发明领域
本发明包括通过需氧生长的微生物从可发酵碳源生物转化成乙醇酸 (glycolicacid)的方法。
发明背景
乙醇酸(HOCH2COOH)是羧酸的α-羟基酸家族中的第一个成员。乙醇酸 具有双重官能度，在非常小的分子上具有醇和中等强度的酸官能团。这导致 了独特的化学属性以及典型的酸和醇化学。
乙醇酸使用羟基和羧酸基团与多价金属形成五元环复合物(螯合物)。这种 金属离子复合能力在分解坚硬的水垢和防止沉积中有用，特别是在酸清洁设 备中，在所述设备中良好的清洗能力是关键的因素。乙醇酸与有机醇和酸经 过反应形成酯。低分子量的烷基乙醇酯具有特别的溶解性质，可以用作正丙 醇和异丙醇、乙二胺、苯酚、m-甲酚、2-乙氧基乙酸乙酯(2-ethoxyethylacetate)， 和乳酸乙酯和乳酸甲酯的替代物。更高分子量的烷基酯能用于个人护理产品 配制物中。乙醇酸能与自身反应形成二聚的乙交酯、头尾相连的聚酯寡聚物， 和长链聚合物。可以与其它α-羟基酸如乳酸形成共聚物。聚酯聚合物在含水 环境中以可控制的速率逐渐水解。这种性质使它们在生物医药应用中有用， 如可分解的缝合线，而且在需要酸的控制释放以降低pH的应用中有用。目 前在美国每年消耗多于15000吨的乙醇酸。
乙醇酸的生物产生(在图1中显示)要求形成乙醛酸(glyoxylate)作为中间 物，其通过由基因ycdW编码的NADPH依赖性氧化还原酶还原成乙醇酸 (Nunez等，(2001)Biochemistry，354，707-715)。乙醛酸是乙醛酸循环(三羧酸循 环和乙醛酸旁路，在Neidhardt，F.C.(主编)，R.CurtissIII，J.L.Ingraham，E.C. C.Lin，K.B.Low，B.Magasanik，W.S.Reznikoff，M.Riley，M.Schaechter和H. E.Umbarger(编).1996.EscherichiacoliandSalmonella：CellularandMolecular Biology.AmericanSocietyforMicrobiology中进行了总结)的中间物。在这个循 环中，将异柠檬酸切割成琥珀酸和乙醛酸，反应由异柠檬酸裂合酶催化，所 述酶由aceA基因编码。琥珀酸直接进入柠檬酸循环，并转化成草酰乙酸。通 过合并源自乙酸的一分子乙酰-CoA，乙醛酸转化成苹果酸，反应由aceB和 gclB编码的两个苹果酸合成酶的同工酶催化。在转录和后转录水平调控碳进 入乙醛酸支路。转录调控通过IclR抑制子对aceBAK操纵子进行。AceBAK 分别编码苹果酸合成酶、异柠檬酸裂合酶和异柠檬酸激酶/磷酸酶。iclR基因 进行负向的自调控并由FadR蛋白激活。由icd基因编码的异柠檬酸脱氢酶的 活性受到后转录调控。异柠檬酸脱氢酶和异柠檬酸裂合酶竞争共同的底物异 柠檬酸。因为异柠檬酸裂合酶反应对于异柠檬酸的Km值明显更高，所以进入 乙醛酸途径部分依赖于异柠檬酸脱氢酶的调控。异柠檬酸脱氢酶活性受到由 AceK催化的其磷酸化和去磷酸化的调节。磷酸化降低Icd的活性，而去磷酸 化重新活化Icd酶。AceK作为激酶还是磷酸酶起作用取决于几种代谢产物的 存在。耗尽异柠檬酸和3-磷酸甘油酸刺激激酶的活性，丙酮酸和AMP的存 在抑制激酶的作用，从而有利于磷酸酶活性(也参见Neidhard)。乙醛酸可以通 过由gcl编码的乙醛酸醛连接酶(glyoxylatecarboligase)转化成羟基丙二酸半醛 (tartronatesemidldahyde)，并通过eda编码的2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶 (2-keto-3-deoxygluconate6-phosphatealdolase)转化成2-酮-4-羟基戊二酸 (2-keto-4-hydroxyglutarate)，而乙醇酸可以通过aldA编码的依赖NAD+的乙 醇醛脱氢酶还原成乙醇醛，或通过glcDEF编码的依赖NAD+的乙醇酸氧化酶 氧化成乙醛酸。
本发明要解决的问题是从廉价的底物，如葡萄糖或其它糖，生物产生乙 醇酸。对于乙醇酸产生的工业可行方法，生物化学步骤的数目和代谢途径的 复杂性需要使用代谢工程改造的全细胞催化剂。
发明概述
申请人已经解决了上述的问题，本发明提供从可发酵碳源直接生物转化 成乙醇酸的方法。葡萄糖用作模式底物，而重组大肠杆菌用作模式宿主。在 本发明的一个方面，通过将编码苹果酸合成酶(aceB和glcB)、乙醛酸醛连接 酶(gcl)和2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶(eda)的基因失活，构建不能将乙醛 酸代谢成除乙醇酸以外的其它化合物的重组大肠杆菌。在本发明的另一个方 面中，通过使用内源的编码基因，如ycdW或yiaE，使用NADPH依赖性乙 醛酸还原酶活性将有毒的乙醛酸还原成乙醇酸。在本发明的另外的方面，缺 失了编码乙醇酸代谢酶、乙醇酸氧化酶(glcDEF)和乙醇醛脱氢酶(aldA)的基 因。此外，通过下述方法增加乙醛酸途径中的通量：i)通过失活iclR基因或 直接增加aceA的表达而增加aceA的水平，ii)失活编码异柠檬酸脱氢酶的基 因(icd)或降低表达水平，和iii)失活编码丙酮酸氧化酶(poxB)和乙酸途径(ack， pta)的基因。在本发明的最后方面，通过失活编码6-磷酸葡萄糖异构酶(pgi)、 6-磷酸葡糖酸脱水酶(edd)和可溶性转氢酶(udhA)的基因，增加NADPH的可 用性，从而获得乙醇酸产生的更好的得率(yield)。本发明通常可以应用于包括 易于转化成乙酰-CoA的任何碳底物。
因此，本发明的目的是提供用于产生乙醇酸的重组生物体，其包含：(a) 至少失活所有苹果酸合成酶、乙醛酸醛连接酶和2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛 缩酶编码基因；(b)编码具有NADPH依赖性乙醛酸还原酶活性的多肽的至少一 个基因，和(c)至少失活编码NAD+依赖性从乙醇酸氧化成乙醛酸的基因。任选 地，重组生物体可以包含i)失活在选自下组的内源基因中的突变：(a)编码乙 醛酸途径的抑制子的基因，(b)编码具有6-磷酸葡萄糖异构酶活性的多肽的基 因，(c)编码具有可溶性转氢酶活性的多肽的基因，(d)编码具有6-磷酸葡糖酸 脱水酶活性的多肽的基因，(e)编码具有磷酸-转乙酰酶(phospho-transacetylase) 和乙酸激酶活性的多肽的基因，(f)编码丙酮酸氧化酶活性的基因，(g)编码乙醇 醛脱氢酶活性的基因；ii)增加编码异柠檬酸裂合酶的基因的水平，和iii)失活 编码具有异柠檬酸脱氢酶活性的多肽的基因，或降低活性。
在另一个实施方案中，本发明提供从重组生物体产生乙醇酸的方法，所 述方法包括：(a)使本发明的生物体接触选自下组的至少一种碳源：单糖、寡 糖、多糖和能产生乙醇酸的单碳底物；任选地，(b)通过聚合为至少乙醇酸二 聚体的步骤和(c)通过解聚合从乙醇酸二聚体、寡聚体和/或多聚体中回收乙醇 酸来回收(a)中产生的乙醇酸。
附图简述
合并入本说明书和构成本说明书一部分的附图例示了本发明，并且与描 述一起用来解释本发明的原理(principle)。
图1描述在从碳水化合物至乙醇酸的产生系统的开发中，糖酵解、TCA 循环和乙醛酸途径的基因工程。
