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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810200594.9 (22)申请日 2018.03.12 (71)申请人 福建省微生物研究所 地址 350007 福建省福州市仓山区进步路 25号 (72)发明人 聂毅磊陈宏 (74)专利代理机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 44001 代理人 郝文婷刘明星 (51)Int.Cl. C12N 1/38(2006.01) C12N 1/12(2006.01) C12R 1/89(2006.01) (54)发明名称 一种提高小球藻胞内蛋白质和叶绿素含量 的方法 (57)。
2、摘要 本发明公开了一种提高小球藻胞内蛋白质 和叶绿素含量的方法。 本发明是在小球藻培养过 程中， 将大豆豆芽提取液加入到小球藻培养液中 进行培养。 本发明方法操作简便、 成本低， 可以显 著提高小球藻胞内蛋白质和叶绿素含量， 提升小 球藻的品质， 使其作为单细胞蛋白质资源、 饲料 蛋白替代品或添加剂发挥更大的作用。 权利要求书1页 说明书3页 CN 108277193 A 2018.07.13 CN 108277193 A 1.一种提高小球藻胞内蛋白质和叶绿素含量的方法， 其特征在于， 其是在小球藻培养 过程中， 将大豆豆芽提取液加入到小球藻培养液中进行培养。 2.根据权利要求1所述提高小球藻。
3、胞内蛋白质和叶绿素含量的方法， 其特征在于， 所述 大豆豆芽提取液的制备方法是： 取长0.51.0cm的大豆豆芽， 晾干粉碎得到粉碎物， 每克粉 碎物加入2030mL磷酸盐缓冲液， 超声浸提、 过滤除菌， 即得。 3.根据权利要求11或2所述提高小球藻胞内蛋白质和叶绿素含量的方法， 其特征在于， 当培养液中的小球藻细胞生物量达到最大时， 加入所述大豆豆芽提取液。 4.根据权利要求3所述提高小球藻胞内蛋白质和叶绿素含量的方法， 其特征在于， 当培 养液的OD值为3.05.0时， 培养液中的小球藻细胞生物量达到最大。 5.根据权利要求1或2所述提高小球藻胞内蛋白质和叶绿素含量的方法， 其特征在于，。
4、 所述大豆豆芽提取液的添加体积是小球藻培养液体积的0.1。 6.根据权利要求1所述提高小球藻胞内蛋白质和叶绿素含量的方法， 其特征在于， 所述 小球藻培养使用的生长培养基的pH为6.07.5， 每升所述生长培养基含有如下组分： 可溶 性淀粉1.21.5g， 蛋白胨0.91.1g， K2HPO43H2O 0.40.6g， MgSO47H2O 0.80.9g， NaCl 0.40.6g， MnCl24H2O 0.0080.01g， AlCl30.0080.01g， FeSO47H2O 0.009 0.01g， 余量为水。 7.根据权利要求1所述提高小球藻胞内蛋白质和叶绿素含量的方法， 其特征在于，。
5、 所述 培养的条件是： 光照度30006000lx、 光暗周期12:12LD、 温度2528、 150180rpm振荡 培养。 8.根据权利要求2所述提高小球藻胞内蛋白质和叶绿素含量的方法， 其特征在于， 所述 磷酸盐缓冲液是将0.2M的磷酸二氢钠水溶液与0.2M的磷酸氢二钠水溶液按照51:49的体积 比混合得到。 9.根据权利要求2所述提高小球藻胞内蛋白质和叶绿素含量的方法， 其特征在于， 所述 超声浸提的时间为60min。 10.根据权利要求2所述提高小球藻胞内蛋白质和叶绿素含量的方法， 其特征在于， 所 述过滤除菌是纱布过滤后， 使用0.22 m滤膜过滤除菌。 权利要求书 1/1 页 2。
6、 CN 108277193 A 2 一种提高小球藻胞内蛋白质和叶绿素含量的方法 技术领域 0001 本发明属于微生物培养技术领域， 更具体地说， 本发明涉及一种提高小球藻胞内 蛋白质和叶绿素含量的方法。 背景技术 0002 自上世纪50年代起， 科学家们开始探索新型可替代的蛋白质资源， 对酵母、 真菌、 细菌和微藻等进行了广泛研究， 以应对未来的蛋白质供应短缺危机。 0003 小球藻(Chlorella vulgaris)是一类普生性单细胞绿藻， 直径约312 m， 呈椭圆 形或球形。 其种类繁多 ， 生态类型多样 ， 分布广 ， 其中椭圆小球藻 (Chlorella ellipsoidea)。
