通过混合模式层析捕捉抗体的优化方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 103201288 A (43)申请公布日 2013.07.10 CN 103201288 A *CN103201288A* (21)申请号 201180053110.9 (22)申请日 2011.11.02 10190192.4 2010.11.05 EP C07K 16/06(2006.01) C07K 16/28(2006.01) (71)申请人 霍夫曼 - 拉罗奇有限公司 地址 瑞士巴塞尔 (72)发明人 山田秀成 R. 法尔肯斯坦 T. 莱姆 M. 斯特拉瑟 (74)专利代理机构 北京市柳沈律师事务所 11105 代理人 岑晓东 (54) 发明名称 通过混合

2、模式层析捕捉抗体的优化方法 (57) 摘要 本文中报告了使用 Streamline CST 和 / 或 Capto MMC 来纯化从经过澄清的细胞培养物上清 液直接捕获的抗体的方法， 其中尤其能有效除去 产物相关 （聚集物和片段） 和工艺相关杂质 （宿主 细胞蛋白质、 培养基组分） ， 从而得到纯度与经典 的蛋白 A 亲和层析相当的制备物。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2013.05.03 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2011/069202 2011.11.02 (87)PCT申请的公布数据 WO2012/059495 EN 2012.05.10 (51

3、)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103201288 A CN 103201288 A *CN103201288A* 1/1 页 2 1. 一种用于生成抗 IGF-1R 抗体的方法， 包括下列步骤 ： a) 将粗制哺乳动物细胞培养物培养上清液施加到多元弱阳离子交换层析材料， b) 通过将包含乙二醇和无机盐的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料来 回收所述抗 IGF-1R 抗体， 并且由此生成抗 IGF-1R 抗体。 2. 依照权

4、利要求 1 的方法， 其特征在于所述方法在步骤 a) 前包括以下额外的步骤 a-1) ： a-1) 将包含无机盐的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料。 3. 依照前述权利要求中任一项的方法， 其特征在于所述方法在步骤 a) 后且在步骤 b) 前包括以下额外的步骤 a-b) ： a-b) 将缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料， 其中未从所述多元弱阳离子 交换层析材料回收所述抗 IGF-1R 抗体。 4. 依照权利要求 3 的方法， 其特征在于所述步骤 a-b) 包括两个步骤 a-b1) 和 a-b2) ： a-b1) 将包含无机盐的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料， 并

5、 a-b2) 将包含变性剂的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料， 其中未从所述多元弱阳离子交换层析材料回收所述抗 IGF-1R 抗体。 5. 依照前述权利要求中任一项的方法， 其特征在于所述变性剂选自盐酸胍和尿素。 6. 依照前述权利要求中任一项的方法， 其特征在于所述无机盐选自氯化钠、 氯化钾和 氯化铵。 7. 依照前述权利要求中任一项的方法， 其特征在于步骤 b) 中的缓冲溶液包含 20mM 至 30mM Tris， 1050mM 至 1350mM 氯化钠， 和约 20%(w/v) 乙二醇， pH 值为 pH7.1 至 pH7.3。 8. 依照权利要求 2-7 中任一项的方法， 其

6、特征在于步骤 a-1) 中的缓冲溶液包含 20mM 至 30mM Tris， 和 80mM 至 120mM 氯化钠， pH 值为 pH7.1 至 pH7.3。 9. 依照权利要求 4-8 中任一项的方法， 其特征在于步骤 a-b1) 中的缓冲溶液包含 20mM 至 30mM Tris， 和 80mM 至 120mM 氯化钠， pH 值为 pH7.1 至 pH7.3。 10. 依照权利要求 4-9 中任一项的方法， 其特征在于步骤 a-b2) 中的缓冲溶液包含 110mM至140mM Tris， 80mM至120mM氯化钠， 和30mM至40mM精氨酸， pH值为pH7.1至pH7.3。 11.

