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1、(10)授权公告号 CN 103451113 B (45)授权公告日 2015.01.28 CN 103451113 B (21)申请号 201310392214.3 (22)申请日 2013.09.02 CGMCC No.7514 2013.04.23 C12N 1/14(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (73)专利权人 山西农业大学 地址 030801 山西省晋中市太谷县山西农业 大学农学院 (72)发明人 马瑞燕 田晶 李新凤 梁丽 郝赤 刘同先 (74)专利代理机构 北京天奇智新知识产权代理 有限公司 11340 代理人 陈新胜 田晶 等 . 玫烟色棒束孢 I。
2、F-1106 菌株对烟 粉虱的致病力 .山西农业科学 .2013, 第 41 卷 ( 第 7 期 ),728 731. 吴伟 等 . 玫烟色拟青霉培养性状与产孢特 性初步研究 .西南林学院学报 .2004, 第 24 卷 ( 第 2 期 ),30 33. 梁丽 等 . 玫烟色棒束孢研究进展 .山西农 业大学学报 （自然科学版） .2013, 第 33 卷 ( 第 4 期 ),362 368. 李忠 等 . 玫烟色拟青霉的培养及固体培养 基筛选 .贵州农业科学 .2002, 第 30 卷 ( 第 6 期 ),27 28. 张仙红 等 . 玫烟色拟青霉最适液体培养条 件的研究 .微生物学杂志 .2。
3、006, 第 26 卷 ( 第 6 期 ),15 18. Claire Vidal 等 .Effect of various liquid culture media on morphology, growth, propagule production, and pathogenic activity to Bemisia argentifolii of the entomopathogenic Hyphomycete, Paecilomyces fumosoroseus.Mycopathologia .1998, 第 143 卷 33 46. 李忠 等 . 虫生真菌玫烟色拟青霉培养条件 研。
4、究. 植物保护 .2005,第31卷(第5期),28 30. (54) 发明名称 一种玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法 (57) 摘要 本发明公开一种玫烟色棒束孢菌菌株的分离 及培养方法， 该方法为 ： 从蔬菜叶上采集被虫生 真菌侵染的烟粉虱虫尸， 从虫尸上分离虫生真菌， 放入 PDA 培养基上培养后制成孢子悬浮液喷于烟 粉虱 2 龄若虫上， 培养后从虫尸上再次分离该虫 生真菌， 保存在试管斜面上， 保存于冰箱中。从冰 箱中取出虫生真菌， 制成孢子悬浮液， 用滤纸片沾 取孢子悬浮液， 接种于培养基上， 对置于霉菌培养 箱中培养， 挑取菌丝接入无菌水中搅拌， 过滤， 将 孢子悬浮液， 置于培养。
5、皿中心， 在菌落中心打孔， 吐温 -80 打散， 搅拌， 过滤后计算产孢量和菌落直 径。 用该方法对最适培养基配方、 温度、 pH、 光照条 件和通气条件进行筛选。本发明的优点在于菌落 直径面积大， 产孢量大。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张林 权利要求书 3 页 说明书 11 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书3页 说明书11页 (10)授权公告号 CN 103451113 B CN 103451113 B 1/3 页 2 1. 一种玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法， 其特征在于， 所述分离方法为 ： 首先 从。
6、温室蔬菜叶上采集到被虫生真菌侵染的烟粉虱Bemisia tabaci虫尸3-7头， 从采回的被 虫生真菌侵染的烟粉虱虫尸上分离病原菌 ； 先利用 3的次氯酸钠溶液对采集的烟粉虱虫 尸进行表面消毒， 然后用经 110-130灭菌 10-30min 后的去离子水 5-15ml 冲洗 2-4 次， 放 入马铃薯葡萄糖培养基 PDA 或马铃薯蔗糖培养基 PSA 上， 倒置于 20-30霉菌培养箱中培 养， 待有菌丝形成后， 挑取形成后的菌丝在马铃薯葡萄糖培养基 PDA 或马铃薯蔗糖培养基 PSA 上培养， 8-12d 后马铃薯葡萄糖培养基 PDA 或马铃薯蔗糖培养基 PSA 上的菌丝逐渐形成 致密绒毛。