7、、 蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidesa)和普通小球藻(Chlorella vulgaris)是我国比较常见及广泛应用的种类。 目前小球藻已广泛应用到医药、 化妆品、 保 健品、 食品及饲料等领域。 0004 小球藻在自养生长下可积累大量蛋白质和叶绿素， 其氨基酸组成高于世界卫生组 织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)颁布的用于人类营养的蛋白质标准， 是一种食用安全的优 质单细胞蛋白质资源。 小球藻还能作为传统饲料蛋白(大豆粉和鱼粉等)的部分替代品， 以 及畜禽和水产饲料添加剂。 其中， 小球藻胞内蛋白质和叶绿素含量， 是评价小球藻品质的最 重要指标。 发明内容 0005 。
8、本发明的目的在于： 提供一种操作简便、 成本低且效果显著的提高小球藻胞内蛋 白质和叶绿素含量的方法。 0006 为了实现上述发明目的， 本发明提供了一种提高小球藻胞内蛋白质和叶绿素含量 的方法， 是在小球藻培养过程中(可以观察到培养液逐渐变绿甚至深绿色)， 将大豆豆芽提 取液加入到小球藻培养液中进行培养。 0007 其中， 所述大豆豆芽提取液的制备方法是： 取长0.51.0cm的大豆豆芽， 晾干粉碎 得到粉碎物， 每克粉碎物加入2030mL磷酸盐缓冲液， 超声浸提、 过滤除菌， 即得。 0008 本发明上述方法中所述大豆豆芽使用的大豆学名为： Glycine max(Linn.)Merr.， 。
9、俗称黄豆， 属被子植物门、 双子叶植物纲、 蔷薇目、 豆科、 大豆属， 在我国分布广泛。 0009 优选地， 当培养液中的小球藻细胞生物量达到最大时， 加入所述大豆豆芽提取液。 可以在680nm波长下测定培养液中小球藻细胞的浓度， 当培养液的OD值为3.05.0时， 培养 液中的小球藻细胞生物量达到最大。 0010 优选地， 所述大豆豆芽提取液的添加体积是小球藻培养液体积的0.1。 0011 优选地， 所述生长培养基的pH为6.07.5， 每升所述生长培养基含有如下组分： 可 溶性淀粉1.21.5g， 蛋白胨0.91.1g， K2HPO43H2O 0.40.6g， MgSO47H2O 0.80。
10、.9g， NaCl 0.40.6g， MnCl24H2O 0.0080.01g， AlCl3 0.0080.01g， FeSO47H2O 0.009 0.01g， 余量为水。 所述生长培养基经过121高压灭菌2030min后方可使用。 0012 优选地， 所述磷酸盐缓冲液是将0.2M的磷酸二氢钠水溶液与0.2M的磷酸氢二钠水 溶液按照51:49的体积比混合得到。 说明书 1/3 页 3 CN 108277193 A 3 0013 优选地， 所述光照培养的条件是： 光照度50006000lx、 24h连续光照、 温度2528 、 150180rpm振荡培养。 0014 优选地， 所述超声浸提的时。
11、间为60min。 0015 优选地， 所述过滤为纱布过滤。 0016 优选地， 所述除菌是使用0.22 m滤膜过滤除菌。 0017 相对于现有技术， 本发明具有如下有益效果： 0018 (1)本发明通过在小球藻培养液中加入大豆豆芽提取液， 大豆豆芽中含有的细胞 分裂素或其它生物活性物质促进了小球藻细胞分裂、 再生和形态建成， 从而提高小球藻胞 内的叶绿素含量,增加蛋白质水平。 0019 (2)本发明方法操作简便， 成本低。 0020 (3)本发明方法可显著提升小球藻的品质， 使其作为单细胞蛋白质资源、 饲料蛋白 替代品或添加剂发挥更大的作用， 具有良好的经济效益。 具体实施方式 0021 为了。
12、使本发明的目的、 技术方案和有益技术效果更加清晰， 以下结合实施例， 对本 发明进行进一步详细说明。 应当理解的是， 本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发 明， 并非为了限定本发明， 实施例的参数、 比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性 影响。 0022 实施例1 0023 刮取少量微小小球藻(Chlorella minutissima)藻种， 加入到盛有200mL生长培养 基的三角瓶中， 光照度6000lx， 光暗周期12:12LD， 温度25， 150rpm条件下振荡培养。 可观 察到培养液颜色逐渐变绿至深绿色。 在680nm波长下测定藻体细胞浓度， 当OD值为3.05.0 时结。
13、束第一阶段的培养。 此时， 藻细胞生物量达到最大。 取大豆豆芽提取液， 按0.1比例 (v/v)添加到培养液中， 光照度6000lx， 光暗周期12:12LD， 温度25， 150rpm条件下振荡培 养。 同时， 以不添加大豆豆芽提取液为对照组， 设立三个平行对照组。 23d后， 取相同体积 的藻液， 4500rpm离心， 去除上清液， 藻体置于85恒温烘箱烘干至恒重。 测定藻体细胞的蛋 白质和叶绿素含量， 计算各组测定值的平均值。 实验结果表明： 未添加大豆豆芽提取液的对 照组， 其蛋白质含量为43， 叶绿素含量为2.55。 而添加大豆豆芽提取液的实验组， 其蛋 白质含量为51， 叶绿素含量。
