本文中报告了使用Streamline CST和/或Capto MMC来纯化从经过澄清的 细胞培养物上清液直接捕获的抗体的方法，其中尤其能有效除去产物相关 （聚集物和片段）和工艺相关杂质（宿主细胞蛋白质、DNA、培养基组分）， 从而得到纯度与经典的蛋白A亲和层析相当的制备物。
发明背景
蛋白A层析由于其高选择性而常规用作产业单克隆抗体纯化工艺的第一 捕捉步骤，产生良好的总体产量和纯度。然而，此亲和层析的一个主要缺点 是其较高的价格，这尤其在以高剂量需要的治疗性抗体的情况中和/或对于长 期施用可以造成相当大的商品成本因素。另外，自亲和基质浸出的蛋白A配 体由于其潜在的免疫原性而必须通过进一步的层析步骤除去。
在展现离子和疏水性官能度的多元树脂上的混合模式层析可以为经典 亲和方法提供有价值的备选。由于疏水性成分的盐可容许性，在大多数情况 下，将澄清的细胞培养物上清液在基质上直接加载是有可能的，产生对单克 隆抗体的有效捕获。然而，由于树脂的多元性质，配体与特定单克隆抗体的 不同类型的相互作用是有可能的，从而需要与传统的离子交换或疏水性相互 作用层析不同的独特清洗和洗脱条件。
在WO2010/080062中，报告了使用单一聚合物相系统的分离方法。在 WO2008/073620中报告了用于生产在昆虫细胞系中表达的多肽的制备方法。
发明概述
已经发现了多元弱阳离子交换层析材料可以在直接用粗制细胞培养物 培养上清液的柱层析纯化方法中作为第一步使用。
本文中报告的一个方面是用于生成抗IGF-1R抗体的方法，包括下列步 骤：
a)将粗制哺乳动物细胞培养物培养上清液施加到多元弱阳离子交换层析材 料，
b)通过将包含乙二醇和无机盐的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层 析材料来回收所述抗IGF-1R抗体，并且由此生成抗IGF-1R抗体。
在一个实施方案中，所述方法在步骤a)前包括以下额外的步骤a-1)：
a-1)将包含无机盐的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料。
在一个实施方案中，所述方法在步骤a)后且在步骤b)前包括以下额外的 步骤a-b)：
a-b)将缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料，其中未从所述多元 弱阳离子交换层析材料回收所述抗IGF-1R抗体。
在一个实施方案中，所述步骤a-b)包括两个步骤a-b1)和a-b2)：
a-b1)将包含无机盐的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料，并
a-b2)将包含变性剂的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料，
其中未从所述多元弱阳离子交换层析材料回收所述抗IGF-1R抗体。
在一个实施方案中，所述变性剂选自盐酸胍和尿素。
在一个实施方案中，所述无机盐选自氯化钠、氯化钾和氯化铵。
在一个实施方案中，步骤b)中的缓冲溶液包含20mM至30mM Tris， 1050mM至1350mM氯化钠，和约20%(w/v)乙二醇，pH值为pH7.1至pH7.3。
在一个实施方案中，步骤a-1)中的缓冲溶液包含20mM至30mM Tris，和 80mM至120mM氯化钠，pH值为pH7.1至pH7.3。在一个实施方案中，步骤 a-b1)中的缓冲溶液包含20mM至30mM Tris，和80mM至120mM氯化钠，pH 值为pH7.1至pH7.3。在一个实施方案中，步骤a-b2)中的缓冲溶液包含110mM 至140mM Tris，80mM至120mM氯化钠，和30mM至40mM精氨酸，pH值为 pH7.1至pH7.3。
在一个实施方案中，所述多元弱阳离子交换层析材料包含交联琼脂糖， 该交联琼脂糖共价附接有含有羧酸、醚、硫醚和芳香族官能团的多元弱阳离 子交换配体。
发明详述