7、状白色菌落， 背面呈浅黄褐色， 这时分生孢子在菌丝端部或侧枝上生长， 则分生孢 子形成， 挑取菌丝放入盛有 5-15ml 0.1的吐温 -80 的无菌水的小烧杯中， 用磁力搅拌器 进行搅拌， 分生孢子会从菌丝上脱落， 用 3-5 层无菌纱布进行过滤， 将菌丝过滤掉， 分生孢 子会在吐温-80中形成孢子悬浮液， 这时再用血球计数板计数， 制成1.0107分生孢子/ml 的孢子悬浮液， 将此孢子悬浮液喷于带有40-60头烟粉虱2龄若虫的蔬菜叶上， 放入湿度为 80-100， 温度为 20-30的人工气候箱中培养 4-6d 后烟粉虱若虫上会布满白色菌丝， 即 可确定培养后虫生真菌与采集到的烟粉虱若虫。
8、生真菌是同一种虫生真菌， 证明分离到的虫 生真菌的确是烟粉虱的虫生真菌， 将该虫生真菌保存在试管斜面上， 保存于 3-5冰箱中 ； 所述玫烟色棒束孢菌菌株的培养方法为 ： 从冰箱中取出保存在试管斜面上的虫生真 菌， 接种于 pH 为 5-10 的马铃薯葡萄糖培养基 PDA 或马铃薯蔗糖培养基 PSA 上， 置于霉菌 培养箱中培养 8-12d ； 在培养的前 4-6d 设置霉菌培养箱的温度为 15-30光照为 24h 全光 照， 这样利于菌丝生长， 后 4-6d 设置霉菌培养箱的温度为 15-30全黑暗培养， 这样利于产 孢 ； 8-12d 后挑取菌丝接入已经灭菌的含 0.1的吐温 -80 的无。
9、菌水中， 用磁力搅拌器进行 搅拌， 分生孢子会从菌丝上脱落， 用 3-5 层无菌纱布进行过滤， 将菌丝过滤掉， 分生孢子会 在吐温-80中形成孢子悬浮液 ； 用血球计数板调整孢子浓度为1.0107孢子/ml， 制成孢子 悬浮液 ； 再用直径4-8mm灭菌的滤纸片沾取孢子悬浮液， 置于直径为9cm加入20-30ml马铃 薯葡萄糖培养基 PDA 或马铃薯蔗糖培养基 PSA 的玻璃培养皿中心， 先在温度为 15-30光 照为 24h 全光照的条件下培养 4-6d， 再转入温度为 15-30全黑暗的条件下培养 4-6d 后， 马铃薯葡萄糖培养基 PDA 或马铃薯蔗糖培养基 PSA 上呈现平板致密绒毛状。
10、白色菌落， 菌落 中心有直径为 4-8mm 的圆形凸起， 菌落背面呈浅黄褐色， 这时菌落形成， 用灭菌打孔器在菌 落中心至边缘 1/2 处打孔， 分别打孔 4-6 处， 且每处菌饼的位置在不同平板中基本一致， 用 0.1的吐温 -80 打散， 放在磁力搅拌器上搅拌 20-40min， 用双层擦镜纸过滤后， 用血球计 数板计数， 计算产孢量和菌落直径。 2. 如权利要求 1 所述的玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法， 其特征在于， 所述分 离方法为， 首先从温室黄瓜叶片上采集到被虫生真菌侵染的烟粉虱 Bemisia tabaci 虫尸 5 头， 从采回的被虫生真菌侵染的烟粉虱虫尸上分离病原菌 ；。
11、 先利用 3的次氯酸钠溶液对 采集的烟粉虱虫尸进行表面消毒， 然后用经121灭菌20min后的去离子水10ml冲洗3次， 放入马铃薯葡萄糖培养基 PDA 上， 倒置于 25霉菌培养箱中培养， 待有菌丝形成后， 挑取形 成后的菌丝在马铃薯葡萄糖培养基PDA上培养， 10d后马铃薯葡萄糖培养基PDA上的菌丝逐 渐形成致密绒毛状白色菌落， 背面呈浅黄褐色， 这时分生孢子在菌丝端部或侧枝上生长， 则 分生孢子形成， 挑取菌丝放入盛有 10ml 0.1的吐温 -80 的无菌水的小烧杯中， 用磁力搅 拌器进行搅拌， 分生孢子会从菌丝上脱落， 用 4 层无菌纱布进行过滤， 将菌丝过滤掉， 分生 权 利 要 。
12、求 书 CN 103451113 B 2 2/3 页 3 孢子会在吐温-80中形成孢子悬浮液， 这时再用血球计数板计数， 制成1.0107分生孢子/ ml 的孢子悬浮液， 将此孢子悬浮液喷于带有 50 头烟粉虱 2 龄若虫的黄瓜叶片上， 放入湿度 为90， 温度为25的人工气候箱中培养5d后烟粉虱若虫上会布满白色菌丝， 即可确定培 养后虫生真菌与采集到的烟粉虱若虫生真菌是同一种虫生真菌， 证明分离到的虫生真菌的 确是烟粉虱的虫生真菌， 将该虫生真菌保存在试管斜面上， 保存于 4冰箱中 ； 所述玫烟色棒束孢菌菌株的培养方法为 ： 从冰箱中取出保存在试管斜面上的虫生真 菌， 接种于pH为7左右的马。
13、铃薯葡萄糖培养基PDA上， 置于霉菌培养箱中培养 ； 在培养的前 5d 设置霉菌培养箱的温度为 30光照为 24h 全光照， 这样利于菌丝生长， 后 5d 设置霉菌培 养箱的温度为 25全黑暗培养， 这样利于产孢 ； 10d 挑取菌丝接入已经灭菌的含 0.1的吐 温 -80 的无菌水中， 用磁力搅拌器进行搅拌， 分生孢子会从菌丝上脱落， 用 4 层无菌纱布进 行过滤， 将菌丝过滤掉， 分生孢子会在吐温 -80 中形成孢子悬浮液 ； 用血球计数板调整孢子 浓度为 1.0107孢子 /ml， 制成孢子悬浮液。再用直径 6mm 灭菌的滤纸片沾取孢子悬浮液， 置于直径9cm加入25ml马铃薯葡萄糖培养。