图2是显示构建载体pME101-ycdW的图。
发明详述
如本文所使用的，下述术语可以用于解释权利要求和说明书。
术语“突变菌株”指非野生型菌株。
术语“微生物”指所有种类的单细胞生物，包括原核生物，如细菌，和 真核生物，如酵母。细菌具体包括：肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、芽孢杆菌 科(Bacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和棒杆菌科(Corynebacteriaceae)。 肠杆菌科具体包含但是不专指埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属 (Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)和泛菌属(Pantoea)。
术语“转化”或“转染”指在合并外源核酸后，在细胞中获得新基因。 术语“转化子”指转化的产物。术语“遗传改变的”指通过转化或突变改变 遗传物质的过程。
术语“削弱(attenuation)”指降低基因的表达或降低蛋白(即，基因产物) 的活性。本领域的技术人员知道大量手段以获得这种结果，例如：
-将突变引入基因中，降低这个基因的表达水平，或所编码的蛋白质的 活性水平。
-用低强度启动子替换基因的天然启动子，导致较低的表达。
-使用使相应的信使RNA或蛋白质去稳定化的元件。
-如果不需要表达则缺失基因。
术语“表达”指从基因转录并翻译成蛋白质(即，基因的产物)。
本文所使用的术语“质粒”或“载体”指经常携带基因且通常为环状双 链DNA分子形式的染色体外元件，所述基因不是细胞中心代谢的部分。
术语“碳底物”或“碳源”表示能由微生物代谢的任何碳源，其中底物 包含至少一个碳原子。作者特别指可再生的、廉价的和可发酵的碳源，如单 糖、寡糖、多糖、单碳底物，和多羟基化合物，如甘油。单碳底物定义为只 包含一个碳原子的含碳分子，如甲醇。化学式为(CH2O)n的单糖也称作碳水化 合物(ose)或“简单糖(simplesugar)”；单糖包括蔗糖(saccharose)、果糖、葡萄 糖、半乳糖和甘露糖。其它包含多于一个单糖的碳源称作二糖、三糖、寡糖 和多糖。二糖包括蔗糖(sucrose)、乳糖和麦芽糖。淀粉和半纤维素是多糖，也 称作“复杂糖”。因此术语“碳源”表示上述任何产物，及它们的混合物。
术语“ATCC”代表美国典型培养物保藏中心，12301ParklawnDrive， Rockville，Md.20852，U.S.A。
术语“乙醛酸”(glyoxylate)和“乙醛酸”(glyoxylicacid)可以互换使用。
术语“乙醇酸”(glycolate)和“乙醇酸”(glycolicacid)可以互换使用。
在本发明的描述中，通过酶的比活性鉴定酶。因而这种定义包括也存在 于其它生物体中，更具体在其它微生物中的具有限定的比活性的所有多肽。 经常通过分类于某些定义为PFAM或COG的家族来鉴定具有相似活性的酶。
PFAM(比对和隐藏的Markov模型的蛋白质家族数据库； http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)代表蛋白质序列比对的大的集合。每个 PFAM可能显示多个比对，看到蛋白域，评价在生物体中的分布，访问其它 数据库，并显示已知的蛋白结构。
通过比较来自43个完全测序的基因组的蛋白质序列获得COGs(蛋白质 的正向同源(orthologous)组的簇；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)，所述基 因组代表30个主要的种系发生系(phylogenicline)。从至少三个系定义每个 COG，这允许鉴定以前的保守域。
鉴定同源序列及其百分比同源性的方法为本领域的技术人员所熟知，具 体包括BLAST程序，其可以从网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/，以 该网站上指示的默认参数来使用。然后可使用，例如，程序CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或MULTALIN(http://prodes.toulouse.inra.fr/ multalin/cgi-bin/multalin.pl)，以这些网站上指示的默认参数来利用(例如比对) 获得的序列。
使用GenBank上对于已知基因给出的参考，本领域的那些技术人员能确 定其它生物体、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等同基因。使 用共有序列可以有优势地完成这种常规工作，所述共有序列可以通过下述步骤 确定：用源自其它微生物的基因进行序列比对，并设计简并探针以克隆另一种 生物体中的相应基因。这些分子生物学的常规方法为本领域的那些技术人员所 熟知，并在例如Sambrook等(1989MolecularCloning:aLaboratoryManual.2nded.ColdSpringHarborLab.，ColdSpringHarbor，NewYork.)中描述。
本发明提供通过在适当的培养基中培养微生物，发酵产生乙醇酸、其衍 生物或前体并从培养基回收乙醇酸的方法，所述培养基包含碳源。
本发明的另一个实施方案提供方法，其中微生物经过修饰以具有低的除 产生乙醇酸以外的乙醛酸转化能力，原因是削弱了编码消耗乙醛酸(乙醇酸的 关键前体)的酶的基因：编码苹果酸合成酶的aceB和gclB基因，编码乙醛酸 醛连接酶的gcl和编码2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶的eda。
在本发明的另一个实施方案中，微生物包含编码催化乙醛酸转化成乙醇 酸的多肽的至少一个基因。
具体地，在需氧条件下，编码NADPH依赖性乙醛酸还原酶的基因可以 将有毒的乙醛酸中间物转化成低毒性的终产物乙醇酸。基因可以是外源或内 源的，并可以为染色体表达的或染色体外表达的。可以从大肠杆菌MG1655 的基因组中的ycdW或yiaE基因中选择NADPH依赖性乙醛酸还原酶编码基 因。在优选的实施方案中，增加至少一种所述基因的表达。如果需要的话， 可以通过使用基因组上的一个或几个拷贝，从染色体定位的基因获得高水平 的NADPH依赖的乙醛酸还原酶活性，所述基因组上的拷贝可以通过本领域 的专家已知的重组方法引入。对于染色体外的基因，可以使用因为复制起点 不同从而细胞中拷贝数不同的不同类型质粒。对应于具有严紧复制的低拷贝 数质粒(pSC101、RK2)，低拷贝数质粒(pACYC、pRSF1010)或高拷贝数质粒 (pSKbluescriptII)，它们可以作为1-5个拷贝，大约20或高达500个拷贝存 在。可以使用不同强度的启动子表达ycdW或yiaE基因，所述启动子需要或 者不需要由诱导子分子诱导。实例是启动子Ptrc、Ptac、Plac、λ启动子cI或 本领域专家已知的其它启动子。也可以通过使相应的信使RNA(Carrier和 Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15，58-64)或蛋白质(例如，GST标签， AmershamBiosciences)稳定化的元件促进(boost)基因的表达。
