技术领域
本发明属于微囊化细胞培养技术领域，具体涉及一种脱乙酰几丁质/羧甲基 纤维素干细胞微囊及制备培养方法。
背景技术
微胶囊本身是一种把分散的固体物质、液滴或气体包封在一层致密膜中形 成的包覆体复合结构，用于包覆的致密膜通常是由天然或合成高分子材料制成。 由于其具有上述包覆的微囊按结构，其功能应用中可以将酶、辅酶、蛋白质等 生物大分子或动植物细胞包围在珠状的微囊里，而小分子的物质、培养基的营 养物质可以自由出入半透膜，达到便于催化或培养的目的，所以微囊经常被用 于细胞三维培养，即微囊化细胞培养。
微囊化细胞培养中采用微囊的亲水性半透膜将细胞包围在珠状的微囊里， 细胞不会溢出，同时小分子物质及营养物质可以自由出入半透膜；囊内用作为 细胞的培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故相比其他的微珠 载体、支架等常规的三维培养方式细胞生长好、密度高。
目前微囊化细胞培养中，包膜材料最通常采用的是海藻酸钠/聚赖氨酸微胶 囊；其中，海藻酸钠是属于从海洋的褐藻中提取的直链阴离子多糖，具有良好 的生物相容性，并且其分子结构孔隙和稳定性都比较好，所以其在具有力学骨 架长期稳定优势的条件下，非常适合于被用作微囊的半透膜骨架，既具有良好 的生物相容性，又能保持良好的通透性。聚赖氨酸是人工合成的阳离子聚合物， 在水相中与阴离子海藻酸钠混合时，两者的阴、阳离子发生快速反应交联成厚 约20～100μm半透膜的微胶囊。
但是，上述海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊在用作为药物缓释、靶向释放控制、 或者是一些活性成分保护中，基本上能较好地满足使用的要求。但是在作为干 细胞培养载体使用时，海藻酸钠与聚赖氨酸之间的阴、阳离子化学结合，易被 培养液成分破坏而导致包膜破碎，并且还容易引起微囊周纤维化反应。因此微 囊内不能形成较好的细胞生长环境，细胞培养扩增效率较低、形成的凝胶珠硬 度较高，不利于干细胞的培养。
发明内容
本发明实施的目的在于克服现有海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊的缺陷，提供一 种脱乙酰几丁质/羧甲基纤维素干细胞微囊及其制备和培养方法。
为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
一种脱乙酰几丁质/羧甲基纤维素干细胞微囊的制备方法，方法步骤包括：
获取羧甲基纤维素和脱乙酰几丁质；
将所述羧甲基纤维素用质量体积分数1～2％的醋酸分散后，加入至CaCl2溶液中进行凝胶化，形成羧甲基纤维素凝胶；
将所述脱乙酰几丁质用醋酸盐缓冲液分散后，再加入待培养的干细胞，制 成脱乙酰几丁质和细胞的混合悬液；
将所述混合悬液加入至羧甲基纤维素凝胶中进行凝聚交联，并将凝聚交联 后的得到微囊用柠檬酸钠溶液进行浸泡处理。
本发明进一步还提出采用上述方法直接制备得到的脱乙酰几丁质/羧甲基 纤维素干细胞微囊。
