV（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、 59、66、67、68、69、73、82）其中HPV67、69不在国际公认18种高危型范围 内，国际公认的HPV26、53其并不在其检测范围；现有荧光定量PCR类专利中， 均无对HPV26、53两个基因型检测的报道，而HPV26、53已经有大量研究表明 其和宫颈癌相关，因此增加HPV26、53检测对临床宫颈癌的筛查有极其重要的 意义。
2、现有荧光定量PCR专利中，未见对国际上公认的导致宫颈癌的18种HPV 高危型（HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、 68、73、82）同时进行检测。
3、现有荧光定量PCR检测试剂仅上海多美纳企业发展有限公司和何以丰专 利中有内标（Internal Control，IC），而其他荧光定量PCR类专利大部分均无 内标，无法实现对实验整个过程的全面控制，无法保证实验是否成功，会导致 假阴性的误判；
4、现有荧光定量PCR法对某些低危型HPV如HPV6、11、81等存在交叉反 应，有假阳性。
而杂交捕获法的缺点是：无内标、检测时间长（DNA分解45min、DNA-RNA 杂交60min、抗体捕获60min、化学发光30min、计算机判读15min一次实验一 般要5-6小时）、灵敏度低（3.5×105copies/mL）、操作复杂、检测基因型少（13 种高危型）且需要特定昂贵的仪器，成本高，和其检测外的高危型和低危型如 HPV6、11、40、42、53、54、55、66、MM4、MM7、MM8、MM9等存在交叉反应， 会出现假阳性结果。
此外，PCR-反向点杂交法、液态芯片法、表面等离子谐振法虽然能对HPV 具体分型，且检测基因型相对多，但其需经过HPV DNA提取（30min）、PCR扩增 （2h以上）、产物杂交分析（1h以上）等步骤，缺点是检测时间长（4h以上）、 成本高、检测灵敏度低（104copies/mL）、操作复杂、不能满足临床宫颈癌大量 筛查的需求，因此有必要研发检测时间短、成本低且适合对宫颈癌进行早期筛 查的产品。
申请人之前申请了专利《人乳头瘤病毒分型基因芯片检测系统》，此专利 PCR+反向点杂交法不属于荧光PCR法。
此外与本发明相关的已经公开或者有权的专利和相关统计对比如下（具体 文件详见说明书末尾的参考文献）：
所以，现有技术中不分型产品如杂交捕获法和荧光定量PCR法检测基因型 少、且都不包含已经证明的和宫颈癌有密切关系的高危型HPV26、53，且大部分 荧光定量PCR法无内标，杂交捕获方法无法对HPV拷贝数进行定量；HPV分型类 产品如PCR-反向点杂交法、液态芯片法、表面等离子谐振法检测时间长、成本 高、灵敏度低、无法对HPV拷贝数进行定量、且需特殊仪器；二者均不能同时 满足宫颈癌临床大量筛查所必须的快速、低成本、检测范围广的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能一次检测国际公认和宫颈癌密切相关的18种 高危型HPV即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、 66、68、73、82的PCR组，以及基于该PCR组的人乳头瘤病毒PCR检测方法以 及含有该PCR组的人乳头瘤病毒检测试剂盒。
为解决第一个技术问题，本发明提供了包括下列引物组的PCR组：
（1）序列为GAAAATTGGAAATCCTTTT的引物（序列表SEQ ID NO:1所示）和 序列为GTTTTCCTTGTCCTCTTC的引物（序列表SEQ I NO:2所示）组成的引物组；
（2）序列为AAGAACTGGAAATCCTTTT的引物（序列表SEQ ID NO:3所示）和 序列GTTTTCCTTGTCCTCGTCCT的引物（序列表SEQ ID NO:4所示）组成的引物组；
（3）序列为AAAAACTGGAAATCCTTTT的引物（序列表SEQ ID NO:5所示）和 序列为CCTCTTCCTCGTGCAAATTT的引物（序列表SEQ ID NO:6所示）组成的引物 组；
（4）序列为AGGGTCGGATATGGTAGA的引物（序列表SEQ ID NO:7所示）和 序列为AACAATGCCTGTGCTGTCT的引物（序列表SEQ ID NO:8所示）组成的引物 组；
（5）序列为CAAGGACGTGGTCCAGAT的引物（序列表SEQ ID NO:9所示）和 序列为CGTCTCCATTGTTTTCTTTG的引物（序列表SEQID NO:10所示）组成的引 物组；