14、基PDA的玻璃培养皿中心， 先在温度为30光照 为 24h 全光照的条件下培养 5d， 再转入温度为 25全黑暗的条件下培养 5d ； 10d 马铃薯葡 萄糖培养基PDA上呈现平板致密绒毛状白色菌落， 菌落中心有直径约6mm的圆形凸起， 菌落 背面呈浅黄褐色 ； 用灭菌打孔器在菌落中心至边缘 1/2 处打孔， 分别打孔 5 处， 且 5 处菌饼 的位置在不同平板中基本一致， 用0.1的吐温-80打散， 放在磁力搅拌器上搅拌30min， 用 双层擦镜纸过滤后， 用血球计数板计数， 计算产孢量和菌落直径。 3.如权利要求1或2所述的玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法， 其特征在于， 所述 马铃薯葡。
15、萄糖培养基 PDA 的配方为 ： 马铃薯 100-300g， 葡萄糖 10-30g， 琼脂 8-25g， 蒸馏水 0.5-1.5L。 4. 如权利要求 3 所述的玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法， 其特征在于， 所述马 铃薯葡萄糖培养基 PDA 的配方为 ： 马铃薯 200g， 葡萄糖 20g， 琼脂 17g， 蒸馏水 1L ； 或马铃 薯 150g， 葡萄糖 25g， 琼脂 12g， 蒸馏水 1.2L ； 或马铃薯 250g， 葡萄糖 15g， 琼脂 22g， 蒸馏水 0.8L。 5. 如权利要求 3 所述的玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法， 其特征在于， 所述马 铃薯葡萄糖培养基 PD。
16、A 的制备方法为 ： 将洗净去皮的马铃薯切成 1cm 见方的小块， 加蒸馏 水煮半小时， 用四层医用纱布滤去马铃薯， 再加蒸馏水补充到 1000ml， 然后加入琼脂和葡萄 糖， 待完全溶化后分装入 250ml 的三角瓶中， 每瓶装入 150ml， 121下高温灭菌 20min 后即 可。 6. 如权利要求 4 所述的玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法， 其特征在于， 所述马 铃薯葡萄糖培养基 PDA 的制备方法为 ： 将洗净去皮的马铃薯切成 1cm 见方的小块， 加蒸馏 水煮半小时， 用四层医用纱布滤去马铃薯， 再加蒸馏水补充到 1000ml， 然后加入琼脂和葡萄 糖， 待完全溶化后分装入 2。
17、50ml 的三角瓶中， 每瓶装入 150ml， 121下高温灭菌 20min 后即 可。 7. 如权利要求 1 所述的玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法， 其特征在于， 所述马 铃薯蔗糖培养基PSA配方为 ： 马铃薯100-300g， 蔗糖10-30g， 琼脂8-25g， 蒸馏水0.5-1.5L。 8. 如权利要求 7 所述的玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法， 其特征在于， 所述马 铃薯蔗糖培养基 PSA 配方为 : 马铃薯 200g， 蔗糖 20g， 琼脂 17g， 蒸馏水 1L ； 或马铃薯 150g， 权 利 要 求 书 CN 103451113 B 3 3/3 页 4 蔗糖 25g，。
18、 琼脂 12g， 蒸馏水 1.2L ； 或马铃薯 250g， 蔗糖 15g， 琼脂 22g， 蒸馏水 0.8L。 9. 如权利要求 7 所述的玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法， 其特征在于， 所述马 铃薯蔗糖培养基PSA的制备方法为 ： 将洗净去皮的马铃薯切成1cm见方的小块， 加蒸馏水煮 半小时， 用四层医用纱布滤去马铃薯， 再加蒸馏水补充到 1000ml， 然后加入琼脂和蔗糖， 待 完全溶化后分装入 250ml 的三角瓶中， 每瓶装入 150ml， 121下高温灭菌 20min 后即可。 10. 如权利要求 8 所述的玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法， 其特征在于， 所述马 铃薯蔗糖培。