本文中报告了使用Streamline CST和/或Capto MMC来纯化从澄清的细胞 培养物上清液捕获的单克隆抗体的方法，包括洗脱和清洗的优化条件。尤其 可以有效除去产物相关(聚集物和片段)和工艺相关杂质(宿主蛋白质、培养基 成分)，从而得到纯度与经典的亲和层析相当的制备物。如此，凭借本文中 报告的方法，可以替换经典的蛋白A亲和层析。
在一个实施方案中，所述方法不包括蛋白A亲和层析步骤。
通用层析方法及其用途是本领域中技术人员已知的。参见例如 Chromatography,第5版,A部分:Fundamentals and Techniques,Heftmann,E. (编),Elsevier Science Publishing Company,New York,(1992);Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences,Deyl,Z.(编), Elsevier Science BV,Amsterdam,The Netherlands,(1998);Chromatography Today,Poole,C.F.和Poole,S.K.,Elsevier Science Publishing Company,New York,(1991);Scopes,Protein Purification:Principles and Practice(1982); Sambrook,J.等(编),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989;或Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,F.M.等(编),John Wiley&Sons,Inc., New York(1987)。
术语“施加”指纯化方法中使溶液与层析材料接触的部分步骤。这表示 a)将溶液添加到含有层析材料的层析装置，或b)将层析材料添加到溶液。在 情况a)中，溶液流过装置，从而允许层析材料和溶液中含有的物质相互作用。 根据条件如例如pH、电导率、盐浓度、温度和/或流速，溶液中的一些物质 可以结合至层析材料，而其它物质可以自层析材料回收。可以在流过物中找 到溶液中保留的或从层析材料回收的物质。“流过物”指在流过装置后获得 的溶液，其可以是施加的溶液或用于清洗柱或引起与层析材料结合的物质洗 脱的缓冲溶液。在一个实施方案中，所述装置是柱或盒。在b)情况中，可以 将层析材料例如以固体添加到例如含有待纯化的感兴趣物质的溶液，从而允 许层析材料和溶液中物质之间的相互作用。在相互作用后，例如通过过滤取 出层析材料，并且与层析材料结合的物质也从溶液中与其一起取出，而没有 与层析材料结合的物质保留在溶液中。
术语“结合-和-洗脱模式”指层析步骤的操作模式，其中将含有待纯化 的感兴趣物质的溶液施加到层析材料，其中感兴趣的物质结合至层析材料。 如此，感兴趣的物质在层析材料上保留，而不感兴趣的物质随流过物或上清 液除去。然后，在第二步中用洗脱溶液从层析材料回收感兴趣的物质。在一 个实施方案中，如本文中报告的方法以结合-和-洗脱模式操作。
术语“缓冲溶液”指通过溶解的缓冲物质调节由于酸性或碱性物质的添 加或释放导致的pH变化的溶液。可以使用任何具有这类特性的缓冲物质。一 般地，使用药学可接受缓冲物质。在一个实施方案中，所述缓冲溶液选自由 磷酸和/或其盐组成的磷酸盐缓冲溶液，或由醋酸和其盐组成的醋酸盐缓冲溶 液，或由柠檬酸和/或其盐组成的柠檬酸盐缓冲液，或吗啉缓冲溶液，或2-(N- 吗啉代)乙磺酸(ethanesulfonic)缓冲溶液，或组氨酸缓冲溶液，或甘氨酸缓冲 溶液，或三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲溶液。在另一个实施方案中，所述缓 冲溶液选自Tris缓冲溶液，或柠檬酸盐缓冲溶液，或组氨酸缓冲溶液。所述 缓冲溶液可以包含无机盐，如例如氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、氯化 铵、或硫酸铵。