（6）序列为GAAAGGACATGGTCCAGATT的引物（序列表SEQ ID NO:11所示） 和序列为TGGCACGCATCTAAACG的引物（序列表SEQ ID NO:12所示）组成的引物 组；
（7）序列为GTAGATAAACAAACAGGTGACA的引物（序列表SEQ ID NO:13所示） 和序列为TCTCACGCTCTGCCTGTA的引物（序列表SEQ ID NO:14所示）组成的引 物组；
（8）序列为GTAGATAAACAAACAGGCGACA的引物（序列表SEQ ID NO:15所示） 和序列为TCTCGCGCTCTGCCTGTA的引物（序列表SEQ ID NO:16所示）组成的引 物组；
（9）序列为AGATTAGATTTGGAGGAGGA的引物（序列表SEQ ID NO:17所示） 和序列为CTAGTATTTTCTCCTGGCAC的引物（序列表SEQ ID NO:18所示）组成的 引物组；
（10）序列为AATGAAAACTGGAAAGCATTT的引物（序列表SEQ ID NO:19所示） 和序列为CATTTTCCTTGTCGTCGTCCT的引物（序列表SEQ ID NO:20所示）组成的 引物组。
一对上游引物与下游引物称为引物组；由一系列引物组构成的集合称为PCR 组。
为解决第二个技术问题，本发明提供一种人乳头瘤病毒PCR检测方法，所 述方法包括通过使用本发明所述的引物组进行PCR扩增核酸样品。
为解决第三个技术问题，本发明提供一种基于本发明所述PCR组的人乳头 瘤病毒检测试剂盒。
使用上述PCR组以及基于该PCR组开发的试剂盒与检测方法可以在PCR检 测中一次性检测18种高危型HPV，检测时间短、扩增效率及灵敏度高、成本低、 操作方便。
作为本发明所述方法的改进，在PCR扩增时同时使用以下探针：
（1）FAM-TTTTCTCAAGGACGTGG-MGB（序列表SEQ ID NO:21所示）；
（2）FAM-CTCTGCCTGTTCACAAA-MGB（序列表SEQ ID NO:22所示）；
（3）FAM-TTGGATAACGACGAGGAC-MGB（序列表SEQ ID NO:23所示）；
（4）FAM-TTGGATAACGACGAAGAC-MGB（序列表SEQ ID NO:24所示）；
（5）FAM-AACAGATACAGGTTCAGAC-MGB（序列表SEQ ID NO:25所示）；
（6）FAM-GGACAAAGAAAATGGAGA-MGB（序列表SEQ ID NO:26所示）；
（7）FAM-ACAAAAACGTGGTCAAAAC-MGB（序列表SEQ ID NO:27所示）。
作为本发明所述方法的改进，所述PCR是两步法PCR，包括90～97℃下5～ 30s的变性步骤和50～65℃下30～90s的退火及延伸步骤，反复进行35～45个 循环。
作为本发明所述方法的改进，所述PCR的体系采用含尿嘧啶体系，在PCR 反应体系中IC引物、探针的终浓度选择50nM～500nM，MgCl2终浓度选择1.5mM～ 9mM，dNTP终浓度选择100nM～300nM，Taq酶终浓度选择1～7.5IU/反应，UNG 选择0.05～0.3IU/反应，ROX选择0.1～0.6μL/反应，在开始第一次变性步骤前， 进行以下步骤：
步骤1.反应体系在50℃下保温1min～10min；
步骤2.反应体系在90-95℃下保温10min；
所述变性步骤的温度为95℃，变性步骤和退火及延伸步骤的循环次数为40 次。
作为本发明所述试剂盒的改进，PCR反应液中还含有以下探针：
（1）FAM-TTTTCTCAAGGACGTGG-MGB（序列表SEQ ID NO:21所示）；
（2）FAM-CTCTGCCTGTTCACAAA-MGB（序列表SEQ ID NO:22所示）；
（3）FAM-TTGGATAACGACGAGGAC-MGB（序列表SEQ ID NO:23所示）；
（4）FAM-TTGGATAACGACGAAGAC-MGB（序列表SEQ ID NO:24所示）；
（5）FAM-AACAGATACAGGTTCAGAC-MGB（序列表SEQ ID NO:25所示）；
（6）FAM-GGACAAAGAAAATGGAGA-MGB（序列表SEQ ID NO:26所示）；
（7）FAM-ACAAAAACGTGGTCAAAAC-MGB（序列表SEQ ID NO:27所示）。
作为本发明所述试剂盒的改进，PCR反应液中还含有人类看家基因引物组：
5’-CCAGATAGTGCGGGTATAGA-3’（序列表SEQ ID NO:28所示）与
5’-CTTCGTGCTTGTGATGTCTT-3’（序列表SEQ ID NO:29所示）