19、养基PSA的制备方法为 ： 将洗净去皮的马铃薯切成1cm见方的小块， 加蒸馏水煮 半小时， 用四层医用纱布滤去马铃薯， 再加蒸馏水补充到 1000ml， 然后加入琼脂和蔗糖， 待 完全溶化后分装入 250ml 的三角瓶中， 每瓶装入 150ml， 121下高温灭菌 20min 后即可。 权 利 要 求 书 CN 103451113 B 4 1/11 页 5 一种玫烟色棒束孢菌菌株的分离及培养方法 技术领域 0001 本发明涉及一种菌株的分离及培养方法， 特别是涉及一种玫烟色棒束孢菌菌株的 分离及培养方法。 背景技术 0002 玫烟色棒束孢是一种重要的虫生真菌， 分布广泛， 能寄生同翅目、 半翅。
20、目、 双翅目、 鞘翅目和膜翅目等多种有害昆虫， 我们在田间分离到了一株玫烟色棒束孢菌株， 命名为 IF-1106， 我们对玫烟色棒束孢的生物学特性进行研究， 有助于为该菌的大量生产提供理论 依据。 在进行生物学特性测定过程中， 发现传统的用打孔器取菌饼接种的方法， 会使孢子弹 射， 菌落生长不规则， 无法测定菌落直径。 因此， 需要寻找一种合适的培养方法， 避免孢子弹 射， 使菌落生长规则， 能合理准确的进行菌落形态特征描述及菌落直径测定， 明确菌的培养 方法。 发明内容 0003 本发明目的在于提供一种玫烟色棒束孢菌菌株的分离方法。 0004 本发明的另一目的在于提供一种玫烟色棒束孢菌菌株的。
21、培养方法。 0005 本发明是通过如下技术方案实现的 ： 0006 一种玫烟色棒束孢菌， 其菌株为 IF-1106， 保藏单位 ： 中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心， 保藏地址 ： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究 所， 保藏日期 ： 2013年4月23日， 保藏编号 ： CGMCCNo.7514， 分类命名 ： 玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea。 0007 本发明玫烟色棒束孢菌菌株的分离方法为， 首先从温室蔬菜叶上采集到被虫生 真菌侵染的烟粉虱 Bemisia tabaci 虫尸 3-7 头， 从采回的被虫生真菌侵染的烟粉虱虫 尸上分离病原菌 ；。
22、 先利用 3% 的次氯酸钠溶液对采集的烟粉虱虫尸进行表面消毒， 然后 用经 110-130灭菌 10-30min 后的去离子水 5-15ml 冲洗 2-4 次， 放入马铃薯葡萄糖培 养基 （PDA） 或马铃薯蔗糖培养基 （PSA） 上， 倒置于 20-30霉菌培养箱 （培养箱的型号为 MJ-250F-1 霉菌培养箱， 由上海一恒科学仪器有限公司生产） 中培养， 待有菌丝形成后， 挑取 形成后的菌丝在马铃薯葡萄糖培养基 （PDA） 或马铃薯蔗糖培养基 （PSA） 上培养， 8-12d 后马 铃薯葡萄糖培养基 （PDA） 或马铃薯蔗糖培养基 （PSA） 上的菌丝逐渐形成致密绒毛状白色菌 落， 背面。
23、呈浅黄褐色， 这时分生孢子在菌丝端部或侧枝上生长， 则分生孢子形成， 挑取菌丝 放入盛有 5-15ml0.1% 的吐温 -80 的无菌水的小烧杯中， 用磁力搅拌器 （磁力搅拌器型号为 RH basic KT/C， 由 IKA 公司生产） 进行搅拌， 分生孢子会从菌丝上脱落， 用 3-5 层无菌纱布 进行过滤， 将菌丝过滤掉， 分生孢子会在吐温 -80 中形成孢子悬浮液， 这时再用血球计数板 计数， 制成1.0107分生孢子/ml的孢子悬浮液， 将此孢子悬浮液喷于带有40-60头烟粉虱 2 龄若虫 （2 龄若虫的形态特征为 ： 椭圆形， 扁平， 灰白色， 稍透明， 体长 0.3-0.5mm） 的。
24、蔬菜 叶上， 放入湿度为 80-100%， 温度为 20-30的人工气候箱 （人工气候箱的型号为 PRX-450C 说 明 书 CN 103451113 B 5 2/11 页 6 智能人工气候箱， 由宁波海曙赛福仪器厂生产） 中培养 4-6d 后烟粉虱若虫上会布满白色菌 丝， 即可确定培养后虫生真菌与采集到的烟粉虱若虫生真菌是同一种虫生真菌， 证明分离 到的虫生真菌的确是烟粉虱的虫生真菌， 将该虫生真菌保存在试管斜面上， 保存于 3-5冰 箱中。 0008 本发明玫烟色棒束孢菌菌株的培养方法为 ： 从冰箱中取出保存在试管斜面上的虫 生真菌， 接种于 pH 为 5-10 的马铃薯葡萄糖培养基 （。
25、PDA） 或马铃薯蔗糖培养基 （PSA） 上， 置于霉菌培养箱中培养 8-12d ； 在培养的前 4-6d 设置霉菌培养箱的温度为 15-30光照为 24h 全光照， 这样利于菌丝生长， 后 4-6d 设置霉菌培养箱的温度为 15-30全黑暗培养， 这 样利于产孢 ； 8-12d 后挑取菌丝接入已经灭菌的含 0.1% 的吐温 -80 的无菌水中， 用磁力搅 拌器 （磁力搅拌器型号为 RH basic KT/C， 由 IKA 公司生产） 进行搅拌， 分生孢子会从菌丝上 脱落， 用 3-5 层无菌纱布进行过滤， 将菌丝过滤掉， 分生孢子会在吐温 -80 中形成孢子悬浮 液 ； 用血球计数板调整孢子。