7、 依照前述权利要求中任一项的方法， 其特征在于所述多元弱阳离子交换层析材料 包含交联琼脂糖， 该交联琼脂糖共价附接有含有羧酸、 醚、 硫醚和芳香族官能团的多元弱阳 离子交换配体。 权 利 要 求 书 CN 103201288 A 2 1/10 页 3 通过混合模式层析捕捉抗体的优化方法 0001 本文中报告了使用 Streamline CST 和 / 或 Capto MMC 来纯化从经过澄清的细胞 培养物上清液直接捕获的抗体的方法， 其中尤其能有效除去产物相关 （聚集物和片段） 和工 艺相关杂质 （宿主细胞蛋白质、 DNA、 培养基组分） ， 从而得到纯度与经典的蛋白A亲和层析相 当的制备物。

8、 0002 发明背景 0003 蛋白 A 层析由于其高选择性而常规用作产业单克隆抗体纯化工艺的第一捕捉步 骤， 产生良好的总体产量和纯度。然而， 此亲和层析的一个主要缺点是其较高的价格， 这尤 其在以高剂量需要的治疗性抗体的情况中和 / 或对于长期施用可以造成相当大的商品成 本因素。另外， 自亲和基质浸出的蛋白 A 配体由于其潜在的免疫原性而必须通过进一步的 层析步骤除去。 0004 在展现离子和疏水性官能度的多元树脂上的混合模式层析可以为经典亲和方法 提供有价值的备选。 由于疏水性成分的盐可容许性， 在大多数情况下， 将澄清的细胞培养物 上清液在基质上直接加载是有可能的， 产生对单克隆抗体的

9、有效捕获。 然而， 由于树脂的多 元性质， 配体与特定单克隆抗体的不同类型的相互作用是有可能的， 从而需要与传统的离 子交换或疏水性相互作用层析不同的独特清洗和洗脱条件。 0005 在 WO2010/080062 中， 报 告 了 使 用 单 一 聚 合 物 相 系 统 的 分 离 方 法。 在 WO2008/073620 中报告了用于生产在昆虫细胞系中表达的多肽的制备方法。 0006 发明概述 0007 已经发现了多元弱阳离子交换层析材料可以在直接用粗制细胞培养物培养上清 液的柱层析纯化方法中作为第一步使用。 0008 本文中报告的一个方面是用于生成抗 IGF-1R 抗体的方法， 包括下列步

10、骤 ： 0009 a) 将粗制哺乳动物细胞培养物培养上清液施加到多元弱阳离子交换层析材料， 0010 b) 通过将包含乙二醇和无机盐的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材 料来回收所述抗 IGF-1R 抗体， 并且由此生成抗 IGF-1R 抗体。 0011 在一个实施方案中， 所述方法在步骤 a) 前包括以下额外的步骤 a-1) ： 0012 a-1) 将包含无机盐的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料。 0013 在一个实施方案中， 所述方法在步骤 a) 后且在步骤 b) 前包括以下额外的步骤 a-b) ： 0014 a-b) 将缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料， 其中未

11、从所述多元弱阳 离子交换层析材料回收所述抗 IGF-1R 抗体。 0015 在一个实施方案中， 所述步骤 a-b) 包括两个步骤 a-b1) 和 a-b2) ： 0016 a-b1) 将包含无机盐的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料， 并 0017 a-b2) 将包含变性剂的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料， 0018 其中未从所述多元弱阳离子交换层析材料回收所述抗 IGF-1R 抗体。 0019 在一个实施方案中， 所述变性剂选自盐酸胍和尿素。 0020 在一个实施方案中， 所述无机盐选自氯化钠、 氯化钾和氯化铵。 说 明 书 CN 103201288 A 3 2/10 页

12、 4 0021 在一个实施方案中， 步骤 b) 中的缓冲溶液包含 20mM 至 30mM Tris， 1050mM 至 1350mM 氯化钠， 和约 20%(w/v) 乙二醇， pH 值为 pH7.1 至 pH7.3。 0022 在一个实施方案中， 步骤 a-1) 中的缓冲溶液包含 20mM 至 30mM Tris， 和 80mM 至 120mM 氯化钠， pH 值为 pH7.1 至 pH7.3。在一个实施方案中， 步骤 a-b1) 中的缓冲溶液包含 20mM 至 30mM Tris， 和 80mM 至 120mM 氯化钠， pH 值为 pH7.1 至 pH7.3。在一个实施方案中， 步骤 a