和探针：5’HEX-AACCAACCAGATGTGTTC-MGB 3’（序列表SEQ ID NO:30所 示）。
作为本发明所述试剂盒的改进，所述试剂盒除PCR反应液外还包括：
a.样本处理试剂HPV DNA提取液；
b.定量参考品1（1×107copie/mL）；
c.定量参考品2（1×106copie/mL）；
d.定量参考品3（1×105copie/mL）；
e.定量参考品4（1×104copie/mL）；
f.定量参考品5（1×103copie/mL）；
以及作为对比的:
g.HPV阴性样品与；
f.HPV阳性样品。
附图说明
图1HPV16重组质粒梯度稀释荧光PCR扩增曲线
曲线由左到右对应的起样本拷贝数分别为1×107copies/mL，1× 106copies/mL，1×105copies/mL，1×104copies/mL，1×103copies/mL；
图2HPV16重组质粒标准浓度梯度稀释的标准曲线
R2为0.9987，说明线性关系非常好；斜率为-3.38，PCR扩增效率为98%（理 想情况下斜率为-3.32，PCR效率为100%）；
图3本试剂盒检测宫颈脱落细胞样本荧光PCR曲线
区域A的曲线为HPV荧光PCR扩增曲线，区域B的曲线为人基因组beta actin PCR扩增曲线。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合 实施方式详予说明。
在以下实施例中，使用的器材包括：
ABI Prism 7300/7500/7700/5700/7000/7900，MJ Opticon Monitor，宏石 SLAN等荧光PCR扩增检测仪。
本实施例中提供了一种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒，可以对高危 型人乳头瘤病毒（HPV）的感染情况进行定性检测，可检测18种高危型HPV，分 别为HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、 73、82。可用于临床HPV感染的辅助诊断和宫颈癌的早期筛查。
试剂盒主要组成成份：
其中核酸扩增剂及HPV PCR反应液，PCR反应液中含有PCR组、人类看家基 因引物组以及探针。
所述PCR组包括下列（1）～（10）的引物组：
（1）序列为GAAAATTGGAAATCCTTTT的引物（序列表SEQ ID NO:1所示）和 序列为GTTTTCCTTGTCCTCTTC的引物（序列表SEQ ID NO:2所示）组成的引物组；
（2）序列为AAGAACTGGAAATCCTTTT的引物（序列表SEQ ID NO:3所示）和 序列GTTTTCCTTGTCCTCGTCCT的引物（序列表SEQ ID NO:4所示）组成的引物组；
（3）序列为AAAAACTGGAAATCCTTTT的引物（序列表SEQ ID NO:5所示）和 序列为CCTCTTCCTCGTGCAAATTT的引物（序列表SEQ ID NO:6所示）组成的引物 组；
（4）序列为AGGGTCGGATATGGTAGA的引物（序列表SEQ ID NO:7所示）和 序列为AACAATGCCTGTGCTGTCT的引物（序列表SEQ ID NO:8所示）组成的引物 组；
（5）序列为CAAGGACGTGGTCCAGAT的引物（序列表SEQ ID NO:9所示）和 序列为CGTCTCCATTGTTTTCTTTG的引物（序列表SEQ ID NO:10所示）组成的引 物组；
（6）序列为GAAAGGACATGGTCCAGATT的引物（序列表SEQ ID NO:11所示） 和序列为TGGCACGCATCTAAACG的引物（序列表SEQ ID NO:12所示）组成的引物 组；
（7）序列为GTAGATAAACAAACAGGTGACA的引物（序列表SEQ ID NO:13所示） 和序列为TCTCACGCTCTGCCTGTA的引物（序列表SEQ ID NO:14所示）组成的引 物组；
（8）序列为GTAGATAAACAAACAGGCGACA的引物（序列表SEQ ID NO:15所示） 和序列为TCTCGCGCTCTGCCTGTA的引物（序列表SEQ ID NO:16所示）组成的引 物组；
（9）序列为AGATTAGATTTGGAGGAGGA的引物（序列表SEQ ID NO:17所示） 和序列为CTAGTATTTTCTCCTGGCAC的引物（序列表SEQ ID NO:18所示）组成的 引物组；
（10）序列为AATGAAAACTGGAAAGCATTT的引物（序列表SEQ ID NO:19所示） 和序列为CATTTTCCTTGTCGTCGTCCT的引物（序列表SEQ ID NO:20所示）组成的 引物组。