26、浓度为 1.0107孢子 /ml， 制成孢子悬浮液。再用直径 4-8mm 灭 菌的滤纸片沾取孢子悬浮液， 置于直径为9cm加入20-30ml马铃薯葡萄糖培养基 （PDA） 或马 铃薯蔗糖培养基 （PSA） 的玻璃培养皿中心， 先在温度为 15-30光照为 24h 全光照的条件下 培养4-6d， 再转入温度为15-30全黑暗的条件下培养4-6d后， 马铃薯葡萄糖培养基 （PDA） 或马铃薯蔗糖培养基 （PSA） 上呈现平板致密绒毛状白色菌落， 菌落中心有直径为 4-8mm 的 圆形凸起， 菌落背面呈浅黄褐色， 这时菌落形成， 用灭菌打孔器在菌落中心至边缘 1/2 处打 孔， 分别打孔 4-6 处。
27、， 且每处菌饼的位置在不同平板中基本一致， 用 0.1% 的吐温 -80 打散， 放在磁力搅拌器 （磁力搅拌器型号为 RH basic KT/C， 由 IKA 公司生产） 上搅拌 20-40min， 用 双层擦镜纸过滤后， 用血球计数板计数， 计算产孢量和菌落直径。 0009 本发明玫烟色棒束孢菌菌株的分离方法优选为， 首先从温室黄瓜叶片上采集到被 虫生真菌侵染的烟粉虱 Bemisia tabaci 虫尸 5 头， 从采回的被虫生真菌侵染的烟粉虱虫 尸上分离病原菌 ； 先利用 3% 的次氯酸钠溶液对采集的烟粉虱虫尸进行表面消毒， 然后用经 121灭菌 20min 后的去离子水 10ml 冲洗 。
28、3 次， 放入马铃薯葡萄糖培养基 （PDA） 上， 倒置于 25霉菌培养箱 （培养箱的型号为 MJ-250F-1 霉菌培养箱， 由上海一恒科学仪器有限公司 生产） 中培养， 待有菌丝形成后， 挑取形成后的菌丝在马铃薯葡萄糖培养基 （PDA） 上培养， 10d 后马铃薯葡萄糖培养基 （PDA） 上的菌丝逐渐形成致密绒毛状白色菌落， 背面呈浅黄褐 色， 这时分生孢子在菌丝端部或侧枝上生长， 则分生孢子形成， 挑取菌丝放入盛有 10ml0.1% 的吐温-80的无菌水的小烧杯中， 用磁力搅拌器 （磁力搅拌器型号为RH basic KT/C， 由IKA 公司生产） 进行搅拌， 分生孢子会从菌丝上脱落， 。
29、用 4 层无菌纱布进行过滤， 将菌丝过滤掉， 分生孢子会在吐温 -80 中形成孢子悬浮液， 这时再用血球计数板计数， 制成 1.0107分生 孢子 /ml 的孢子悬浮液， 将此孢子悬浮液喷于带有 50 头烟粉虱 2 龄若虫 （烟粉虱 2 龄若虫 的形态特征为 ： 椭圆形， 扁平， 灰白色， 稍透明， 体长 0.4mm） 的黄瓜叶片上， 放入湿度为 90%， 温度为 25的人工气候箱 （人工气候箱的型号为 PRX-450C 智能人工气候箱， 由宁波海曙赛 福仪器厂生产） 中培养 5d 后烟粉虱若虫上会布满白色菌丝， 即可确定培养后虫生真菌与采 集到的烟粉虱若虫生真菌是同一种虫生真菌， 证明分离到。
30、的虫生真菌的确是烟粉虱的虫生 真菌， 将该虫生真菌保存在试管斜面上， 保存于 4冰箱中。 0010 本发明玫烟色棒束孢菌菌株的培养方法优选为 ： 从冰箱中取出保存在试管斜面上 的虫生真菌， 接种于 pH 为 7 左右的马铃薯葡萄糖培养基 （PDA） 上， 置于霉菌培养箱中培养 ； 说 明 书 CN 103451113 B 6 3/11 页 7 在培养的前 5d 设置霉菌培养箱的温度为 30光照为 24h 全光照， 这样利于菌丝生长， 后 5d 设置霉菌培养箱的温度为 25全黑暗培养， 这样利于产孢 ； 10d 挑取菌丝接入已经灭菌的 含 0.1% 的吐温 -80 的无菌水中， 用磁力搅拌器 （。
31、磁力搅拌器型号为 RH basic KT/C， 由 IKA 公司生产） 进行搅拌， 分生孢子会从菌丝上脱落， 用 4 层无菌纱布进行过滤， 将菌丝过滤掉， 分生孢子会在吐温 -80 中形成孢子悬浮液 ； 用血球计数板调整孢子浓度为 1.0107孢子 / ml， 制成孢子悬浮液。 再用直径6mm灭菌的滤纸片沾取孢子悬浮液， 置于直径9cm加入25ml 马铃薯葡萄糖培养基 （PDA） 的玻璃培养皿中心， 先在温度为 30光照为 24h 全光照的条件 下培养 5d， 再转入温度为 25全黑暗的条件下培养 5d ； 10d 马铃薯葡萄糖培养基 （PDA） 上 呈现平板致密绒毛状白色菌落， 菌落中心有直。
