技术领域
本发明涉及一种环介导等温DNA扩增技术(loop-mediated isothermal amplification， LAMP)在检测志贺菌中的用途。
背景技术
志贺菌属(Shigella spp.)是一类革兰氏阴性杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌， 通称痢疾杆菌。志贺菌病常为食物爆发型或经水传播，志贺菌在拥挤和不卫生条件下能迅速 传播，经常发现于人员大量集中的地方如餐厅和食堂等。食源性志贺菌流行的最主要原因是 从事食品加工行业人员患菌痢或带菌者污染食品，接触食品人员个人卫生差，已污染的食品 存放在不适当的温度下等。
目前鉴定志贺菌主要有细菌学检查和免疫学方法。前者作为我国国标检测志贺菌的方法， 虽然结果可靠，但是操作烦琐、耗时，已经不能满足大量样品的检测需要，而后者虽然可以 快速检测，但容易出现假阳性且重复性较差。
新兴的分子生物学的方法，包括聚合酶链式反应(PCR)、依耐核酸序列的扩增(NASBA)， 自主序列复制(3SR)以及链置换技术(SDA)等。这些方法都能扩增靶核酸到相似的数量 级，都有较高的检出限，但是它们仍然有一些缺陷不能克服。它们有的需要精密的仪器来扩 增，有的因为对靶序列的选择特异性不高而需要精细的方法来检测扩增产物。尽管操作简单， 但需要高精度的热循环仪使得PCR这一有力的技术没有被广泛的应用。另一方面，不使用热 循环仪的NASBA和3SR，在特异性上又大打折扣，主要是由于必须用一个相对较低的温度 40℃来进行扩增。SDA利用四种引物在等温条件下扩增很大程度上克服了这些缺陷，但是仍 然存在薄落的环节，必须利用昂贵的修饰核苷酸作为底物来进行扩增反应。
综合以上原因，研究一种快速、准确、简便的方法来检测志贺菌是非常必要的。
本发明选用志贺菌高度保守的ipaH基因，设计了6条能在60℃～65℃的温度条件下扩增 志贺菌DNA序列的特异性引物。所有的志贺菌均携带一个侵袭性非结合型大质粒，该质粒 编码多种侵袭性相关外膜蛋白。Venkatesan等发现侵袭性质粒抗原H(invasive plasmid，ipaH) 同时多拷贝存在于染色体和侵袭性大质粒上，不因传代而丢失。因此选择编码侵袭性质粒抗 原H(ipaH)的基因作为靶基因。
该扩增反应依赖于一组针对靶基因的引物：包括一组内引物FIP和BIP，以及一组外引 物F3和B3和一组环引物LB和LF，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶的大片段，在 64℃左右的条件下即可完成对靶基因的特异性扩增。由于其针对ipaH基因的6个区段，所以 特异性高；且其反应温度恒定，不需要PCR仪，仅需一个水浴锅即可完成；另外，在反应过 程中，从dNTPs中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子结合，能产生一种焦磷酸镁的 沉淀物，出现浑浊沉淀，因此用肉眼就判定扩增结果，无需进行凝胶电泳。
实验证明，通过该法检测食品中污染的志贺菌，其特异性良好，操作简单，无需昂贵仪 器和试剂，且灵敏度比常规PCR高。
主要参考文献
[1]Notomi T，Okayama H，Masubuchi H.，et al.，Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res.2000，28(12)：e63
[2]Mori Y，Kitao M，Tomita N，et al.，Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA.J Biochem.Biophys.Methods，2004，59：145～157
[3]Mori Y，Nagamine K，Notomi T，et al.，Detection of Loop-Mediated Isothermal Amplication Reaction by Turbidity Derived from Magnesium Pyrophosphate Formation.Biochem.Biophys. Res.Commun，2001，289：150～154
[4]Nagamine K，Kuzuhara Y，Notomi T，Biochem.Biophys.Res.Commun，2002，290(4)： 1195～1198