在本发明的另一个实施方案中，以这样的方式修饰微生物使得其基本上 不能代谢乙醇酸。可以通过削弱编码消耗乙醇酸的酶的基因(编码乙醇酸氧化 酶的glcDEF和编码乙醇醛脱氢酶的aldA)中的至少一个而实现这种结果。可 以通过用低强度的启动子或用使相应的信使RNA或蛋白质去稳定化的元件 替代天然的启动子，来削弱基因。如果需要的话，也可以通过缺失相应的DNA 序列来实现基因的完全削弱。
在另一个实施方案中，转化本发明的方法中使用的微生物以增加乙醛酸 途径通量。
可以通过不同的手段增加乙醛酸途径中的通量，具体为：
i)降低异柠檬酸脱氢酶(Icd)的活性，
ii)通过削弱基因而降低下述酶中至少一种的活性：
●磷酸-转乙酰酶，由pta基因编码
●乙酸激酶，由ack基因编码
●丙酮酸氧化酶，由poxB基因编码
iii)增加异柠檬酸裂合酶的活性，其由aceA基因编码。
可以通过引入驱动icd基因(其编码异柠檬酸脱氢酶)表达的人工启动子， 或者通过在icd基因中引入降低蛋白的酶活性的突变，来降低异柠檬酸脱氢 酶的水平。
因为通过磷酸化降低蛋白质Icd的活性，所以还可以通过引入突变的 aceK基因控制其活性，所述基因与野生型的AceK酶相比，具有增加的激酶 活性或降低的磷酸酶活性。
可以通过削弱编码乙醛酸途径抑制子的iclR或fadR基因的水平，或通过 刺激aceA基因的表达，例如通过引入驱动基因表达的人工启动子，或通过在 aceA基因中引入增加编码蛋白的活性的突变，来增加异柠檬酸裂合酶的活性。
本发明的实施方案通过增加对NADPH依赖性乙醛酸还原酶的NADPH 可用性而提供乙醇酸产生的更好的得率。可以通过削弱选自下组的基因中的 至少一种获得对微生物性质的这种修饰：编码6-磷酸葡萄糖异构酶的pgi，编 码可溶性转氢酶的udhA和编码6-磷酸葡糖酸脱水酶活性的edd。具有这些遗 传修饰，所有6-磷酸葡萄糖将必须通过磷酸戊糖途径进入糖酵解，而且每代 谢一个6-磷酸葡萄糖将产生2个NADPH。
在另一个实施方案中，本发明提供从重组生物体发酵产生乙醇酸的方法， 所述方法包括：(a)用本发明的重组生物体接触选自下组的至少一种碳源：葡 萄糖、蔗糖、单糖、寡糖、多糖、淀粉或其衍生物、甘油和可产生乙醇酸的 单碳底物。任选地，该方法包括将细菌或培养基中的乙醇酸浓缩的步骤和从 从任选地以部分或全部量(0-100％)保留在终产物中的生物量和/或发酵培养液 (broth)中分离乙醇酸的步骤。任选地，该方法包括通过聚合为至少乙醇酸二 聚体和(b)通过解聚合从乙醇酸二聚体、寡聚体和/或多聚体中而回收乙醇酸的 步骤来回收步骤(a)中产生的乙醇酸。
本领域的技术人员能定义根据本发明的微生物的培养条件。具体地，在 20℃-55℃，优选在25℃-40℃的温度发酵细菌，而且更特定地，对谷氨酸棒 杆菌为约30℃，对大肠杆菌为约37℃。
通常在发酵罐中进行发酵，所述发酵罐中具有适合于所用细菌的已知确 定组成的无机培养基，其包含至少一种简单碳源，而且如果需要的话，包含 用于产生代谢物所必需的共同底物(co-substrate)。
本发明还涉及如前所述的微生物。优选地，这种微生物选自下组：大肠 杆菌、谷氨酸棒杆菌或酿酒酵母。
实施例1
构建除将乙醛酸还原成乙醇酸以外不能代谢乙醛酸的菌株：MG1655 ΔaceBΔgclΔglcB
要缺失aceB基因，使用由Datsenko&Wanner(2000)描述的同源重组策 略。这个策略允许插入氯霉素或卡那霉素抗性盒，同时缺失大多数有关的基 因。为此使用下述寡核苷酸：
DaceBF(SEQIDNO1)
ggcaacaacaaccgatgaactggctttcacaaggccgtatggcgagcaggagaagcaaattcttactgccga agcggtagCATATGAATATCCTCCTTAG
具有
-与基因aceB(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参考序列)的序列 (4213068-4213147)同源的区域(小写字母)，
-用于扩增氯霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97： 6640-6645中的参考序列)的区域(大写字母)，
DaceBR(SEQIDNO2))
ggcggtagcctggcagggtcaggaaatcaattaactcatcggaagtggtgatctgttccatcaagcgtgcggc atcgtcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有
-与基因aceB(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参考序列)的序列 (4214647-4214569)同源的区域(小写字母)，
-用于扩增氯霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97： 6640-6645中的参考序列)的区域(大写字母)。
使用寡核苷酸DaceBF和DaceBR从质粒pKD3扩增氯霉素抗性盒。然后 通过电穿孔将获得的PCR产物引入菌株MG1655(pKD46)中，其中表达的Red 重组酶允许进行同源重组。然后选择具有氯霉素抗性的转化子，并通过用下 面定义的寡核苷酸aceBF和aceBR通过PCR分析来确认抗性盒的插入。将保 留的菌株命名为MG1655ΔaceB::Cm。
aceBF(SEQIDNO3)：cgttaagcgattcagcaccttacc(与4212807至4212830的 序列同源)。
aceBR(SEQIDNO4)：ccagtttctgaatagcttcc(与4215327至4215308的序列 同源)。
然后，通过转导缺失MG1655ΔaceB::Cm菌株中的gcl基因。
首先用下面的寡核苷酸，使用如前述的同样方法构建MG1655Δgcl::Km菌株：
DgclF(SEQIDNO5)
ggcaaaaatgagagccgttgacgcggcaatgtatgtgctggagaaagaaggtatcactaccgccttcggtgtt ccgggagcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有
-与基因gcl(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参考序列)区域的 序列(533142-533224)同源的区域(小写字母)，
-用于扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS， 97：6640-6645中的参考序列)的区域(大写字母)，
DgipR(SEQIDNO6)
gcgttacgttttaacggtacggatccatccagcgtaaaccggcttccgtggtggtttggggtttatattcacaccc aacccCATATGAATATCCTCCTTAG
具有