术语“连续洗脱”和“连续洗脱方法”，在本申请内可互换使用，指如 下的方法，其中连续改变（即提高或降低）引起洗脱（即从层析材料回收结 合的化合物）的溶液的电导率，即通过一系列小步骤改变浓度，每个步骤不 大于引起洗脱的物质的浓度的2%或1%变化。在此“连续洗脱”中，可以线 性或指数性或渐近性改变一种或多种条件，例如pH、离子强度、盐浓度、和 /或层析流动。在一个实施方案中，所述改变是线性的。
术语“步式洗脱”指如下的方法，其中例如一次性（即从一个数值/水平 直接到下一个数值/水平）提高或降低引起洗脱（即从层析材料回收结合的物 质）的物质的浓度。在此“步式洗脱”中，可以将一种或多种条件，例如pH、 离子强度、盐浓度、和/或层析流动从第一（例如起始）数值至第二（例如最 终）数值一次性全部改变。如此，与线性变化形成对比，条件是增量（即逐 步）变化的。
术语“多元弱阳离子交换层析材料”指固定的高分子量基质，如化学交 联的琼脂糖，其携带在离子交换层析中作为固定相使用的、共价结合的、带 电荷的取代基。为了总体电荷中性，对其结合非共价结合的反荷离子。“多 元弱阳离子交换层析材料”具有用其非共价结合的阳离子反荷离子交换周围 溶液的带类似电荷的离子的能力。“多元弱阳离子交换层析材料”包含共价 结合的配体，其能够施加离子相互作用、疏水相互作用、范德华(van-der-Waals) 相互作用以及与周围溶液中包含的分子形成氢键。
对于本领域技术人员来说，将氨基酸序列（例如多肽的氨基酸序列）转 化成编码此氨基酸序列的相应核酸序列的规程和方法是公知的。因此，核酸 以由个别核苷酸组成的其核酸序列以及同样地以由其编码的多肽的氨基酸 序列为特征。
如本申请内使用的，术语“在适合于结合的条件下”及其语法等同物指 感兴趣的物质（例如抗IGF-1R抗体）在与固定相（例如离子交换材料）接触 时与其结合。这并不必然表示100%的感兴趣物质与固定相是结合的，而是 基本上100%的感兴趣物质是结合的，即至少50%的感兴趣物质是结合的，优 选地至少75%的感兴趣物质是结合的，优选地至少85%的感兴趣物质是结合 的，更优选地至少95%的感兴趣物质是结合的。
术语“抗体”在本文中以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但 不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体）、及 抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。天然存在的抗体是具有不 同结构的分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白， 其由二硫键键合的两条相同的轻链和两条相同的重链构成。从N到C端，每 条重链具有1个可变域(VH)，也称作可变重域或重链可变域，接着是3个或4 个恒定域(CH1,CH2,CH3及任选地CH4)。类似地，从N到C端，每条轻链具 有可变域(VL)，也称作可变轻域或轻链可变域，接着是恒定轻链(CL)域。抗 体的轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列归入两种型，称作卡帕(κ)和拉姆达 (λ)之一。
人胰岛素样生长因子I受体(IGF-IR,EC2.7.112,CD221抗原)属于跨膜蛋 白酪氨酸激酶家族(LeRoith,D.等,Endocrin.Rev.16(1995)143-163;Adams, T.E.等,Cell.Mol.Life Sci.57(2000)1050-1063)。IGF-IR以高亲和力结合 IGF-I，并且在体内启动对此配体的生理学应答。IGF-IR也结合IGF-II，不过 以略低的亲和力结合。IGF-IR过表达促进细胞的新生物转化，并且存在如下 的证据，即IGF-IR牵涉细胞的恶性转化，因此它是一种对于开发供治疗癌症 用的治疗剂的有用靶物(Adams,T.E.等,Cell.Mol.Life Sci.57(2000) 1050-1063)。WO2004/087756、WO2007/045456和WO2007/115814中报告了 例示性的抗IGF-1R抗体、其编码序列及生成方法。