[5]Mori Y，Hirano T，Notomi T，Sequence specific visual detection of LAMP reactions by addition of cationic polymers.BMC Biotechnology.2006，6：3
[6]王茂起，刘秀梅，王竹天等.中国食品污染监测体系的研究.中国食品卫生杂志，2006， 18(6)：491～497
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种简单方便的快速检测志贺菌的方法。
(二)技术方案
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
1.样品DNA的提取
样品按照GB4789.5-2003处理，经增菌培养后，取培养物1mL于12000r/min离心5min； 沉淀用0.8mL1×TE(100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，pH8.0)洗涤，12000r/min离心 5min，沉淀加入100μL无菌水，混匀后，于100℃沸水浴15min，立即冰浴5min，12000r/min 离心5min，上清液即为提取的DNA模板。
2.LAMP反应体系
反应体系中分别加入以下物质：
10×LAMP bufffer 2.5μL；10mmol/L Mg2+4.0μL～6.0μL；10mmol/LdNTP 1.5μL～2.5μL； 10mmol/L betaine 1.5μL～2.5μL；0.5μmol/L的FIP和BIP各2μL；0.25μmol/L的F3和B3各 0.5μL；样品中提取的DNA模板5.0μL；Bst DNA聚合酶8U/μL 1μL；超纯水补至25μL。
3.反应条件
63℃～65℃水浴锅温浴60min，80℃加热2min。
(三)有益效果
本发明以志贺菌ipaH基因为靶基因，设计了一组用于扩增该基因部分序列的特异性引物， 研究了反应体系和反应条件，能检出1fg/反应的DNA，克服了目前所用细菌培养法繁琐费时 和免疫检测法易出现假阳性及一些分子生物学方法需要特殊仪器和试剂等缺点。
具体实施方式
1.引物的设计
外引物F3(forward outer primer)：5′-GCCTTTCCGATACCGTCTCT；外引物B3(forward outer primer)：5′-TGATGGACCAGGAGGGTT；内引物FIP(backward inner primer)： 5′-TCCGCAGAGGCACTGAGTTTTTCACGCAATACCTCCGGATTC；内引物BIP(backward inner primer)：5′-TCGACAGCAGTCTTTCGCTGTTCCGGAGATTGTTC-CATGTGA；环引物 LB为：5′-TGCAGCGACCTGTTCACG；环引物LF为：5′-CTGCTGATG-CCACTGAGAGC。
2.样品的处理
样品按照GB/T4789.4-2003处理，经增菌培养后，取培养物1mL于12000r/min离心5min； 沉淀用0.8mL1×TE(100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，pH8.0)洗涤，12000r/min离心 5min，沉淀加入100μL无菌水，混匀后，于100℃沸水浴15min，立即冰浴5min，12000r/min 离心5min，上清液即为提取的DNA模板。
3.LAMP反应体系
在反应体系中分别加入以下物质：
10×LAMP bufffer 2.5μL；10mmol/L Mg2+4.0～6.0μL；10mmol/LdNTP 1.5μL～2.5μL； 10mmol/L betaine 1.5μL～2.5μL；0.5μmol/L的FIP和BIP各2μL；0.25μmol/L的F3和B3各 0.5μL；0.5μmol/L的LF和LB各1μL；超纯水2.5μL；样品中提取的DNA模板5.0μL；Bst DNA 聚合酶8U/μL 1μL，补水至25μL。
4.反应条件
63℃～65℃水浴锅温浴60min，80℃加热2min。
5.检测结果
直接观察反应混合液中是否出现白色沉淀。如果出现白色沉淀，则为阳性结果，如果未 出现上述现象，则为阴性结果。
另一种检测结果的方法：取反应后的混合液2μL，加入0.5μL溴酚蓝上样缓冲液，在2％ 的琼脂糖凝胶中电泳，电压100V，时间30min，置于紫外检测系统检测电泳条带。如果出现 梯度条带，则为阳性结果，如未出现，则结果为阴性。