-与基因gcl(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参考序列)区域的 序列(535720-535640)同源的区域(小写字母)，
-用于扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS， 97:6640-6645中的参考序列)的区域(大写字母)。
使用寡核苷酸DgclF和DgipR从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒。然后 通过电穿孔将获得的PCR产物引入菌株MG1655(pKD46)中。然后选择具有 卡那霉素抗性的转化子，并通过用下面定义的寡核苷酸gclF和gipR通过PCR 分析来确认抗性盒的插入。将保留的菌株命名为MG1655Δgcl::Km。
gclF(SEQIDNO7)：ggatatgcccaccttgctgaagg(与从532795至532817的序 列同源)。
gipR(SEQIDNO8)：cgcttagtttcaatcggggaaatgg(与从536114至536090的 序列同源)。
为了将缺失Δgcl::Km转移，使用噬菌体P1转导的方法。分两步进行下 面的规程，制备菌株MG1655Δgcl::Km的噬菌体裂解物，然后转导入菌株 MG1655ΔaceB::Cm。菌株的构建如上所述。
噬菌体裂解物P1的制备：
-用菌株MG1655Δgcl::Km的100μl过夜培养物接种10mlLB+Km50 μg/ml+葡萄糖0.2％+CaCl25mM。
-在37℃振荡培育30分钟。
-向菌株MG1665中加入制备的100μl噬菌体裂解物P1(约1·109个噬菌 体/ml)。
-在37℃振荡3小时，直至所有细胞裂解。
-加入200ul氯仿并漩涡振荡。
-在4500g离心10分钟以去除细胞碎片。
-将上清液转移至无菌试管并加入200ul氯仿。
-在4℃储存裂解物。
转导
-在1500g将菌株MG1655ΔaceB::Cm在LB培养基中的5ml过夜培养 物离心10分钟。
-在2.5ml10mMMgSO4，5mMCaCl2中悬浮细胞沉淀。
-对照试管：100μl细胞
菌株MG1655Δgcl::Km的100μl噬菌体P1
-测试试管：100μl细胞+菌株MG1655Δgcl::Km的100μl噬菌体P1。
-30℃不振荡地培育30分钟。
-在每个试管中加入100μl1M柠檬酸钠并漩涡振荡。
-加入1mlLB。
-37℃振荡培育1小时。
-在7000rpm将试管离心3分钟后，涂布于LB+Km50μg/ml的平板上。
-在37℃过夜培育。
菌株的确认
然后选择具有卡那霉素抗性的转化子，用前述的寡核苷酸gclF和gipR 通过PCR分析来确认基因Δgcl::Km的缺失。将保留的菌株命名为MG1655 ΔaceB::CmΔgcl::Km。
然后消除卡那霉素和氯霉素抗性盒。然后将携带在卡那霉素和氯霉素抗 性盒的FRT位点起作用的FLP重组酶的质粒pCP20通过电穿孔引入重组位 点。在42℃的一系列培养后，通过使用与先前所用相同的寡核苷酸 (aceBF/aceBR和gclF/gipR)通过PCR分析来确认卡那霉素和氯霉素抗性盒的 丢失(loss)。将保留的菌株命名为MG1655ΔaceBΔgcl。
然后，通过转导缺失MG1655ΔaceBΔgcl菌株中的glcB基因。用下述的 寡核苷酸，使用与前述相同的方法首先构建MG1655ΔglcB::Km:
DglcBR(SEQIDNO9)
cccagagccgtttacgcattgacgccaattttaaacgttttgtggatgaagaagttttaccgggaacagggctgg acgcCATATGAATATCCTCCTTAG
具有
-与基因glcB(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参考序列)区域中 的序列(3121805-3121727)同源的区域(小写字母)，
-用于扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS， 97：6640-6645中的参考序列)的区域(大写字母)，
DglcBF(SEQIDNO10)
cgcgtaaacgccaggcgtgtaataacggttcggtatagccgtttggctgtttcacgccgaggaagattaaatcg ctggcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有
-与基因glcB(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参考序列)区域中 的序列(3119667-3119745)同源的区域(小写字母)，
-用于扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS， 97：6640-6645中的参考序列)的区域(大写字母)。
使用寡核苷酸DglcBF和DglcBR从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒。然 后通过电穿孔将获得的PCR产物引入菌株MG1655(pKD46)。然后选择具有 卡那霉素抗性的转化子，用下面定义的寡核苷酸glcBF和glcBR通过PCR分 析来确认抗性盒的插入。将保留的菌株命名为MG1655ΔglcB::Km。
glcBR(SEQIDNO11):gccagcaaatggcgagtgc(与从3122225至3122207的 序列同源)。
glcBF(SEQIDNO12)：cgcagagtatcgttaagatgtcc(与从3119475至3119497 的序列同源)。
为了将缺失ΔglcB::Km转移，使用噬菌体P1转导的方法。制备菌株 MG1655ΔglcB::Km的噬菌体裂解物，用于转导入菌株MG1655ΔaceBΔgcl。
然后选择具有卡那霉素抗性的转化子，并用前面定义的寡核苷酸glcBF 和glcBR通过PCR分析来确认基因ΔglcB::Km的缺失。将保留的菌株命名为 MG1655ΔaceBΔgclΔglcB::Km。
然后消除卡那霉素抗性盒。然后将携带在卡那霉素抗性盒的FRT位点起作 用的FLP重组酶的质粒pCP20通过电穿孔引入重组位点。在42℃的一系列培 养后，通过使用与先前所用相同的寡核苷酸(glcBF和glcBR)通过PCR分析来确 认卡那霉素抗性盒的丢失。将保留的菌株命名为MG1655ΔaceBΔgclΔglcB。
实施例2
构建NADPH依赖性乙醛酸还原酶水平增加的菌株：MG1655ΔaceBΔgcl ΔglcB(pME101-ycdW)
为了促进NADPH依赖性乙醛酸还原酶的水平，使用启动子Ptrc表达来 自质粒pCL1920(Lerner&Inouye，1990，NAR18，15p4631)的ycdW基因。为 了从低拷贝载体表达，如下构建质粒pME101。使用寡核苷酸PME101F和 PME101R来PCR扩增质粒pCL1920，并在扩增的载体中插入来自携带lacI 基因和Ptrc启动子的载体PTRC99A的BstZ17I-XmnI片段。