人类看家基因引物组包括：
（11）5’-CCAGATAGTGCGGGTATAGA-3’（序列表SEQ ID NO:28所示）与
5’-CTTCGTGCTTGTGATGTCTT-3’（序列表SEQ ID NO:29所示）
还含有以下探针：
（1）FAM-TTTTCTCAAGGACGTGG-MGB（序列表SEQ ID NO:21所示）；
（2）FAM-CTCTGCCTGTTCACAAA-MGB（序列表SEQ ID NO:22所示）；
（3）FAM-TTGGATAACGACGAGGAC-MGB（序列表SEQ ID NO:23所示）；
（4）FAM-TTGGATAACGACGAAGAC-MGB（序列表SEQ ID NO:24所示）；
（5）FAM-AACAGATACAGGTTCAGAC-MGB（序列表SEQ ID NO:25所示）；
（6）FAM-GGACAAAGAAAATGGAGA-MGB（序列表SEQ ID NO:26所示）；
（7）FAM-ACAAAAACGTGGTCAAAAC-MGB（序列表SEQ ID NO:27所示）。
（8）5’HEX-AACCAACCAGATGTGTTC-MGB 3’。
其中探针（1）～（7）用于检测HPV，探针（8）用于检测人类看家基因。
本实施例根据HPV的基因特点，设计特异的PCR引物和探针，HPV探针5’ 端标记报告荧光基团（R）FAM，探针3’端标记MGB；同时设计人基因组beta-actin 基因（IC）引物和探针，人基因组beta-actin基因探针5’端标记报告荧光基 团（R）HEX，探针3’端标记MGB。
本试剂盒采用多重PCR荧光检测法，能在同一PCR反应中检测宫颈脱落细胞 中的18种高危型HPV（HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、 58、59、66、68、73、82）和人基因组beta-actin基因。
储存条件：试剂盒避光储存于-20℃。
有效期为6个月。
以下实施例使用上述实施例的试剂盒与其他引物组及探针做对比试验。
一、样品准备过程如下：
1.检查前准备
月经正常妇女，在月经来潮后10～18天为最佳检查时间；
检查前三天内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用药物；
检查前24小时内不应有性行为；
检查前不进行醋酸或碘液涂抹。
2.采样方法
以专用宫颈脱落细胞采集器进行采样。
医护人员先以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈，用棉拭子将宫颈口过多的分泌 物擦去。取出宫颈刷置于宫颈口，单方向旋转4-5周以获得足量的上皮细胞样 本，然后将宫颈刷头部放入洗脱管中，沿刷柄折痕处将宫颈刷柄折断，旋紧洗 脱管盖，做好样本标识，并保持洗脱管直立放置。
3.标本保存
标本一经采集，应尽快送检；标本室温保存不超过12小时，2-8℃保存不超 过7天，-20℃保存不超过3个月。避免反复冻融。
4.标本运输
冰壶或泡沫箱加冰袋密封运输，在途时限不宜超过48小时。
二、检验方法
1.HPV DNA的提取
充分洗脱宫颈刷，并在管壁上挤干。取细胞保存液1mL转移到1.5mL离心管 中，13000rpm离心10分钟，弃去上清液，保留管底的细胞沉淀。
准备2个离心管，分别加入阴性质控品和阳性质控品各5μL。
分别向上述样本和阴性质控品、阳性质控品中加入50μL HPV DNA提取液（裂 解液）震荡混匀，沸水浴加热10分钟。13000r pm离心10分钟，保留上清液待 用。
2.扩增试剂准备
从试剂盒中取出核酸扩增试剂置于室温融化并振荡混匀，2000rpm离心 10sec。
设所需要的PCR反应管管数为n，n=待检样本数+1管阴性质控品+1管阳性质 控品；将PCR反应液以23μL/管分装n管。
3.加样
向各PCR反应管中分别加入待检样本DNA、阴性质控品DNA和阳性质控品DNA、 各定量参考品DNA各2μL，盖紧管盖。短暂离心后置于荧光PCR检测仪中并记录 样本摆放顺序。
4.PCR扩增
结果分析条件设定
基线（baseline）设置：一般情况下设置为6～15个循环。
阈值（threshold）设置：分别对HPV和I C设计阈值，HPV一般为0.05～0.2， IC一般为0.02～0.1，原则是确保阈值线超过阴性质控品扩增曲线的最高点。
质控标准
三、检验结果的解释
根据设置的基线和阈值，仪器自动显示检测Ct值。根据Ct值即可进行结 果判断，按照下表报告检测结果。
图1、2给出了上述试剂盒对标准品的检测结果。