本发明相比海藻酸钠/聚赖氨酸的微囊，以脱乙酰几丁质和羧甲基纤维素作 为壁材，通过复凝聚法形成通透性和分散性比较均一的微囊包膜。先通过异种 电荷静电吸附结合，同时脱乙酰几丁质的吸附能力也增强了形成包膜的稳定性 和强度。并且，这两者分子结构上都是经过基团修饰的分子聚合物，都具有非 常多的氨基、醚键等活性结构，在结合之后包膜分子内部还能进一步增加更多 的氢键及分子间作用力；所以在原有静电结合的基础上，能够形成更加复杂的 分子结构，大大增强了包膜的抗机械、耐热等方面的性能，在浸滞于培养液中 进行细胞培养时，相对能提供更加稳定的细胞生长环境。使最终形成的包膜比 海藻酸钠与聚赖氨酸之间的阴、阳离子化学结合要强得多；并且两者都是聚合 多糖，相互之间融合性较为优良，不会形成微囊周纤维化反应。
同时，本发明还提出用上述微囊进行细胞培养的方法，方法过程包括：将 脱乙酰几丁质/羧甲基纤维素干细胞微囊于培养容器中进行大量培养。
采用本发明的上述培养方法，细胞具有更好的生长和代谢的环境，微囊包 膜具有良好的溶胀、缩胀等性能，用于细胞培养时其透性和稳定性上更好一些， 能形成较好的细胞生长环境，提升细胞培养扩增的效率。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实例提出一种脱乙酰几丁质/羧甲基纤维素干细胞微囊的制备方法， 步骤包括：
S10，获取羧甲基纤维素和脱乙酰几丁质；
S20，将羧甲基纤维素用1～2％的醋酸分散，制成羧甲基纤维素溶液，并加 入至CaCl2溶液中进行凝胶化，形成羧甲基纤维素凝胶；
S30，将脱乙酰几丁质用醋酸盐缓冲液分散后，再加入待培养的干细胞，制 成脱乙酰几丁质和细胞的混合悬液；
S40，将脱乙酰几丁质和细胞的混合悬液加入至羧甲基纤维素凝胶中进行凝 聚交联，并将交联后的得到微球置于柠檬酸钠溶液中进行浸滞处理，即可得到 本发明的脱乙酰几丁质/羧甲基纤维素干细胞微囊。
本发明相比海藻酸钠/聚赖氨酸的微囊，以脱乙酰几丁质和羧甲基纤维素作 为壁材，通过复凝聚法形成通透性和分散性比较均一的微囊包膜。脱乙酰几丁 质是将几丁质进行脱乙酰基后形成的，是具有大量正电荷基团的的动物纤维素； 其结构与植物纤维素非常相似，都是六碳糖的多聚体，分子量都在100万以上； 并且由于它的分子结构中带有不饱和的阳离子基团，因而对带负电荷的同类物 质具有强大的吸附作用；羧甲基纤维素是纤维素醚化(羧甲基化反应是醚化技 术的一种)之后形成的阴离子型纤维素醚，具有较高的取代度和取代均匀度； 由于两者分别带有不同的电性，可以先通过异种电荷静电吸附结合，并且脱乙 酰几丁质的吸附能力也增强了形成包膜的稳定性和强度。
并且，这两者分子结构上都是经过基团修饰的分子聚合物，都具有非常多 的氨基、醚键等活性结构，在结合之后包膜分子内部还能进一步增加更多的氢 键及分子间作用力；所以原有静电结合的基础上，能够形成更加复杂的分子结 构，大大增强了包膜的抗机械、耐热等方面的性能，在浸滞于培养液中进行细 胞培养时，相对能提供更加稳定的细胞生长环境。因此，最终形成的包膜比海 藻酸钠与聚赖氨酸之间的阴、阳离子化学结合要强得多；并且两者都是聚合多 糖，相互之间融合性较为优良，不会形成微囊周纤维化反应。
基于本案中优选的实施方式中，上述步骤S10中获取的物料中，脱乙酰几 丁质采用脱乙酰度90％以上的脱乙酰几丁质进行，除了在可溶性上比较好之外， 更主要地是不饱和阳性基团密度更大一些，这样相比吸附性更强一些。