32、径约 6mm 的圆形凸起， 菌落背面呈浅黄褐色 ； 用灭菌打孔器在菌落中心至边缘 1/2 处打孔， 分别打孔 5 处， 且 5 处菌饼的位置在不同平板 中基本一致， 用0.1%的吐温-80打散， 放在磁力搅拌器 （磁力搅拌器型号为RH basic KT/C， 由 IKA 公司生产） 上搅拌 30min， 用双层擦镜纸过滤后， 用血球计数板计数， 计算产孢量， 菌 落直径为 （39.081.15） mm， 产孢量为 （1.9920.165） 107孢子 /ml。 0011 所述马铃薯葡萄糖培养基 （PDA） ， 具体配方为 ： 马铃薯 100-300g， 葡萄糖 10-30g， 琼脂 8-25g。
33、， 蒸馏水 0.5-1.5L。 0012 所述马铃薯葡萄糖培养基 （PDA） ， 具体配方优选为 ： 马铃薯 200g， 葡萄糖 20g， 琼脂 17g， 蒸馏水 1L ； 或马铃薯 150g， 葡萄糖 25g， 琼脂 12g， 蒸馏水 1.2L ； 或马铃薯 250g， 葡萄糖 15g， 琼脂 22g， 蒸馏水 0.8L。 0013 所述马铃薯葡萄糖培养基 （PDA） 的制备方法为 ： 将洗净去皮的马铃薯切成 1cm 见 方的小块， 加蒸馏水煮半小时， 用四层医用纱布滤去马铃薯， 再加蒸馏水补充到 1000ml， 然 后加入琼脂和葡萄糖， 待完全溶化后分装入 250ml 的三角瓶中， 每瓶装。
34、入 150ml， 121下高 温灭菌 20min 后即可。 0014 所述马铃薯蔗糖培养基 （PSA） 具体配方为 ： 马铃薯 100-300g， 蔗糖 10-30g， 琼脂 8-25g， 蒸馏水 0.5-1.5L。 0015 所述马铃薯蔗糖培养基 （PSA） 具体配方优先为 : 马铃薯 200g， 蔗糖 20g， 琼脂 17g， 蒸馏水 1L ； 或马铃薯 150g， 蔗糖 25g， 琼脂 12g， 蒸馏水 1.2L ； 或马铃薯 250g， 蔗糖 15g， 琼脂 22g， 蒸馏水 0.8L。 0016 所述马铃薯蔗糖培养基 （PSA） 的制备方法为 ： 将洗净去皮的马铃薯切成 1cm 见方。
35、 的小块， 加蒸馏水煮半小时， 用四层医用纱布滤去马铃薯， 再加蒸馏水补充到 1000ml， 然后 加入琼脂和蔗糖， 待完全溶化后分装入 250ml 的三角瓶中， 每瓶装入 150ml， 121下高温灭 菌 20min 后即可。 0017 本发明玫烟色棒束孢菌菌株的分离方法和培养方法优点在于避免孢子弹射， 使菌 落生长规则， 能合理准确的进行菌落形态特征描述及菌落直径测定， 且菌落直径面积大， 产 孢量大等优点。 0018 下述实验例用于进一步说明本发明， 但不限于本发明。 0019 1 材料与方法 0020 1.1 供试菌株 0021 玫烟色棒束孢IF-1106菌株， 试管斜面保存于4冰箱中。
36、。 使用时， 取出活化， 接种 于 PDA 培养基上， 置于 25霉菌培养箱中培养。 说 明 书 CN 103451113 B 7 4/11 页 8 0022 1.2 生物学指标测定方法 0023 1.2.1 菌落生长速率测定 0024 挑取斜面菌种的分生孢子， 接入已经灭菌的0.1%的吐温80溶液中， 用血球计数板 调整孢子浓度为 1.0107孢子 /ml， 制成孢子悬浮液。用灭菌的滤纸片 （直径 6mm） 沾取孢 子悬浮液， 置于直径 9cm 加入 25ml 培养基的培养皿中心， 25下黑暗培养。每个处理 5 次 重复， 从第 3d 开始每 2d 定时定方向测量菌落直径， 同时观察菌落形态。
37、特征。 0025 1.2.2 产孢量的测定 0026 在第5次测量菌落直径后， 用灭菌打孔器在菌落中心至边缘1/2处打孔， 分别打孔 5处， 且5处菌饼的位置在不同平板中基本一致， 用0.1%的吐温80打散， 放在磁力搅拌器上 搅拌 30min， 用双层擦镜纸过滤后， 用血球计数板计数。 0027 1.3 培养条件设置 0028 1.3.1 培养基配方 0029 马铃薯葡萄糖培养基 （PDA） : 马铃薯 200g， 葡萄糖 20g， 琼脂 17g， 蒸馏水 1L。 0030 马铃薯蔗糖培养基 （PSA） : 马铃薯 200g， 蔗糖 20g， 琼脂 17g， 蒸馏水 1L。 0031 萨氏葡。
38、萄糖培养基 （SDA） : 蛋白胨 10g， 葡萄糖 40g， 琼脂 15g， 蒸馏水 1L。 0032 萨氏葡萄糖酵母浸膏培养基 （SDAY） : 蛋白胨 10g， 葡萄糖 40g， 琼脂 15g， 酵母粉 2g， 蒸馏水 1L。 0033 萨氏麦芽糖酵母浸膏培养基 （SMAY） : 蛋白胨 10g， 麦芽糖 40g， 琼脂 15g， 酵母粉 2g， 蒸馏水 1L。 0034 察氏培养基 （Czperk） :NaNO32g， K2HPO41g， KCl0.5g， MgSO40.5g， FeSO40.01g， 蔗糖 30g， 琼脂 17g， 蒸馏水 1L。 0035 菌株接种于以上各种培养基上。