本实施例一次检测18种高危型HPV且实验有内标，检测时间短、成本低、 操作方便的技术方案如下：
本实验利用Taq Man探针中Taq Man MGB探针。Taq Man探针的5′端标记 有报告基团(Reporter,R)，如FAM、HEX等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等，当探针完整时，两者可发生荧光共振能量传递（FRET），检测 不到荧光信号。当PCR扩增时，由于Taq酶的5′外切酶活性将探针水解，使 荧光分子与淬灭分子间距增大，从而破坏其FRET，则荧光监测系统能检测到荧 光信号。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团（Non-Fluorescent Quencher）， 本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB （Minor Groove Binder）修饰基团，可以将探针的Tm值提高10°C左右。因 此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，且特异 性高于普通的Taq Man探针，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大 为提高。
现有荧光定量PCR法检测HPV均为单荧光或者多荧光标记探针对HPV进行 检测，本方法将采用两种标记探针，一种用FAM标记HPV探针，用于检测HPV， 一种用HEX标记人类看家基因beta-actin探针（内标IC），用于检测人基因组 DNA，从而监控实验是否成功。利用多重PCR在同一管中同时检测HPV和人类看 家基因beta-actin，实现了一次检测18种高危型HPV且又有内标的目的，同时 本试剂也实现了操作方便、成本低、检测时间短的目的。适合对宫颈癌进行早 期筛查的需求。
一般PCR仅采用一对引物，而本发明采用多重PCR法（multiplex PCR）即 多重核酸扩增法，同一PCR反应体系中含有两对以上引物对多个靶序列进行PCR 检测。多重PCR有优势也有劣势，优势为：多重PCR具有高效性、经济简便性 等特点，可以在同一反应管内同时检出多种高危型HPV，可大大节省时间和成本， 更能满足临床的要求；劣势为：多重PCR往往因为引物过多，引物之间发生相 互反应，影响彼此的扩增效率。因此，在设计引物和探针的时候要格外注意应 该避免引物与引物之间、引物与探针之间和探针与探针之间的的交叉反应，尽 量做到引物和探针越短越好、越少越好，相互之间无交叉反应，此劣势也为设 计上的一大难点。本发明采用Taq Man MGB探针，在退火温度不变的情况下可 减少探针长度，从而降低和引物及其他探针交叉反应的几率，提高扩增效率， 提高产品的灵敏度。
本发明对18种高危型HPV基因序列进行大量比对分析，寻找能检测多种基 因型的保守序列作为本发明的引物和探针，在检测18种HPV基因型的前提下， 尽量减少总的引物和探针的数量，一方面提高扩增效率，另一方面降低成本， 且通过分析尽量满足各个序列之间无交叉反应。在进行反应体系优化时，为满 足各个基因型扩增效率一致，需对各引物和探针浓度、反应体系中各个组分浓 度进行调整，以获得最佳的扩增效率。本发明确定了检测阶段最优的引物、探 针组合，以及反应体系中各个组分最优的浓度。
四、HPV引物、探针和I C引物探针对比试验
使用的各组HPV引物和探针如下（其中A组为本发明所述PCR组与探针）：
表1 HPV引物和探针序列
在检测18种高危型的基础上，增加检测人类看家基因be ta-ac t in作为实 验的内标，监控实验的成败，防止假阴性的漏检，更加能满足临床宫颈癌筛查 的需求。
本实施例中人类看家基因beta-actin引物和探针设计
设计beta-actin引物和探针如下：
上游引物ICF：5’-CCAGATAGTGCGGGTATAGA-3’
下游引物ICR：5’-CTTCGTGCTTGTGATGTCTT-3’
探针I CP：5’HEX-AACCAACCAGATGTGTTC-MGB 3’
HPV引物、探针和I C引物探针对比试验的结果表明：同一管中既扩增HPV DNA 又扩增人基因组beta-act in基因，通过大量实验对比HPV A、B、C组引物和探 针，实验结果证明引物和探针序列左右平移或长度改变，实验结果均有很大不 同。引物、探针太长会有非特异扩增信号，太短则扩增效率比较低，检测灵敏 度下降。最终实验结果显示HPV A组引物、探针和IC引物、探针组合扩增效率 最好。因此本试剂盒HPV PCR反应液中HPV引物和探针选择A组，即10对引物、 7条探针，可高效特异检测18种高危型HPV；1对IC引物、1条探针检测人基 因组beta-actin基因，监控实验的成败。