PME101F(SEQIDNO13)：Ccgacagtaagacgggtaagcctg
PME101R(SEQIDNO14)：Agcttagtaaagccctcgctag
使用下述寡核苷酸从基因组DNA来PCR扩增ycdW基因：
BspHIycdW(SEQIDNO15)：agctagctctcatgagaataaatttcgcacaacgcttttcggg
SmaIycdW(SEQIDNO16)：gcatgcatcccgggtctctcctgtattcaattcccgcc
用BspHI和SmaI消化PCR片段，并将其克隆进用NcoI和SmaI限制酶 切割的载体pME101，得到质粒pME101-ycdW。然后将pME101-ycdW质粒 引入菌株MG1655ΔaceBΔgclΔglcB。
实施例3
构建乙醇酸消耗降低的菌株：MG1655ΔaceBΔgclΔglcDEFGBΔaldA (pME101-ycdW)
通过转导缺失MG1655ΔaceBΔgcl菌株中的glcDEFGB基因。
首先用下述寡核苷酸，用与如前所述相同的方法构建MG1655 ΔglcDEFGB::Km:
DglcDR(SEQIDNO17)
gcgtcttgatggcgctttacccgatgtcgaccgcacatcggtactgatggcactgcgtgagcatgtccctggac ttgagatccCATATGAATATCCTCCTTAG
具有
-与基因glcD(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参考序列)的序列 (3126016-3125934)同源的区域(小写字母)，
-用于扩增氯霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97： 6640-6645中的参考序列)的区域(大写字母)，
DglcBF(SEQIDNO18)
cgcgtaaacgccaggcgtgtaataacggttcggtatagccgtttggctgtttcacgccgaggaagattaaatcg ctggcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有
-与基因glcB(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参考序列)区域的 序列(3119667-3119745)同源的区域(小写字母)，
-用于扩增氯霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97： 6640-6645中的参考序列)的区域(大写字母)。
使用寡核苷酸DglcDR和DglcBF从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒。然 后通过电穿孔将获得的PCR产物引入菌株MG1655(pKD46)，其中表达的Red 重组酶允许进行同源重组。然后选择具有氯霉素抗性的转化子，用下面定义 的寡核苷酸glcDR和glcBF通过PCR分析来确认抗性盒的插入。将保留的菌 株命名为MG1655ΔglcDEFGB::Km。
glcDR(SEQIDNO19)：ccaagacaaggtcacagagc(与从3126183至3126164 的序列同源)。
glcBF(SEQIDNO20)：cgcagagtatcgttaagatgtcc(与从3119475至3119497 的序列同源)。
为了将缺失ΔglcDEFGB::Km转移，使用噬菌体P1转导的方法。制备菌 株MG1655ΔglcDEFGB::Km的噬菌体裂解物，用于转导入菌株MG1655 ΔaceBΔgcl。
然后选择具有卡那霉素抗性的转化子，并用前面定义的寡核苷酸glcBF 和glcDR通过PCR分析来确认基因ΔglcDEFGB::Km的缺失。将保留的菌株 命名为MG1655ΔaceBΔgclΔglcDEFGB::Km。
然后，通过转导缺失MG1655ΔaceBΔgclΔglcDEFGB::Km菌株中的aldA基 因。首先用下述寡核苷酸，使用与先前所述相同的方法构建MG1655aldA::Cm。
AldADr(SEQIDNO21)
ttaagactgtaaataaaccacctgggtctgcagatattcatgcaagccatgtttaccatctgcgccgccaatacc ggatttCATATGAATATCCTCCTTAG
具有
-与基因aldA(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参考序列)的序列 (1487615-1487695)同源的区域(小写字母)，
-用于扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS， 97：6640-6645中的参考序列)的区域(大写字母)，
AldADf(SEQIDNO22)
atgtcagtacccgttcaacatcctatgtatatcgatggacagtttgttacctggcgtggagacgcatggattgatg tggtaGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有
-与基因aldA(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参考序列)的序列 (1486256-1486336)同源的区域(小写字母)，
-用于扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS， 97：6640-6645中的参考序列)的区域(大写字母)。
使用寡核苷酸aldAF和aldAR从质粒pKD3扩增氯霉素抗性盒。然后通 过电穿孔将获得的PCR产物引入菌株MG1655(pKD46)，其中表达的Red重 组酶允许进行同源重组。然后选择具有卡那霉素抗性的转化子，用下面定义 的寡核苷酸YdcFCf和gapCCR通过PCR分析来确认抗性盒的插入。将保留 的菌株命名为MG1655ΔaldA::Cm。
YdcFCf(SEQIDNO23)：tgcagcggcgcacgatggcgacgttccgccg(与从1485722 至1485752的序列同源)。
gapCCR(SEQIDNO24)：cacgatgacgaccattcatgcctatactggc(与从1488195 至1488225的序列同源)。
为了将缺失ΔaldA::Cm转移，使用噬菌体P1转导的方法。制备菌株 MG1655ΔaldA::Cm的噬菌体裂解物，用于转导入菌株MG1655ΔaceBΔgcl ΔglcDEFGB::Km。
然后选择具有卡那霉素抗性的转化子，并用前面定义的寡核苷酸YdcFCf 和gapCCR通过PCR分析来确认基因ΔaldA::Cm的缺失。将保留的菌株命名 为MG1655ΔaceBΔgclΔglcDEFGB::KmΔaldA::Cm。
然后可以消除卡那霉素和氯霉素抗性盒。然后将携带在卡那霉素和氯霉 素抗性盒的FRT位点起作用的FLP重组酶的质粒pCP20通过电穿孔引入重 组位点。在42℃的一系列培养后，通过使用与先前所用相同的寡核苷酸 (glcBF/glcDR和YdcFCf/gapCCR)通过PCR分析来确认卡那霉素和氯霉素抗 性盒的丢失。将保留的菌株命名为MG1655ΔaceBΔgclΔglcDEFGBΔaldA。