14、为3.1。 添加大豆豆芽提取液的实验组比未添加大豆豆芽提 取液的对照组其蛋白质含量和叶绿素含量分别增加18.6和21.6。 由此可见， 在微小小 球藻培养液中添加大豆豆芽提取液可显著增强微小小球藻胞内蛋白质和叶绿素的含量， 提 升微小小球藻的品质。 0024 生长培养基： 可溶性淀粉1.21.5g， 蛋白胨0.91.1g， K2HPO43H2O 0.40.6g， MgSO47H2O 0.80.9g， NaCl 0.40.6g， MnCl24H2O 0.0080.01g， AlCl3 0.008 0.01g， FeSO47H2O 0.0090.01g， 余量为水， 定容至1L， NaOH或HCL。
15、调节pH至6.07.5。 分 装于500mL三角瓶中。 121高压灭菌2030min。 0025 大豆豆芽提取液制备： 取生长至长约0.5-1.0cm的(黄豆)豆芽， 水清洗， 晾干， 碾 碎。 称取1g， 加入2030mL磷酸盐缓冲液， 超声浸提60min， 纱布过滤， 滤液再经0.22 m滤膜 过滤除菌， 滤液按0.1比例(v/v)添加到培养液中。 说明书 2/3 页 4 CN 108277193 A 4 0026 磷酸盐缓冲液： A液(0.2M磷酸二氢钠水溶液)： NaH2PO4H2O 27.6g， 溶于蒸馏水 中， 稀释至1000ml。 B液(0.2M磷酸氢二钠水溶液)： Na2HPO。
16、47H2O 53.6g(或Na2HPO412H2O 71.6g或Na2HPO42H2O 35.6g)加蒸馏水溶解， 加水至1000ml。 取51.0mLA液加入到49mL B液 中， 得到磷酸盐缓冲液。 0027 蛋白质含量测定方法： 采用FOSS公司的半自动凯氏定氮仪测定蛋白质含量。 由样 品中氮含量， 换算得出藻粉中蛋白质含量。 具体操作步骤： 准确称取50mg冷冻干燥至恒重的 小球藻藻粉， 放入KJELTECTM2300型半自动凯氏定氮仪配套消化管中， 加入10ml浓硫酸于消 化管中， 再加入催化剂片剂， 放入消化炉， 420消化2h， 待消解液冷却后放入已去除空白的 凯氏定氮仪中测定蛋。
17、白质含量。 0028 叶绿素含量测定方法： 称取10mg冷冻干燥至恒重的小球藻藻粉， 于10mL螺口管中， 加入80丙酮9mL， 在4冰箱中放置24h， 冰浴下超声波破碎细胞90s， 12000r/min离心 6min， 吸取上清液测OD412、 OD431、 OD460和OD480， 按下列公式计算： 叶绿素a含量1.709OD412 +11.97OD431-2.998OD460-5.708OD480； 叶绿素b含量0.171OD412-0.230OD431+ 11.871OD460-13.248OD480叶绿素总量叶绿素a+叶绿素b。 0029 实施例2 0030 刮取少量普通小球藻(Ch。
18、lorella vulgaris)藻种， 加入到盛有200mL生长培养基 的三角瓶中， 光照度3000lx， 光暗周期12:12LD， 温度28， 180rpm条件下振荡培养。 可观察 到培养液颜色逐渐变绿至深绿色。 在680nm波长下测定藻体细胞浓度， 当OD值为3.05.0时 结束第一阶段的培养。 此时， 藻细胞生物量达到最大。 取大豆豆芽提取液， 按0.1比例(v/ v)添加到培养液中， 光照度3000lx， 光暗周期12:12LD， 温度28， 180rpm条件下振荡培养。 同时， 以不添加大豆豆芽提取液为对照组， 设立三个平行对照组。 23d后， 取相同体积的藻 液， 4500rpm。
19、离心， 去除上清液， 藻体置于85恒温烘箱烘干至恒重。 测定藻体细胞的蛋白质 和叶绿素含量， 计算各组测定值的平均值。 实验结果表明： 未添加大豆豆芽提取液的对照 组， 其蛋白质含量为36.2， 叶绿素a含量为1.86。 而添加大豆豆芽提取液的实验组， 其蛋 白质含量为43.5， 叶绿素含量为2.21。 添加大豆豆芽提取液的实验组比未添加大豆豆 芽提取液的对照组其蛋白质含量和叶绿素含量分别增加20.17和18.82。 由此可见， 在 普通小球藻培养液中添加大豆豆芽提取液可增强普通小球藻胞内蛋白质和叶绿素的含量， 提升普通小球藻的品质。 根据上述说明书的揭示和教导， 本发明所属领域的技术人员还可 以对上述实施方式进行适当的变更和修改。 因此， 本发明并不局限于上面揭示和描述的具 体实施方式， 对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。 此 外， 尽管本说明书中使用了一些特定的术语， 但这些术语只是为了方便说明， 并不对本发明 构成任何限制。 说明书 3/3 页 5 CN 108277193 A 5 。