13、-b2) 中的缓冲溶液包含 110mM 至 140mM Tris， 80mM 至 120mM 氯化钠， 和 30mM 至 40mM 精氨酸， pH 值为 pH7.1 至 pH7.3。 0023 在一个实施方案中， 所述多元弱阳离子交换层析材料包含交联琼脂糖， 该交联琼 脂糖共价附接有含有羧酸、 醚、 硫醚和芳香族官能团的多元弱阳离子交换配体。 0024 发明详述 0025 本文中报告了使用Streamline CST和/或Capto MMC来纯化从澄清的细胞培养物 上清液捕获的单克隆抗体的方法， 包括洗脱和清洗的优化条件。尤其可以有效除去产物相 关 ( 聚集物和片段 ) 和工艺相关杂质 ( 宿

14、主蛋白质、 培养基成分 )， 从而得到纯度与经典的 亲和层析相当的制备物。如此， 凭借本文中报告的方法， 可以替换经典的蛋白 A 亲和层析。 0026 在一个实施方案中， 所述方法不包括蛋白 A 亲和层析步骤。 0027 通用层析方法及其用途是本领域中技术人员已知的。参见例如 Chromatography, 第 5 版 ,A 部分 :Fundamentals and Techniques,Heftmann,E.( 编 ),Elsevier Science Publishing Company,New York,(1992);Advanced Chromatographic and Electr

15、omigration Methods in Biosciences,Deyl,Z.( 编 ),Elsevier Science BV,Amsterdam,The Netherlands,(1998);Chromatography Today,Poole,C.F. 和 Poole,S.K.,Elsevier Science Publishing Company,New York,(1991);Scopes,Protein Purification:Principles and Practice(1982);Sambrook,J. 等 ( 编 ),Molecular Cloning:A Labor

16、atory Manual, 第 2 版 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989; 或 Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,F. M. 等 ( 编 ),John WileyAdams,T.E. 等 ,Cell. Mol.Life Sci.57(2000)1050-1063)。IGF-IR 以高亲和力结合 IGF-I， 并且在体内启动对 此配体的生理学应答。IGF-IR 也结合 IGF-II， 不过以略低的亲和力结合。IGF-IR 过表 达促进细胞的

17、新生物转化， 并且存在如下的证据， 即 IGF-IR 牵涉细胞的恶性转化， 因此 它是一种对于开发供治疗癌症用的治疗剂的有用靶物 (Adams,T.E. 等 ,Cell.Mol.Life Sci.57(2000)1050-1063)。WO2004/087756、 WO2007/045456 和 WO2007/115814 中报告了例 示性的抗 IGF-1R 抗体、 其编码序列及生成方法。 0038 对于例如通过细胞培养方法生成的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的纯化， 一般采 用不同层析步骤的组合。通常， 蛋白 A 亲和层析继之以一个至两个额外的分离步骤。在一 个实施方案中， 所述额外的层析步骤是阳

18、离子和阴离子交换层析步骤或反之亦然。最终的 纯化步骤是所谓的 “精制步骤” ， 用于除去痕量的杂质和污染物如聚集的免疫球蛋白、 残留 的 HCP( 宿主细胞蛋白质 )、 DNA( 宿主细胞核酸 )、 病毒、 或内毒素。在一个实施方案中， 最 终纯化步骤是流过模式的阴离子交换层析。 0039 已经发现了， 多元弱阳离子交换层析材料可以在直接用粗制细胞培养物培养上清 液的柱层析纯化方法中作为第一步使用， 替换通常使用的蛋白 A 亲和层析。 0040 本文中报告的一个方面是用于生成抗 IGF-1R 抗体的方法， 包括下列步骤 ： 0041 a) 将粗制哺乳动物细胞培养物培养上清液施加到多元弱阳离子交

19、换层析材料， 0042 b) 通过将含有乙二醇和无机盐的缓冲溶液施加到多元弱阳离子交换层析材料来 回收所述抗 IGF-1R 抗体， 并且由此生成抗 IGF-1R 抗体。 0043 对 于 如 本 文 中 报 告 的 方 法，不 需 要 粗 制 培 养 上 清 液 的 预 条 件 化 (pre-conditioning)。这是令人惊讶的， 因为对于从已经生成不同抗体的培养物获得的培 养上清液， 至少需要降低电导率以容许从培养物上清液直接捕捉抗体。 另外， 几乎定量地从 粗制细胞培养上清液捕捉抗 IGF-1R 抗体。由于从阳离子交换层析材料回收多肽的一般可 应用条件和通过疏水性相互作用结合至多元弱