最终结果表明A组同一管中共11对引物8条探针可一次检测18种高危型 HPV和人基因组beta-actin基因。此11对引物和8条探针是通过大量实验对比 筛选得到，此引物和探针长度或位置的改变均会降低本试剂盒的灵敏度、特异 性和重复性。
五、HPV引物、探针，IC引物、探针浓度以及反应体系其他组分浓度确定
HPV和IC引物、探针终浓度选择50nM～500nM，MgCl2终浓度选择1.5mM～9 mM，dNTP终浓度选择100nM～300nM，Taq酶终浓度选择1～7.5IU/反应，UNG 选择0.05～0.3IU/反应，ROX选择0.1～0.6μL/反应，
优选数值为：HPV和IC引物、探针终浓度选择80nM～240nM，MgCl2终浓度选择 4mM～6mM，dNTP终浓度选择150nM～250nM，Taq酶终浓度选择2～3IU/反应， UNG选择0.05～0.15IU/反应，ROX选择0.2～0.4μL/反应，
最终，本发明确立的最优的PCR反应体系见表2。
表2 PCR反应液配方
注：DNA加样量为2μL，总反应体积为25μL。
六、HPV反应条件的确定
本试剂采用含U（尿嘧啶）体系，UNG可以消除产物带来的污染。HPV反应 条件分以下步骤优化：
50℃：1min～10min（UNG作用时间）
90～95℃：10min（灭活UNG，热启动激活Taq酶活性）
优选反应条件为：
50℃：1～3min
94～95℃：10min
经过大量实验对比优化，最终确定的最佳反应条件为：
50℃：2min
95℃：10min
退火温度和退火时间对PCR扩增效率和特异性扩增影响较大，上述条件优化 结果显示退火温度偏低会其他HPV基因型有非特异性扩增信号导致假阳性结果、 温度偏高扩增效率偏低，灵敏度下降。本实验通过控制退火温度和退火时间可 以做到对其他HPV基因型无非特异性扩增信号，特异性好，扩增效率高，灵敏 度可达103copie/mL。
检测HPV总反应时间约为65min，和其他同类试剂相比时间大大缩短。
克隆含检测目标的扩增目的片段，构建含有目的片段的重组质粒作为标准 品。使用Promega pGEM-T easy vector system连接试剂盒，将经过纯化的18 种高危型HPV各目的PCR产物连接到pGEM-T easy载体上，然后转化进入大肠 杆菌JM109感受态细胞中，构建18种HPV阳性标准品，标准品经测序进行验证。 对阳性标准品测定浓度，梯度稀释至107、106、105、104、103copies/mL，制备 标准曲线；通过测定检测样本的Ct值，根据标准曲线计算对应的HPV的含量， 从而实现了对HPV进行检测和定量的目的。
七、使用本发明试剂盒检测临床样本中HPV感染情况
利用本试剂盒检测临床有病变样本200例，所有样本均采用金标准测序法 进行测序验证，检测结果见表4，统计分析对比结果见表5。
表4使用本发明试剂盒检测临床样本中HPV感染情况
表5本发明试剂盒检测结果和测序结果对比
注：测序结果中阳性是指本发明试剂盒检测范围内基因型阳性，阴性是指 本发明试剂盒检测范围之外的其他基因型样本阳性或者阴性。
图3中摘录了部分表5中实验的数据结果。
本发明试剂盒检测200例临床样本和金标准测序结果对比，漏检1例，准确 性为99.5%；对非本试剂盒检测范围的其他HPV基因型阳性（HPV6、11、30、42、 43、44、81）和阴性样本，本试剂盒检测结果均为阴性，阴性符合率为100%， 特异性为100%。
本发明试剂盒检测200例临床样本结果和金标准测序结果对比分析统计，见 表6。
表6 200例临床样本中各基因型测序结果和本试剂盒检测结果符合情况统计
从上表可以看到200例有病变样本各HPV基因型感染情况，本试剂盒检测范 围内的18种高危型HPV均有存在，且本试剂盒检测准确性和特异性均在98%以 上，说明仅检测13种或者更少基因型是不能满足临床宫颈癌筛查需求的，检测 本试剂盒包含的18种高危型HPV是有必要的。
另外本试剂盒检测其他专利未见报道的HPV26阳性7例、HPV53阳性6例， 说明HPV26、53在有病变的样本中是存在的，更进一步验证了检测HPV26、53 的必要性。本试剂盒检测国际公认的18种高危型HPV，能满足临床宫颈癌筛查 的需求。
本实施例产品的性能指标：
1.灵敏度：本品能稳定检出的人乳头瘤病毒（HPV）的病原体最小拷贝数 为1.0×103copies/mL；
2.准确性：本品检测HPV病原体的准确性达98％以上（100例阳性样本， 检测结果准确性100%）；