39、， 于 25的恒温培养箱中全黑暗培养， 每个处理 5 次重复， 各生物学指标测定同 1.2。 0036 1.3.2 温度条件 0037 菌株接种于 PDA 培养基上， 分别于 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40的恒温 培养箱中全黑暗培养， 每个温度设 5 次重复， 各生物学指标测定同 1.2。 0038 1.3.3 光周期条件 0039 菌株接种于 PDA 培养基上， 于 25下设 24L、 16L/8D、 12L/12D、 8L/16D、 24D 五个光 周期培养。每个温度设 5 次重复， 各生物学指标测定同 1.2。 0040 1.3.4 通气条件 0041 菌种接种于 。
40、PDA 培养基上， 于 25下培养。将接好菌的培养皿 ： 用 Parafi lm （美国， PM-996） 封口膜 （裁成 3cm 的宽度） 封口、 家用保鲜膜 （裁成 3cm 的宽度） 封口、 不封口， 共 3 个处理， 每个处理 5 次重复， 各生物学指标测定同 1.2。 0042 1.3.5 不同初始 pH 0043 用 NaOH 和乳酸调节 PDA 培养基 pH 分别为 5、 6、 7、 8、 9， 然后接种于 25条件下进 行培养， 每个处理 5 次重复， 各生物学指标测定同 1.2。 0044 1.4 数据处理 0045 用 SPSS17.0 数据处理系统对实验数据进行统计分析， 。
41、计算均值及标准误， 均值差 异显著性通过Duncan新复极差法进行多重比较分析。 回归方程用SPSS线性回归分析得出， 说 明 书 CN 103451113 B 8 5/11 页 9 回归方程斜率即为菌落生长速率。 0046 2. 结果与分析 0047 2.1 不同培养基对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响 0048 玫烟色棒束孢在不同培养基条件下的菌落直径、 菌落生长速率及产孢量如表 1 所 示。从表中可知， 该菌株在 6 种培养基上的菌落直径 （F=67.10;df=5， 24;P0.001） 及产孢 量 (F=55.39;df=5,24;P0.001) 差异显著， 其中在 SMAY 培养基。
42、上菌落生长速率最大， 为 3.471mm/d， 菌丝生长最快， 菌落直径最大， 为 36.9mm。但该菌株在 SMAY 培养基上的产孢量 却较低。玫烟色棒束孢在 PDA 培养基上的产孢量最大， 达 1.91107孢子 /ml。综合考虑， 选用 PDA 培养基为该菌的最适培养基。 0049 表 1 不同培养基对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响 0050 0051 注 ： 经 Duncan 多重比较， 不同的小写字母代表在 P0.05 水平差异性显著， 下同。 0052 2.2 不同温度对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响 0053 玫烟色棒束孢在不同温度下的培养结果如表 3 所示。从表中可知， 该。
43、菌在 15 30的范围内可以生长， 在不同温度下菌落直径 （F=113.0;df=3,16;P0.001）及产孢量 （F=69.94;df=3,16;P0.001） 明显不同。在 30时菌落直径最大， 培养 11d 后菌落直径达 33.04mm， 但在25时菌丝生长速率和产孢最大， 分别为2.486mm/d和1.910107孢子/ml。 温度为 10、 35 和 40时菌落不生长。 0054 表 3 不同温度对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响 0055 0056 2.3 不同光周期对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响 说 明 书 CN 103451113 B 9 6/11 页 10 0057 光。
44、周期对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响见表 4。玫烟色棒束孢在不同的光 周期下， 菌落直径 （F=127.1;df=4,20;P0.0001） 及产孢量 （F=5.832;df=4,20;P=0.003） 差 异显著。24h 全光照条件下， 菌落直径最大， 为 48.76mm ； 生长速率最快， 为 4.627mm/d。但 在 24h 全黑暗条件下， 菌落的产孢量最大， 为 1.992107孢子 /ml。随着光照时间的延长， 菌落直径逐渐增大， 但是产孢量有下降的趋势。 因此光照对菌落生长有促进作用， 但会抑制 产孢。 0058 玫烟色棒束孢在不同光周期下菌落形态特征在全光照条件下菌落较薄， 。