20、阳离子交换层析材料的条件指向相反方向， 因此需要从多元弱阳离子交换层析材料回收抗体的新条件。 0044 在一个实施方案中， 所述方法在步骤 a) 前包括以下额外的步骤 a-1) ： 0045 a-1) 将包含无机盐的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料。 0046 在另一个实施方案中， 所述方法在步骤 a) 后且在步骤 b) 前包括以下额外的步骤 a-b) ： 0047 a-b) 将缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料， 其中未从所述多元弱阳 离子交换层析材料回收所述抗 IGF-1R 抗体。 0048 在又一个实施方案中， 步骤 a-b) 包括两个步骤 a-b1) 和 a-b2)

21、： 0049 a-b1) 将包含无机盐的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料， 并 0050 a-b2) 将包含变性剂的缓冲溶液施加到所述多元弱阳离子交换层析材料， 0051 其中未从所述多元弱阳离子交换层析材料回收所述抗 IGF-1R 抗体。 0052 还在一个实施方案中， 所述变性剂选自盐酸胍、 尿素和精氨酸。在一个实施方案 说 明 书 CN 103201288 A 6 5/10 页 7 中， 所述无机盐选自氯化钠、 氯化钾和氯化铵。还在一个实施方案中， 步骤 b) 中的缓冲溶液 包含 20mM 至 30mM Tris， 1050mM 至 1350mM 氯化钠， 和约 20%(w/v

22、) 乙二醇， pH 值为 pH7.1 至 pH7.3。在一个实施方案中， 步骤 a-1) 中的缓冲溶液包含 20mM 至 30mM Tris， 和 80mM 至 120mM 氯化钠， pH 值为 pH7.1 至 pH7.3。在别的实施方案中， 步骤 a-b1) 中的缓冲溶液包含 20mM 至 30mM Tris， 和 80mM 至 120mM 氯化钠， pH 值为 pH7.1 至 pH7.3。在另一个实施方案 中， 步骤 a-b2) 中的缓冲溶液包含 110mM 至 140mM Tris， 80mM 至 120mM 氯化钠， 和 30mM 至 40mM精氨酸， pH值为pH7.1至pH7.3。

23、 在又一个实施方案中， 所述多元弱阳离子交换层析材 料包含交联琼脂糖， 该交联琼脂糖共价附接有含有羧酸、 醚、 硫醚和芳香族官能团的多元弱 阳离子交换配体。在一个实施方案中， 在步骤 a-1) 中将总体积为 5 个柱体积的缓冲溶液施 加到多元弱阳离子交换层析材料。在另一个实施方案中， 在步骤 a-b1) 中将总体积为 5 个 柱体积的缓冲溶液施加到多元弱阳离子交换层析材料。 还在一个实施方案中， 在步骤a-b2) 中将总体积为 10 个柱体积的缓冲溶液施加到多元弱阳离子交换层析材料。在又一个实施 方案中， 在步骤 b) 中将总体积为 10 个柱体积的缓冲溶液施加到多元弱阳离子交换层析材 料。

24、0053 已经发现了缓冲溶液的各成分具有下列影响 ： 0054 0055 + ： 升高 ； - ： 降低 ； 0 ： 无影响 0056 提供以下实施例和图以帮助对本发明的理解， 其真实范围在所附权利要求书中列 出。理解的是可以在不背离本发明精神的情况中对所列的规程做出修改。 0057 附图简述 0058 图 1 实施例 1 的步骤 b) 中获得的抗 IGF-1R 抗体层析洗脱物的分析性大小排阻层 析谱。 0059 图 2 依照实施例 3 中指示的条件， 用本文中报告的方法获得的抗 IGF-1R 抗体的洗 脱层析谱。 0060 图 3 步骤 b) 中获得的抗 IGF-1R 抗体层析洗脱物 (a)

25、 和步骤 a-b2) 中获得的洗脱 物 (b) 的分析性大小排阻层析谱。 0061 图 4 施加包含抗 IL13R 抗体的粗制培养上清液的洗脱层析谱。 0062 图 5 施加包含抗 IL13R 抗体的预条件化培养上清液的洗脱层析谱。 实施例 说 明 书 CN 103201288 A 7 6/10 页 8 0063 材料和方法 0064 若没有另外指明， 则依照材料制造商手册实施不同方法。 0065 重组 DNA 技术 ： 0066 使用标准方法来操作 DNA， 如记载于 Sambrook,J. 等 ,Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spri