对于例如通过细胞培养方法生成的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的纯 化，一般采用不同层析步骤的组合。通常，蛋白A亲和层析继之以一个至两 个额外的分离步骤。在一个实施方案中，所述额外的层析步骤是阳离子和阴 离子交换层析步骤或反之亦然。最终的纯化步骤是所谓的“精制步骤”，用 于除去痕量的杂质和污染物如聚集的免疫球蛋白、残留的HCP(宿主细胞蛋 白质)、DNA(宿主细胞核酸)、病毒、或内毒素。在一个实施方案中，最终 纯化步骤是流过模式的阴离子交换层析。
已经发现了，多元弱阳离子交换层析材料可以在直接用粗制细胞培养物 培养上清液的柱层析纯化方法中作为第一步使用，替换通常使用的蛋白A亲 和层析。
本文中报告的一个方面是用于生成抗IGF-1R抗体的方法，包括下列步 骤：
a)将粗制哺乳动物细胞培养物培养上清液施加到多元弱阳离子交换层析材 料，
b)通过将含有乙二醇和无机盐的缓冲溶液施加到多元弱阳离子交换层析材 料来回收所述抗IGF-1R抗体，并且由此生成抗IGF-1R抗体。
对于如本文中报告的方法，不需要粗制培养上清液的预条件化 (pre-conditioning)。这是令人惊讶的，因为对于从已经生成不同抗体的培养 物获得的培养上清液，至少需要降低电导率以容许从培养物上清液直接捕捉 抗体。另外，几乎定量地从粗制细胞培养上清液捕捉抗IGF-1R抗体。由于从 阳离子交换层析材料回收多肽的一般可应用条件和通过疏水性相互作用结 合至多元弱阳离子交换层析材料的条件指向相反方向，因此需要从多元弱阳 离子交换层析材料回收抗体的新条件。
在一个实施方案中，所述方法在步骤a)前包括以下额外的步骤a-1)：
a-1)将包含无机盐的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料。
在另一个实施方案中，所述方法在步骤a)后且在步骤b)前包括以下额外 的步骤a-b)：
a-b)将缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料，其中未从所述多元 弱阳离子交换层析材料回收所述抗IGF-1R抗体。
在又一个实施方案中，步骤a-b)包括两个步骤a-b1)和a-b2)：
a-b1)将包含无机盐的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料，并
a-b2)将包含变性剂的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料，
其中未从所述多元弱阳离子交换层析材料回收所述抗IGF-1R抗体。
还在一个实施方案中，所述变性剂选自盐酸胍、尿素和精氨酸。在一个 实施方案中，所述无机盐选自氯化钠、氯化钾和氯化铵。还在一个实施方案 中，步骤b)中的缓冲溶液包含20mM至30mM Tris，1050mM至1350mM氯 化钠，和约20%(w/v)乙二醇，pH值为pH7.1至pH7.3。在一个实施方案中， 步骤a-1)中的缓冲溶液包含20mM至30mM Tris，和80mM至120mM氯化钠， pH值为pH7.1至pH7.3。在别的实施方案中，步骤a-b1)中的缓冲溶液包含20 mM至30mM Tris，和80mM至120mM氯化钠，pH值为pH7.1至pH7.3。在 另一个实施方案中，步骤a-b2)中的缓冲溶液包含110mM至140mM Tris，80 mM至120mM氯化钠，和30mM至40mM精氨酸，pH值为pH7.1至pH7.3。 在又一个实施方案中，所述多元弱阳离子交换层析材料包含交联琼脂糖，该 交联琼脂糖共价附接有含有羧酸、醚、硫醚和芳香族官能团的多元弱阳离子 交换配体。在一个实施方案中，在步骤a-1)中将总体积为5个柱体积的缓冲溶 液施加到多元弱阳离子交换层析材料。在另一个实施方案中，在步骤a-b1) 中将总体积为5个柱体积的缓冲溶液施加到多元弱阳离子交换层析材料。还 在一个实施方案中，在步骤a-b2)中将总体积为10个柱体积的缓冲溶液施加到 多元弱阳离子交换层析材料。在又一个实施方案中，在步骤b)中将总体积为 10个柱体积的缓冲溶液施加到多元弱阳离子交换层析材料。