同时步骤S20中对羧甲基纤维素用Ca2+进行凝胶化的过程中，离子强度除 了会影响凝聚的程度之外，Ca2+本身还有促进羧甲基纤维素和脱乙酰几丁质之 间交联结合的功能；如果浓度进一步增大，后续形成的微囊包膜的硬度比较大， 缩胀性能和韧性不足，会影响微囊的品质。所以在实施的过程中，按照形成羧 甲基纤维素凝胶中质量体积分数1～3％的CaCl2浓度进行，比如要制备100mL 的羧甲基纤维素凝胶液，可以采用50mL的1～2％的醋酸分散羧甲基纤维素，另 用50mL制备质量体积分数2～6％的CaCl2，然后将这两者混合，混合之后形成 凝胶原液，凝胶原液中CaCl2终浓度则为所要求的1～3％质量体积分数。
在制备的过程中，步骤S40中的羧甲基纤维素已经是凝胶的形态，所以细 胞悬液的加入不能采用表面滴加的方式进行，而只能采用针头注射的方式进行。 通过注射针头将悬液加入至凝胶内，那么在接触的表面上两者结合之后就会相 互结合并固化形成包膜。
同时，进一步为了保证形成微囊之后，细胞能具有相对比较适合的生长和 扩增的能力，步骤S30制备的混合悬液中优选细胞与脱乙酰几丁质的混合悬液 中干细胞的浓度控制0.5～2×107个/mL。微囊内包覆的细胞密度过低，在培养的 过程中比较难以快速生长增殖；而如果过高，本身微囊内的空间有限，细胞之 间的空间和养料竞争加剧，位置处于竞争性劣势的细胞一旦出现凋亡，也会诱 发其他正常细胞的凋亡，所以尽量使微囊内的细胞处于比较适合的浓度范围， 空间和养料获取都处于比较均一的程度，更利于细胞的培养。
进一步出于形成包膜的品质，如果步骤S40中采用针头注射的方式将干细 胞与脱乙酰几丁质的混合悬液加入至羧甲基纤维素凝胶中，那么注射的速率均 匀，因为注射的快慢都会影响表面包膜形成的品质和稳定性。并且，出于上述 两者在电性吸附下凝胶化形成微囊品质的立意，步骤S30配置的干细胞与脱乙 酰几丁质的混合悬液中，脱乙酰几丁质的质量体积浓度为0.5～2％；对应步骤 S20配置羧甲基纤维素凝胶中，羧甲基纤维素浓度为0.5～2％(w/v)。注射的 过程中，尽量保证针头位置始终与装羧甲基纤维素凝胶的容器口持平，使混合 悬液匀速注射加入。待反应10min后，注射滴入的悬液表面即交联形成了微囊。
并且，羧甲基纤维素和脱乙酰几丁质这两者的水溶性上不足，在步骤S20 中采用羧甲基纤维素的分散系为体积分数1～2％的醋酸；而脱乙酰几丁质用醋 酸盐缓冲液进行分散，醋酸盐缓冲液用0.2％的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.75) 即可。或者在使用中，可以稍微改变提升采用pH更高的醋酸-醋酸钠缓冲液， 这样或许可以更能避免酸性环形对细胞造成损伤。
同时在上述实施的过程中，步骤S40的过程在实施中，首先进行凝聚交联 形成包膜包覆的微囊，但是所得到的微囊其表面上被羧甲基纤维素凝胶所包覆。 这样细胞微囊无法直接进行培养；因此步骤S40中在凝聚10min(或者可以适 当延长时间)之后，将获得的微囊置于柠檬酸钠溶液中进行浸滞，一方面是为 了使表面包覆的羧甲基纤维素凝胶被液化去除，另一方面能促进包膜分子之间 氢键和分子间作用的形成，促进包膜稳定结构的成熟。并且采用柠檬酸钠溶液 进行液化，可以使包膜舒张，提升膜的通透性。并且在该步骤S40中，柠檬酸 钠溶液采用质量体积分数0.1～0.3％的浓度范围即可，以避免高浓度破坏包膜的 分子间作用力。
并且，上述步骤S40中将将获得的微囊置于柠檬酸钠溶液中进行浸滞处理 时，大致控制时间在10～20min即可，因为本身包囊内部的细胞目的是用于培 养，虽然柠檬酸也能作为干细胞生长的能源物质，但是长时间处于为培养状态 会导致细胞的活性降低，所以时间不宜过长。