然后将pME101-ycdW质粒引入菌株MG1655ΔaceBΔgclΔglcDEFGBΔaldA。
实施例4
构建乙醛酸途径的通量增加的菌株：MG1655ΔaceBΔgclΔglcDEFGB ΔaldAΔiclR(pME101-ycdW)
用下述寡核苷酸，使用与前述相同的策略，将iclR基因缺失引入MG1655 ΔaceBΔgclΔglcDEFGBΔaldA：
DiclF(SEQIDNO25)
Cgcacccattcccgcgaaacgcggcagaaaacccgccgttgccaccgcaccagcgactggacaggttcag tctttaacgcgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有
-与基因iclR(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参考序列)的序列 (4221202-4221120)同源的区域(小写字母)，
-用于扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS， 97：6640-6645中的参考序列)的区域(大写字母)，
DiclR(SEQIDNO26)
gcgcattccaccgtacgccagcgtcacttccttcgccgctttaatcaccatcgcgccaaactcggtcacgcggt catcggCATATGAATATCCTCCTTAG
具有
-与基因iclR(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参考序列)的序列 (4220386-4220465)同源的区域(小写字母)，
-用于扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS， 97：6640-6645中的参考序列)的区域(大写字母)，
使用寡核苷酸DiclF和DiclR从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒。然后通 过电穿孔将获得的PCR产物引入菌株MG1655ΔaceBΔgclΔglcDEFGBΔaldA (pKD46)。然后选择具有卡那霉素抗性的转化子，用下面定义的寡核苷酸iclF 和iclR通过PCR分析来确认抗性盒的插入。将保留的菌株命名为MG1655 ΔaceBΔgclΔglcDEFGBΔaldAΔiclR::Km。
IclF(SEQIDNO27)：cctttgaggtcgcatggccagtcggc(与从4221558至 4221533的序列同源)。
iclR(SEQIDNO28)：gctttttaatagaggcgtcgccagctccttgcc(与从4219917至 4219949的序列同源)。
然后可以消除卡那霉素抗性盒。然后将携带在卡那霉素抗性盒的FRT位 点起作用的FLP重组酶的质粒pCP20通过电穿孔引入重组位点。在42℃的一 系列培养后，使用与先前所用相同的寡核苷酸(iclF和iclR)通过PCR分析来 确认卡那霉素抗性盒的丢失。将保留的菌株命名为MG1655ΔaceBΔgcl ΔglcDEFGBΔaldAΔiclR。
然后将pME101-ycdW质粒引入菌株MG1655ΔaceBΔgclΔglcDEFGB ΔaldAΔiclR。
实施例5
构建NADPH可用性增加的菌株：MG1655ΔaceBΔgclΔiclRΔglcDEFGB ΔaldAΔedd-eda(pME101-ycdW)
通过转导缺失MG1655ΔaceBΔgclΔglcBΔglcDEFΔaldAΔiclR菌株中的 edd-eda基因。
首先用下述寡核苷酸，使用与前述相同的方法构建菌株MG1655 Δedd-eda::Cm:
DeddF(SEQIDNO29)
Cgcgcgagactcgctctgcttatctcgcccggatagaacaagcgaaaacttcgaccgttcatcgttcgcagtt ggcatgcggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有
-与基因edd-eda(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参考序列)的 区域的序列(1932582-1932500)同源的区域(小写字母)，
-用于扩增氯霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97： 6640-6645中的参考序列)的区域(大写字母)，
DedaR(SEQIDNO30)
gcttagcgccttctacagcttcacgcgccagcttagtaatgcggtcgtaatcgcccgcttccagcgcatctgcc ggaaccCATATGAATATCCTCCTTAG
具有
-与基因edd-eda(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参考序列)的 区域的序列(1930144-1930223)同源的区域(小写字母)，
-用于扩增氯霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97： 6640-6645中的参考序列)的区域(大写字母)，
使用寡核苷酸DeddF和DedaR从质粒pKD3扩增氯霉素抗性盒。然后通 过电穿孔将获得的PCR产物引入菌株MG1655(pKD46)。然后选择具有氯霉 素抗性的转化子，用下面定义的寡核苷酸eddF和edaR通过PCR分析来确认 抗性盒的插入。将保留的菌株命名为MG1655Δedd-eda::Cm。
eddF(SEQIDNO31)：Gggtagactccattactgaggcgtgggcg(与序列1932996至 1932968的序列同源)。
edaR(SEQIDNO32)：ccacatgataccgggatggtgacg(与从1929754至 1929777的序列同源)
为了将缺失Δedd-eda::Cm转移，如前所述使用噬菌体P1转导的方法。 制备菌株MG1655Δedd-eda::Cm的噬菌体裂解物，用于转导入菌株MG1655 ΔaceBΔgclΔglcDEFGBΔaldAΔiclR。
然后选择具有氯霉素抗性的转化子，并用寡核苷酸eddF和edaR通过PCR 分析来确认基因Δedd-eda::Cm的缺失。将保留的菌株命名为MG1655ΔaceB ΔgclΔglcBΔglcDEFΔaldAΔiclRΔedd-eda::Cm。
然后可以消除氯霉素抗性盒。然后将携带在氯霉素抗性盒的FRT位点起 作用的FLP重组酶的质粒pCP20通过电穿孔引入重组位点。在42℃的一系列 培养后，通过使用与先前所用相同的寡核苷酸(eddF和edaR)通过PCR分析来 确认氯霉素抗性盒的丢失。将保留的菌株命名为MG1655ΔaceBΔgcl ΔglcDEFGBΔaldAΔiclRΔedd-eda。