26、ng Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989 的。依照制造商的用法说明书使用分子生物学试剂。 0067 蛋白质测定 ： 0068 使用基于氨基酸序列计算出的摩尔消光系数通过在 320nm 参照波长的情况下测 定 280nm 处的光密度 (OD) 来测定蛋白质浓度。 0069 大小排阻 HPLC ： 0070 在 ASI-100HPLC 系统 (Dionex,Idstein,Germany) 上用 Tosoh Haas TSK3000SWXL 柱进行层析。通过 UV 二极管阵列检测器 (Dionex) 在 280nm 处监

27、测洗脱峰。在将浓缩样品 溶解为 1mg/ml 后， 用由 200mM 磷酸二氢钾和 250mM 氯化钾 (pH7.0) 组成的缓冲液清洗柱， 直到达到稳定的基线。使用 0.5ml/ 分钟的流速于室温在 30 分钟里在等度条件下实施分析 运行。用 Chromeleon(Dionex,Idstein,Germany) 手动整合层析谱。 0071 反相 HPLC(RP-HPLC) ： 0072 通过 RP-HPLC 分析纯度。使用乙腈 / 水性 TFA 梯度， 在 Poroshell 柱上实施测定 法。以 215nm 处的 UV 吸光度监测洗脱谱。基于洗脱蛋白质的总峰面积来计算洗脱物质的 百分比。

28、0073 DNA 阈值系统 ： 0074 参见例如 Merrick,H. 和 Hawlitschek,G.,Biotech Forum Europe9(1992)398-403。 0075 宿主细胞蛋白质测定 ： 0076 用血清清蛋白和链霉亲合素的混合物包被微量滴定板的孔壁。使针对 HCP 的山羊 衍生的多克隆抗体结合至微量滴定板的孔壁。在清洗步骤后， 将微量滴定板的不同孔与不 同浓度的 HCP 校准序列和样品溶液一起温育。在温育后， 通过用缓冲溶液清洗来除去未结 合的样品材料。为了检测， 将孔与抗体过氧化物酶缀合物一起温育以检测结合的宿主细胞 蛋白质。通过与 ABTS 一起温育， 并在 4

29、05nm 处检测来检测固定的过氧化物酶活性。 0077 实施例1 ： 在多元弱阳离子交换层析材料CaptoTM MMC上用本文中报告的方法进行 抗 IGF-1R 抗体的层析 0078 用下列参数实施层析 ： 0079 树脂 ： CaptoTM MMC 0080 柱直径 ： 1cm 0081 床高 ： 14.6cm 0082 施加的溶液 ： 粗制细胞培养物上清液 0083 加载 ： 每 ml 材料 30mg 抗体 0084 步骤 a-1) 25mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH7.1 0085 步骤 a-b1) 25mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH7.1 008

30、6 步骤 b) 25mM Tris-HCl,1200mM NaCl,20%(w/v) 乙二醇 ,pH7.2 说 明 书 CN 103201288 A 8 7/10 页 9 0087 洗脱方法 ： 步式洗脱 0088 流速 ： 250cm/h 0089 在图 1 中显示了获得的抗体的分析性大小排阻层析谱。 0090 0091 实施例2 ： 在多元弱阳离子交换层析材料CaptoTM MMC上用与本文中所报告的方法 不同的条件进行与实施例 1 比较的抗 IGF-1R 抗体层析 0092 用下列参数实施层析 ： 0093 树脂 ： CaptoTM MMC 0094 柱直径 ： 1cm 0095 床高

31、： 14.6cm 0096 施加的溶液 ： 粗制细胞培养物上清液 0097 加载 ： 每 ml 材料 30mg 抗体 0098 步骤 a-1) 25mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH7.1 0099 步骤 a-b1) 25mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH7.1 0100 步骤 b) 可变， 见下表 0101 洗脱方法 ： 步式洗脱 0102 流速 ： 250cm/h 0103 通过下文呈现的表， 可以看出凭借步骤 b) 的略微不同的条件， 纯化可以实施得不 太有效 0104 说 明 书 CN 103201288 A 9 8/10 页 10 0105 实施例3