进一步在上述步骤S40柠檬酸钠溶液浸滞处理之后，可以对获得的微囊进 行洗涤，洗涤过程可以依次采用质量体积浓度0.3～0.9％的生理盐水洗2～3次左 右后、再用不含FBS(已以避免细胞因子导致干细胞产生诱导或者性状分化) 的α-MEM培养基洗涤2～3次即可。
并且在实施中，步骤S30～步骤S40尽量流畅快速的完成，因为待培养的干 细胞是活细胞，如果操作时间过长，细胞在没有营养的环境中比较容易出现凋 亡；所以上述采用α-MEM培养基的洗涤一方面可以增加微囊缩胀适应性，还 可以提供细胞代谢营养，避免细胞衰退。同时步骤S40制备完成微囊之后，应 当建议直接进行培养，避免存放中导致细胞死亡。即使要进行保存，也应当在 能维持细胞营养和活性的保存液中进行。
基于本发明上述制备方法过程，本发明进一步还提出一种采用上述脱乙酰 几丁质/羧甲基纤维素干细胞微囊的制备方法得到的微囊，该微囊相比通常的聚 赖氨酸/海藻酸钠细胞培养微囊，其包膜结构在电荷静电吸附结合的基础上，再 借助于脱乙酰基、醚键修饰产生的活性集团，能够形成更加复杂的分子结构， 大大增强了包膜的抗机械、耐热等方面的性能，在浸滞于培养液中进行细胞培 养时，相对能提供更加稳定的细胞生长环境，从而提升细胞培养扩增的效率。
在上述基础上，本发明进一步提出上述微囊的培养方法，具体实施的过程 中，将上述制备的脱乙酰几丁质/羧甲基纤维素干细胞微囊接种于培养容器中进 行细胞培养即可。
但是，进一步在培养的过程中，每周全量换液3次(细胞被固定在包囊内， 所以相比通常的微载体粘附的培养方式，本暗中可以进行全量换液)、半量换液 1次，培养28天。
一般通常的细胞培养过程中，动物细胞培养箱的条件为37℃、5％CO2动 物细胞培养箱中正常培养。而本案中经过对比，相比未用微囊包覆的干细胞培 养时，正常培养过程中微囊包覆的细胞的代谢能力略显不足；因为微囊包覆之 后，虽然形成微囊的包膜具有孔隙和半透性，培养液中的营养成分基本上能被 干细胞所获取，但是微囊内细胞的氧获取能力降低，影响了细胞的有氧代谢。 在缺氧状态下，ATP合成减少，细胞的功能和完整性极易受损。而缺氧时细胞 获取ATP的主要途径是糖的无氧酵解，采用培养基中的通常的葡萄糖等有氧代 谢能源底物，细胞的生长会能力稍微不足。所以可以采用在培养基中添加补充 果糖进行，因为果糖是缺氧状态下肝细胞获能的有效糖酵解物质，能在缺氧状 态下提供ATP，维持细胞膜的离子泵，所以能有效的保护肝细胞膜的完整性和 细胞的功能，果糖能提供大量的F-1-P(1-磷酸果糖)的糖酵解前体物质，利于细 胞生长和代谢。果糖的添加浓度可以控制10～20mmol/L，基本上补充弥补能量 代谢即可，不需要过量添加。
和/或者，本身培养的过程中细胞一般是在正常的5％CO2(这里的比例是气 体体积比，剩余95％是空气)动物细胞培养箱中进行，根据空气中氧气占比21％ 换算之后，培养的条件为5％CO2、19.9％O2及余量为N2等。基于微囊培养中 细胞氧获取有所降低的情形下，可以稍微替身培养箱中的氧气的浓度，可以采 用动物培养箱中的增加O2的含量，采用提升O2的气体体积浓度至21～25％(CO2含量不变以防止培养液碱中毒、N2含量对应O2的增加量而降低)，增加氧供应 量，从而也能弥补微囊包覆造成的细胞氧获取不足的问题。
采用本发明的上述培养方法，细胞具有更好的生长和代谢的环境，微囊包 膜具有良好的溶胀、缩胀等性能，用于细胞培养时其透性和稳定性上更好一些， 能形成较好的细胞生长环境，提升细胞培养扩增的效率。