然后将pME101-ycdW质粒引入菌株MG1655ΔaceBΔgclΔglcDEFGB ΔaldAΔiclRΔedd-eda。
实施例6
构建NADPH可用性增加的菌株：MG1655ΔaceBΔgclΔiclRΔglcDEFGB ΔaldAΔpgi::CmΔedd-eda(pME101-ycdW)
用下述寡核苷酸，使用与前述相同的策略将pgi基因缺失引入MG1655 ΔaceBΔgclΔglcBΔglcDEFΔaldAΔiclRΔedd-eda。
DpgiF(SEQIDNO33)
ccaacgcagaccgctgcctggcaggcactacagaaacacttcgatgaaatgaaagacgttacgatcgccgat ctttttgcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有
-与基因pgi(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参考序列)的序列 (4231352-4231432)同源的区域(小写字母)，
-用于扩增氯霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97： 6640-6645中的参考序列)的区域(大写字母)，
DpgiR(SEQIDNO34)
gcgccacgctttatagcggttaatcagaccattggtcgagctatcgtggctgctgatttctttatcatctttcagctc tgCATATGAATATCCTCCTTAG
具有
-与基因pgi(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参考序列)的序列 (4232980-4232901)同源的区域(小写字母)，
-用于扩增氯霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97: 6640-6645中的参考序列)的区域(大写字母)，
使用寡核苷酸DpgiF和DpgiR从质粒pKD3扩增氯霉素抗性盒。然后通过 电穿孔将获得的PCR产物引入菌株MG1655ΔaceBΔgclΔglcBΔglcDEFΔaldA ΔiclRΔedd-eda(pKD46)。然后选择具有氯霉素抗性的转化子，用下面定义的 寡核苷酸pgiF和pgiR通过PCR分析来确认抗性盒的插入。将保留的菌株命名 为MG1655ΔaceBΔgclΔglcBΔglcDEFΔaldAΔiclRΔedd-edaΔpgi::Cm。
pgiF(SEQIDNO35)：gcggggcggttgtcaacgatggggtcatgc(与从4231138至 4231167的序列同源)。
pgiR(SEQIDNO36)：cggtatgatttccgttaaattacagacaag(与从4233220至 4233191的序列同源)。
然后将pME101-ycdW质粒引入菌株MG1655ΔaceBΔgclΔglcDEFGB ΔaldAΔiclRΔedd-edaΔpgi::Cm。
实施例7
构建NADPH可用性增加的菌株：MG1655ΔaceBΔgclΔiclRΔglcDEFGB ΔaldAΔpgiΔedd-eda::CmΔudhA::Km(pME101-ycdW)
用下述寡核苷酸，使用与前述相同的策略将udhA基因缺失引入MG1655 ΔaceBΔgclΔglcDEFGBΔaldAΔiclRΔpgi::CmΔedd-eda。
DudhAF(SEQIDNO37)
CCCAGAATCTCTTTTGTTTCCCGATGGAACAAAATTTTCAGCGTGCCCA CGTTCATGCCGACGATTTGTGCGCGTGCCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有
-与基因udhA(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参考序列)的序 列(4157588-4157667)同源的区域(加粗字母)，
-用于扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS， 97：6640-6645中的参考序列)的区域(下划线字母)，
DudhAR(SEQIDNO38)
GGTGCGCGCGTCGCAGTTATCGAGCGTTATCAAAATGTTGGCGGCGGT TGCACCCACTGGGGCACCATCCCGTCGAAAGCCATATGAATATCCTCCTTAG
具有
-与基因udhA(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参考序列)的序 列(4158729-4158650)同源的区域(加粗字母)，
-用于扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS， 97：6640-6645中的参考序列)的区域(下划线字母)，
使用寡核苷酸DudhAF和DudhAR从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒。 然后通过电穿孔将获得的PCR产物引入菌株MG1655ΔaceBΔgcl ΔglcDEFGBΔaldAΔiclRΔpgi::CmΔedd-eda(pKD46)。然后选择具有卡那霉素 抗性的转化子，用下面定义的寡核苷酸udhAF和udhAR通过PCR分析来确 认抗性盒的插入。将保留的菌株命名为MG1655ΔaceBΔgclΔglcDEFGB ΔaldAΔiclRΔpgi::CmΔedd-edaΔudhA::Km。
udhAF(SEQIDNO39)：(与从4157088至4157108的序列同源)。
GATGCTGGAAGATGGTCACT
udhAR(SEQIDNO40)：(与从4159070至4159052的序列同源)。
gtgaatgaacggtaacgc
然后将pME101-ycdW质粒引入菌株MG1655ΔaceBΔgclΔglcDEFGB ΔaldAΔiclRΔpgi::CmΔedd-edaΔudhA::Km。
实施例8
产生乙醇酸的菌株在锥形瓶中的发酵
首先使用经过修正的M9培养基(Anderson，1946，Proc.Natl.Acad.Sci. USA32：120-128)，所述培养基中补加40g/lMOPS和10g/l葡萄糖，并调至 pH6.8，在250ml带挡板的锥形瓶中评价菌株的表现。如果需要的话，加入 浓度为50mg/l的壮观霉素(spectinomycin)，如果存在表达载体的话，还加入 100μmIPTG用于诱导表达载体。使用过夜的预培养物接种50ml培养液至 OD600nm为约0.3。将培养液于30℃和400rpm置于摇床上，直至培养基中的 葡萄糖耗尽。在培养结束时，使用BioradHPX97H柱用于分离和折射计用于 检测，通过HPLC分析葡萄糖和乙醇酸。
下表中给出了对不同菌株的表现的比较(每个数值均为n次重复的平均 值)。实施例1中描述的菌株未显示任何的乙醇酸产生。