32、： 在多元弱阳离子交换层析材料CaptoTM MMC上用本文中报告的方法进行 抗 IGF-1R 抗体的层析 0106 用下列参数实施层析 ： 0107 树脂 ： CaptoTM MMC 0108 柱直径 ： 1cm 0109 床高 ： 14.6cm 0110 施加的溶液 ： 粗制细胞培养物上清液 0111 加载 ： 每 ml 材料 30mg 抗体 0112 步骤 a-1) 25mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH7.1 0113 步骤 a-b1) 25mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH7.1 0114 步骤 a-b2) 125mM Tris-HCl,100mM N

33、aCl,38mM 精氨酸 ,pH8.7 0115 步骤 b) 25mM Tris-HCl,1200mM NaCl,20%(w/v) 乙二醇 ,pH7.2 0116 洗脱方法 ： 步式洗脱 0117 流速 ： 250cm/h 0118 在图 2 中显示了相应的洗脱图， 在图 3a 中显示了步骤 b) 的分析性大小排阻层析 谱， 并且在图 3b 中显示了步骤 a-b2) 的分析性大小排阻层析谱。 0119 0120 实施例4 ： 在多元弱阳离子交换层析材料CaptoTM MMC上用与本文中所报告的方法 不同的条件进行与实施例 3 比较的抗 IGF-1R 抗体的层析 0121 用下列参数实施层析 ：

34、 0122 树脂 ： CaptoTM MMC 0123 柱直径 ： 1cm 0124 床高 ： 14.6cm 0125 施加的溶液 ： 粗制细胞培养物上清液 0126 加载 ： 每 ml 材料 30mg 抗体 0127 步骤 a-1) 25mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH7.1 0128 步骤 a-b1) 25mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH7.1 0129 步骤 a-b2) 可变， 见下表 0130 步骤 b) 25mM Tris-HCl,1200mM NaCl,20%(w/v) 乙二醇 ,pH7.2 0131 洗脱方法 ： 步式洗脱 0132 流速 ：

35、250cm/h 0133 通过下文呈现的表， 可以看出凭借步骤 b) 的略微不同条件， 纯化可以实施得不太 有效。 说 明 书 CN 103201288 A 10 9/10 页 11 0134 0135 0136 实施例 5 ： 比较例 - 在没有预条件化粗制培养上清液的情况中的抗 IL13R 抗体 0137 用下列参数实施层析 ： 0138 树脂 ： CaptoTM MMC 0139 柱直径 ： 1cm 0140 床高 ： 10cm 0141 施加的溶液 ： 粗制细胞培养上清液 0142 加载 ： 每 ml 材料 21mg 抗体 0143 步骤 a-1) 70mM 磷酸钾 ,pH7.3,10

36、.9mS/cm 0144 步骤 a-b) 70mM 磷酸钾 ,pH7.3,10.9mS/cm 0145 步骤 b) 1M KCl,pH3.0,105.6mS/cm 0146 洗脱方法 ： 步式洗脱 0147 流速 ： 150cm/h 0148 88% 的施加抗体没有结合至层析材料， 并且在流过物中找到 ( 图 4)。 0149 实施例 6 ： 比较例 - 在预条件化粗制培养上清液的情况中的抗 IL13R 抗体 0150 用下列参数实施层析 ： 0151 树脂 ： CaptoTM MMC 0152 柱直径 ： 1cm 0153 床高 ： 11cm 0154 施加的溶液 ： 调节为 1.4mS/c

37、m 的细胞培养上清液 说 明 书 CN 103201288 A 11 10/10 页 12 0155 加载 ： 每 ml 材料 20mg 抗体 0156 步骤 a-1) 10mM 磷酸钾 ,pH6.5,1.4mS/cm 0157 步骤 a-b) 10mM 磷酸钾 ,pH6.5,1.4mS/cm 0158 步骤 b) 100mM 磷酸钾 ,pH7.5,14.9mS/cm 0159 洗脱方法 ： 步式洗脱 0160 流速 ： 150cm/h 0161 在层析谱 ( 图 5) 中， 可以看到一个尖峰。获得的抗体具有 96.6% 的纯度及 68% 的 产率。 说 明 书 CN 103201288 A 12 1/4 页 13 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103201288 A 13 2/4 页 14 图 3 说 明 书 附 图 CN 103201288 A 14 3/4 页 15 图 4 说 明 书 附 图 CN 103201288 A 15 4/4 页 16 图 5 说 明 书 附 图 CN 103201288 A 16