45、绒毛状菌 丝较少， 菌落较光滑。 在光暗交替下， 菌落有明显的同心轮纹， 而在全黑暗条件下， 菌落绒毛 状菌丝较多， 菌落较厚。 0059 表 4 不同光周期对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响 0060 0061 0062 2.4 不同通气条件对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响 0063 不同通气条件下玫烟色棒束孢菌落直径及产孢量如表 5 所示。玫烟色棒束孢菌株 在 0064 平 板 培 养 过 程 中，封 口 和 未 封 口 的 培 养 皿 的 菌 落 直 径 （F=1.402;df=2,12;P=0.284） 差异 0065 不显著， 但产孢量 （F=8.030;df=2,12;P=0.0。
46、06） 差异显著。在不封口的情况下， 菌 落生长 0066 较快， 菌落直径最大， 为 35.84mm， 产孢量也较大 4.56106孢子 /ml。表明氧气对 菌落生 0067 长和产孢有一定的促进作用。 0068 表 5 不同通气条件对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响 0069 0070 2.5 不同初始 pH 对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响 0071 不同初始pH下玫烟色棒束孢菌落直径及产孢量如表6所示。 玫烟色棒束孢在5 说 明 书 CN 103451113 B 10 7/11 页 11 10 的范围内均可生长和产孢， 但不同 pH 下的菌落直径 （F=63.15;df=5,24;P。
47、0.0001） 及产 孢量 （F=62.83;df=5,24;P0.0001） 差异显著。pH 为 7 时， 菌落直径及产孢量最大， 分别为 36.88mm 和 5.69106孢子 /ml。随着 pH 的升高或降低， 菌落直径及产孢量逐渐减小。 0072 表 6 不同初始 pH 对玫烟色棒束孢菌落生长及产孢的影响 0073 0074 按照上述方法进行测定， 对数据进行分析后， 明确了玫烟色棒束孢的最适培养条 件， 0075 同时验证了该接种方法的可行性。 0076 下述实施例用于进一步说明本发明， 但不限于本发明。 0077 实施例 1 0078 首先从温室黄瓜叶片上采集到被虫生真菌侵染的烟粉。
48、虱 Bemisia tabaci 虫尸 5 头， 从采回的被虫生真菌侵染的烟粉虱虫尸上分离病原菌 ； 先利用 3% 的次氯酸钠溶液对采 集的烟粉虱虫尸进行表面消毒， 然后用经 121灭菌 20min 后的去离子水 10ml 冲洗 3 次， 放入马铃薯葡萄糖培养基 （PDA） 上， 倒置于 25霉菌培养箱 （培养箱的型号为 MJ-250F-1 霉 菌培养箱， 由上海一恒科学仪器有限公司生产） 中培养， 待有菌丝形成后， 挑取形成后的菌 丝在马铃薯葡萄糖培养基 （PDA） 上培养， 10d 后马铃薯葡萄糖培养基 （PDA） 上的菌丝逐渐形 成致密绒毛状白色菌落， 背面呈浅黄褐色， 这时分生孢子在菌。
49、丝端部或侧枝上生长， 则分生 孢子形成， 挑取菌丝放入盛有10ml0.1%的吐温-80的无菌水的小烧杯中， 用磁力搅拌器 （磁 力搅拌器型号为 RH basic KT/C， 由 IKA 公司生产） 进行搅拌， 分生孢子会从菌丝上脱落， 用 4 层无菌纱布进行过滤， 将菌丝过滤掉， 分生孢子会在吐温 -80 中形成孢子悬浮液， 这时 再用血球计数板计数， 制成 1.0107分生孢子 /ml 的孢子悬浮液， 将此孢子悬浮液喷于带 有 50 头烟粉虱 2 龄若虫 （烟粉虱 2 龄若虫的形态特征为 ： 椭圆形， 扁平， 灰白色， 稍透明， 体 长 0.4mm） 的黄瓜叶片上， 放入湿度为 90%， 温度为 25的人工气候箱 （人工气候箱的型号为 PRX-450C 智能人工气候箱， 由宁波海曙赛福仪器厂生产） 中培养 5d 后烟粉虱若虫上会布满 白色菌丝， 即可确定培养后虫生真菌与采集到的烟粉虱若虫生真菌是同一种虫生真菌， 证 明分离到的虫生真菌的确是烟粉虱的虫生真菌， 将该虫生真菌保存在试管斜面上， 保存于 4冰箱中。 0079 从冰箱中取出保存在试管斜面上的虫生真菌， 接种于 pH 为 7 左右的马铃薯葡萄 糖培养基 （PDA） 上， 置于霉菌。