为使本发明的上述实施的技术细节和过程方法能更易于本领域技术人员的 理解和实施参考，同时凸显出本发明的脱乙酰几丁质/羧甲基纤维素细胞微囊性 能和品质，以下通过具体的实施例进行举例说明。
实施例1
分离兔骨髓间充质干细胞(本实例中以兔骨髓间充质为例)：
S01，原代培养：
取体重2kg左右的新西兰大白兔，耳缘静脉注射3％的无巴比妥钠；麻醉 后，用18号的骨穿针从股骨端抽取5ml骨髓液，用3000U/m1肝素抗凝；之后 把骨髓液加入LG-DMEM培养基进行1:1稀释，混匀后1200rpm离心10分钟； 离心后弃上层血清和脂肪，再加入LG-DMEM培养基稀释；然后小心地把悬液 滴加到Ficoll细胞分离液上，按照体积比1:1混合之后2500rpm离心30分钟。 离心之后吸取白膜层，再加入LG-DMEM培养基清洗2次，1200rpm离心5分 钟最后去掉上清液，加入含有10％胎牛血清的LG-DMEM培养基。调整细胞浓 度并以5×106cells/cm2接种于培养瓶。三天后去除悬浮细胞，每五天全量换液。
当步骤S01的细胞己长至85～90％融合度时进行传代培养。
S02，骨髓间充质干细胞的传代培养：
吸去或倾出旧的培养液：用PBS或无Ca2+、Mg2+的平衡盐溶液漂洗培养物 1～2次，尽量洗去残余血清，弃去平衡盐溶液；
解离细胞：加入含有0.125wt％胰酶和0.025wt％EDTA的消化液于室温或者 37℃条件下消化约3min；细胞解离的程度可以通过在显微镜下直接观察判断， 一般以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大，细胞近乎变圆为度。
加入培养液终止消化，用弯头吸管吸取培养皿内的培养液或蛋白酶抑制剂， 反复吹打瓶皿底壁，使己经消化的细胞脱离瓶皿底壁。吹打过程须有序进行， 亦即要从一边开始到另一边结束，尤其瓶皿的边缘地带和四角处，确保瓶皿底 部各处的细胞均被吹打脱离。吹打时用力不宜过猛，吹出液体的力度要适中， 否则会直接损伤细胞并产生能伤害细胞的气泡。
经吹打后，得到细胞悬液。离心(1000rpm、5min)后除去上清含酶溶液。
用培养液将细胞溶液沉淀重新悬浮，计数并调整细胞密度。接种在新的培 养瓶皿内，一般接种在两个或者多个培养瓶内。有时候，传代仅为了使培养物 经历并适应传代处理过程，在培养物细胞数量不大的情况下，传代时还只是接 种在一个培养皿内。
然后按照如下步骤制备脱乙酰几丁质/羧甲基纤维素干细胞微囊，过程如 下：
S10，购买化学纯(或者分析纯)的脱乙酰几丁质和羧甲基纤维素；
S21，称取0.1g羧甲基纤维素用50mL体积分数1％的醋酸溶液分散，同样 于50℃水浴加热溶解后溶胀8h以上，确保使用时充分溶解；
S22，同时配置质量体积分数4％的CaCl250mL；并将上述步骤21中制备 的羧甲基纤维素溶液经脉冲电场发生装置滴入CaCl2溶液中，形成羧甲基纤维 素凝胶；此时凝胶中羧甲基纤维素质量体积浓度为1％，CaCl2终浓度为2％。
S31，称取0.1g脱乙酰几丁质用50mL质量体积分数0.2％的醋酸-醋酸钠 缓冲液(pH5.0)分散，静置过夜确保使用时充分溶解；
S32，获取上述步骤S02传代培养之后的细胞，并调整细胞初始密度为 2×l07cells/mL的悬液；然后使用注射器吸取等体积的50mL细胞悬液上述步骤 S31的脱乙酰几丁质进行均匀混合；混合后悬液中的细胞密度为l×107cells/mL， 此时脱乙酰几丁质终浓度为1％(w/v)。