来自实施例n° 的菌株 2 3 4 5 6 7 基因型 (大肠杆菌 MG1655) ΔaceB Δgcl ΔglcB (pME101- ycdW) ΔaceB Δgcl ΔglcDEF GB aldA (pME101- ycdW) ΔaceB Δgcl ΔglcDEF GB ΔaldA ΔiclR (pME101- ycdW) ΔaceB Δgcl ΔglcDEF GB ΔaldA ΔiclR Δedd-eda (pME101- ycdW) ΔaceB Δgcl ΔglcDEF GB ΔaldA ΔiclR Δedd-eda Δpgi (pME101- ycdW) ΔaceB Δgcl ΔglcDEF GB ΔaldA ΔiclR Δedd-eda Δpgi ΔudhA (pME101- ycdW) 乙醇酸产量 (g/l) 0.28 (n＝3) 0.28 (n＝8) 0.65 (n＝8) 1.73 (n＝8) 2.75 (n＝6) 2.33 (n＝4) 得率(g乙醇酸 /g葡萄糖) 0.03 (n＝3) 0.03 (n＝8) 0.07 (n＝8) 0.17 (n＝8) 0.29 (n＝6) 0.25 (n＝4)
实施例6和实施例7中所述菌株是乙醇酸的最佳生产菌株，其效价(titer) 高于2g/l，而且得率高于0.2g/g。
实施例9
产生乙醇酸的菌株在补料分批(FEDBATCH)发酵罐中的发酵
使用补料分批发酵方法，在600ml发酵罐中在产生条件下评价实施例6 和实施例7中所述菌株。
在30℃在补充以2.5g/l葡萄糖的LB培养基中进行试管中的第一次预培 养，然后在30℃在装有50ml补充以40g/lMOPS和10g/l葡萄糖的合成培养 基(与用于摇瓶培养相同的培养基)的500ml锥形瓶中进行第二次预培养。使 用此第二次预培养物接种发酵罐。
以大约2的初始光密度接种发酵罐，所述发酵罐中装有200ml补充以40 g/l葡萄糖、50mg/l壮观霉素和100μMIPTG的合成培养基。在30℃搅拌和通 气下进行培养，调整搅拌和通气以保持溶解氧高于30％饱和度。通过加入碱将 pH调至6.8。以分批模式进行培养直至葡萄糖耗尽。此时，加入补充以硫酸镁、 微量元素(oligo-element)、壮观霉素和IPTG的500g/l葡萄糖溶液，使培养基 中葡萄糖的浓度恢复为40g/l。每次当葡萄糖耗尽时再进行其它添加。
通常地，实施例7中所述菌株比实施例6中所述菌株在发酵罐中给出更 好的生产性能(从葡萄糖的得率为0.22g/g对0.15g/g)。
下面给出使用实施例7的菌株产生乙醇酸的发酵的代表性时间过程。
时间(h) OD600nm(AU) 葡萄糖(g/l) 乙醇酸(g/l) 0 2.0 35.45 0.11 16 3.7 34.70 0.57 20 5.1 33.25 1.14 25 6.7 31.24 1.81 39 14.8 20.55 4.75 44 20.3 12.24 7.02 49 27.9 2.48 9.44 64 53.9 7.94 18.80 70 62.8 33.97 21.76 73 67.8 24.54 23.54 87 84.0 36.60 28.70 93 89.6 25.61 31.33
获得的最终效价为31g/l乙醇酸，对葡萄糖的得率为0.22g/g。
序列表
<110>代谢探索者公司(METABOLICEXPLORER)
<120>从可再生资源通过发酵产生乙醇酸
<130>351388D24477
<150>PCT/EP2006/063046
<151>2006-06-09
<160>40
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>1
ggcaacaacaaccgatgaactggctttcacaaggccgtatggcgagcaggagaagcaaat60
tcttactgccgaagcggtagcatatgaatatcctccttag100
<210>2
<211>99
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>2
ggcggtagcctggcagggtcaggaaatcaattaactcatcggaagtggtgatctgttcca60
tcaagcgtgcggcatcgtctgtaggctggagctgcttcg99
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>3
cgttaagcgattcagcaccttacc24
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>4
ccagtttctgaatagcttcc20
<210>5
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>5
ggcaaaaatgagagccgttgacgcggcaatgtatgtgctggagaaagaaggtatcactac60
cgccttcggtgttccgggagctgtaggctggagctgcttcg101
<210>6
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>6
gcgttacgttttaacggtacggatccatccagcgtaaaccggcttccgtggtggtttggg60
gtttatattcacacccaaccccatatgaatatcctccttag101
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>7
ggatatgcccaccttgctgaagg23
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>8
cgcttagtttcaatcggggaaatgg25
<210>9
<211>99
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>9
cccagagccgtttacgcattgacgccaattttaaacgttttgtggatgaagaagttttac60
cgggaacagggctggacgccatatgaatatcctccttag99
<210>10
<211>99
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>10
cgcgtaaacgccaggcgtgtaataacggttcggtatagccgtttggctgtttcacgccga60
ggaagattaaatcgctggctgtaggctggagctgcttcg99
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>11
gccagcaaatggcgagtgc19
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>12
cgcagagtatcgttaagatgtcc23
<210>13
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<212>DNA
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