3.特异性：本品检测HPV病原体的特异性达98％以上（8例其他病原体 感染样本，8例其他基因型感染样本，重复检测结果均为阴性）；
4.重复性：本品检测HPV各基因型的重复性为98％以上（8例弱阳性及 其混合样本，实验内、实验间、日间、人员间各重复3次结果全部一致，且CV 值（HPV阳性Ct值变异系数）均小于5%）；
5.稳定性：本品在有效期内使用完全可满足以上各指标。
本发明中涉及到的术语解释如下：
荧光定量PCR法：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光 探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光 基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时,探 针结合在DNA任一一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性 将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可 接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光 信号的累积与PCR产物形成完全同步。
IC：Internal Control内标，在同一反应管中与靶序列共同扩增的一段非 靶序列分子，目的是鉴别仪器故障、试剂因素、聚合酶活性因素、样本提取因 素或样本中存在抑制物等造成的结果不理想的原因。本发明中是检测人基因组 DNA，实现对实验的整体控制，起到内标的作用。
HPV：Human papillomavirus人乳头瘤病毒
PCR：Polymerase Chain Reaction聚合酶链式反应
本发明的参考文献如下：
1.de Villiers E.M.,Fauquet C.,Broker T.R.,Bernard H.U.,zur H.H.. Classification of papillomaviruses.Virology 2004;324:1727.
2．Walter Prendiville,Philip Davies.The health professional’s HPV handbook 1:human papillomavirus and cervical cancer.Taylor&Francis GROUP 2004;1-94.
3.Munoz N.,Bo sch FX.,de Sanjose S.,et al.Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer.N Engl J Med 2003;348:518-27.
4.何以丰.人乳头瘤病毒的定型、定量基因检测方法.申请 号:200410024936.4.有权.
5.港龙生物技术（深圳有）限公司.一种高危型HPV荧光PCR筛查方法及 引物、探针和试剂盒.申请号：200610033618.3.审中.
6.中山大学达安基因股份有限公司.检测高危型人乳头瘤病毒的方法及试 剂盒.申请号：200610037188.2.审中.
7.上海裕隆基因科技中心有限公司.定量检测HPV16/18型感染的荧光PCR 试剂盒.申请号：200910045433.8.审中.
8.潮州凯普生物化学有限公司.人乳头状瘤病毒感染基因扩增荧光检测试 剂盒.申请号：200910037452.6.审中.
9.上海之江生物技术有限公司.用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒及 其制备和应用.申请号：200910047010.X.审中.
10.上海多纳美企业发展有限公司.荧光定量PCR定性检测高危型HPV的方 法及其试剂盒.申请号：200910051131.1.审中.
11.广州锐达生物科技有限公司呼吸疾病国家重点实验室.一种高危型 HPV荧光PCR筛查方法及引物、探针和试剂盒.申请号：200910041622.8.审中.
12.港龙生物技术（深圳有）限公司.诊断人乳头瘤病毒感染的荧光PCR 方法.申请号：200710076584.审中.
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利 用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其 他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。