已经发现了缓冲溶液的各成分具有下列影响：
+：升高；-：降低；0：无影响
提供以下实施例和图以帮助对本发明的理解，其真实范围在所附权利要 求书中列出。理解的是可以在不背离本发明精神的情况中对所列的规程做出 修改。
附图简述
图1实施例1的步骤b)中获得的抗IGF-1R抗体层析洗脱物的分析性大小 排阻层析谱。
图2依照实施例3中指示的条件，用本文中报告的方法获得的抗IGF-1R 抗体的洗脱层析谱。
图3步骤b)中获得的抗IGF-1R抗体层析洗脱物(a)和步骤a-b2)中获得的 洗脱物(b)的分析性大小排阻层析谱。
图4施加包含抗IL13R抗体的粗制培养上清液的洗脱层析谱。
图5施加包含抗IL13R抗体的预条件化培养上清液的洗脱层析谱。
实施例
材料和方法
若没有另外指明，则依照材料制造商手册实施不同方法。
重组DNA技术：
使用标准方法来操作DNA，如记载于Sambrook,J.等,Molecular cloning: A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York,1989的。依照制造商的用法说明书使用分子生物学试剂。
蛋白质测定：
使用基于氨基酸序列计算出的摩尔消光系数通过在320nm参照波长的情 况下测定280nm处的光密度(OD)来测定蛋白质浓度。
大小排阻HPLC：
在ASI-100HPLC系统(Dionex,Idstein,Germany)上用Tosoh Haas TSK 3000SWXL柱进行层析。通过UV二极管阵列检测器(Dionex)在280nm处监测 洗脱峰。在将浓缩样品溶解为1mg/ml后，用由200mM磷酸二氢钾和250mM 氯化钾(pH7.0)组成的缓冲液清洗柱，直到达到稳定的基线。使用0.5ml/分钟 的流速于室温在30分钟里在等度条件下实施分析运行。用Chromeleon (Dionex,Idstein,Germany)手动整合层析谱。
反相HPLC(RP-HPLC)：
通过RP-HPLC分析纯度。使用乙腈/水性TFA梯度，在Poroshell柱上实施 测定法。以215nm处的UV吸光度监测洗脱谱。基于洗脱蛋白质的总峰面积来 计算洗脱物质的百分比。
DNA阈值系统：
参见例如Merrick,H.和Hawlitschek,G.,Biotech Forum Europe9(1992) 398-403。
宿主细胞蛋白质测定：
用血清清蛋白和链霉亲合素的混合物包被微量滴定板的孔壁。使针对 HCP的山羊衍生的多克隆抗体结合至微量滴定板的孔壁。在清洗步骤后，将 微量滴定板的不同孔与不同浓度的HCP校准序列和样品溶液一起温育。在温 育后，通过用缓冲溶液清洗来除去未结合的样品材料。为了检测，将孔与抗 体过氧化物酶缀合物一起温育以检测结合的宿主细胞蛋白质。通过与ABTS 一起温育，并在405nm处检测来检测固定的过氧化物酶活性。
实施例1：在多元弱阳离子交换层析材料CaptoTM MMC上用本文中报告的方 法进行抗IGF-1R抗体的层析
用下列参数实施层析：
树脂： CaptoTM MMC
柱直径： 1cm
床高： 14.6cm
施加的溶液： 粗制细胞培养物上清液
加载： 每ml材料30mg抗体
步骤a-1) 25mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH7.1
步骤a-b1) 25mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH7.1
步骤b) 25mM Tris-HCl,1200mM NaCl,20%(w/v)乙二醇,pH7.2
洗脱方法： 步式洗脱
流速： 250cm/h
在图1中显示了获得的抗体的分析性大小排阻层析谱。
实施例2：在多元弱阳离子交换层析材料CaptoTM MMC上用与本文中所报告 的方法不同的条件进行与实施例1比较的抗IGF-1R抗体层析