S41，使用注射器吸取步骤S32的混合悬液，装上无菌的针头，排除注射 器内的空气。之后缓慢推动注射器，将细胞悬液均速注入步骤S22的100mL羧 甲基纤维素凝胶的烧杯中，尽量保证针头位置始终与烧杯杯口持平，细胞悬液 匀速滴入；
S42，待步骤S41注射之后反应10min，细胞悬液己经交联形成了微囊，然 后将凝胶和微囊全部转移至柠檬酸钠溶液(质量体积分数0.2％)中液化15min， 然后将溶液全部吸出，收获微囊；
S43，将步骤S42的微囊用无菌0.9％的生理盐水洗涤微囊，再用10mL不 含FBS的α-MEM各洗涤两次。
上述步骤S40之后制备得到微囊，进行细胞培养，具体：
S50，将步骤S40制备的细胞微囊分装在转瓶中，放置于37℃、5％CO2、 23％O2(其余为N2及空气中的其他气体)动物细胞培养箱中培养。培养过程中， 所采用的液体培养中添加10mmol/L的果糖；且每周全量换液3次，半量换液1 次，培养28天后收获细胞。
为了验证本案的微囊的品质和效果，进一步进行如下验证试验，并且上述 干细胞培养中设置聚赖氨酸/海藻酸钠细胞微囊同样培养的细胞作为对照。具体 验证的过程如下：
S60：MTT(噻唑蓝)检测
活细胞的线粒体可以产生琥珀酸脱氢酶，该酶可以使MTT还原为不溶于 水，却溶于DMSO的甲簪，死细胞则不能。在MTT试验中生成的紫色甲簪的 量与生长的细胞数目呈线性关系，因此通过测定甲簪蓝的吸光度值就可以测得 细胞的增殖数目。
取步骤S50中培养0d、7d、14d、21d、28d天的微囊(每次取样3个)，分 别分装在3个EP管中，加入40μL5mg/mL的MTT和200μL新鲜的培养基。 并轻轻吹打，使微囊悬浮于染液中；避光于37℃、5％CO2动物细胞培养箱中 孵育4h。
孵育反应结束后，去上清；将微囊砸碎，加入300μL的DMSO(MTT试 剂盒中的试剂)振荡，10000rpm高速离心5min。吸取200μL上清，转移至 96孔板，使用酶标仪在490nm处测吸光值(OD值)。
结果：
OD值 0d 7d 14d 21d 28d 对照组 0.59±0.11 0.61±0.14 0.69±0.12 0.73±0.15 0.75±0.13 本发明 0.60±0.13 0.78±0.12 0.86±0.12 0.94±0.11 0.97±0.13
从上述MTT法检测的结果中，可以看出本发明微囊细胞扩增的过程中细 胞数量和浓度相比要高出一些，这是因为细胞本身生长和存活的环境更好，所 以在同样的浓度接种之后细胞代谢能力明显要强一些，并且培养的过程中微囊 自身不发生破坏和周纤维化反应，细胞生长环境更加优化，细胞培养扩增效率 更好。并且在培养的过程中，在培养28d后，离心分离微囊用于提取细胞之后， 将培养后的培养液中游离的细胞浓度进行检测，检测的结果也表面对照组中细 胞的数量约是本发明实验组细胞游离数量的5～10倍。其原因在于，本身细胞生 长的过程中所要求的是被良好地处于微囊内，但是如果微囊自身的利于被降解， 且环境不稳定，那么微囊降解之后细胞会有利于微囊外在培养液中的自行扩增。 所以这一辅助的结果中，也能说明本案中制备微囊包膜在被降解性上是有提升 的，微囊的具有更高的稳定性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明 的保护范围之内。