用下列参数实施层析：
树脂： CaptoTM MMC
柱直径： 1cm
床高： 14.6cm
施加的溶液： 粗制细胞培养物上清液
加载： 每ml材料30mg抗体
步骤a-1) 25mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH7.1
步骤a-b1) 25mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH7.1
步骤b) 可变，见下表
洗脱方法： 步式洗脱
流速： 250cm/h
通过下文呈现的表，可以看出凭借步骤b)的略微不同的条件，纯化可以 实施得不太有效
实施例3：在多元弱阳离子交换层析材料CaptoTM MMC上用本文中报告的方 法进行抗IGF-1R抗体的层析
用下列参数实施层析：
树脂： CaptoTM MMC
柱直径： 1cm
床高： 14.6cm
施加的溶液： 粗制细胞培养物上清液
加载： 每ml材料30mg抗体
步骤a-1) 25mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH7.1
步骤a-b1) 25mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH7.1
步骤a-b2) 125mM Tris-HCl,100mM NaCl,38mM精氨酸,pH8.7
步骤b) 25mM Tris-HCl,1200mM NaCl,20%(w/v)乙二醇,pH7.2
洗脱方法： 步式洗脱
流速： 250cm/h
在图2中显示了相应的洗脱图，在图3a中显示了步骤b)的分析性大小排阻 层析谱，并且在图3b中显示了步骤a-b2)的分析性大小排阻层析谱。
实施例4：在多元弱阳离子交换层析材料CaptoTM MMC上用与本文中所报告 的方法不同的条件进行与实施例3比较的抗IGF-1R抗体的层析
用下列参数实施层析：
树脂： CaptoTM MMC
柱直径： 1cm
床高： 14.6cm
施加的溶液： 粗制细胞培养物上清液
加载： 每ml材料30mg抗体
步骤a-1) 25mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH7.1
步骤a-b1) 25mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH7.1
步骤a-b2) 可变，见下表
步骤b) 25mM Tris-HCl,1200mM NaCl,20%(w/v)乙二醇,pH7.2
洗脱方法： 步式洗脱
流速： 250cm/h
通过下文呈现的表，可以看出凭借步骤b)的略微不同条件，纯化可以实 施得不太有效。
实施例5：比较例-在没有预条件化粗制培养上清液的情况中的抗IL13R抗体
用下列参数实施层析：
树脂： CaptoTM MMC
柱直径： 1cm
床高： 10cm
施加的溶液： 粗制细胞培养上清液
加载： 每ml材料21mg抗体
步骤a-1) 70mM磷酸钾,pH7.3,10.9mS/cm
步骤a-b) 70mM磷酸钾,pH7.3,10.9mS/cm
步骤b) 1M KCl,pH3.0,105.6mS/cm
洗脱方法： 步式洗脱
流速： 150cm/h
88%的施加抗体没有结合至层析材料，并且在流过物中找到(图4)。
实施例6：比较例-在预条件化粗制培养上清液的情况中的抗IL13R抗体
用下列参数实施层析：
树脂： CaptoTM MMC
柱直径： 1cm
床高： 11cm
施加的溶液： 调节为1.4mS/cm的细胞培养上清液
加载： 每ml材料20mg抗体
步骤a-1) 10mM磷酸钾,pH6.5,1.4mS/cm
步骤a-b) 10mM磷酸钾,pH6.5,1.4mS/cm
步骤b) 100mM磷酸钾,pH7.5,14.9mS/cm
洗脱方法： 步式洗脱
流速： 150cm/h
在层析谱(图5)中，可以看到一个尖峰。获得的抗体具有96.6%的纯度及 68%的产率。