一种黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810058717.X (22)申请日 2018.01.22 (71)申请人 厦门市产品质量监督检验院 地址 361000 福建省厦门市思明区湖滨南 路170号三楼 申请人 集美大学 (72)发明人 韩芳宋青王小龙白泽清 高静林伟琦侯晓阳方荣谦 白荣汉王水亮张倩王志伟 (74)专利代理机构 厦门市首创君合专利事务所 有限公司 35204 代理人 张松亭姜谧 (51)Int.Cl. C12N 15/53(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1。

2、/686(2018.01) (54)发明名称 一种黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因及其 应用 (57)摘要 本发明公开了一种黄姑鱼超氧化物歧化酶 MnSOD基因及其应用， 其cDNA包括如SEQIDNO 01所示的序列。 本发明首次从黄姑鱼的肝脏组织 中克隆到一种超氧化物歧化酶MnSOD基因的 cDNA。 采用本发明试剂盒首次研究氨氮急性攻毒 后， 黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因mRNA表达 的时相变化， 该mRNA表达水平的检测在氨氮对黄 姑鱼的污染检测中作为一种生物标记， 在黄姑鱼 对氨氮环境预警中有重要的应用前景， 并为黄姑 鱼的健康状态和生长环境安全的检测奠定基础。 权利要求书1。

3、页 说明书4页 序列表2页 附图1页 CN 108374016 A 2018.08.07 CN 108374016 A 1.一种黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因， 其特征在于： 其cDNA包括如SEQ ID NO 01所 示的序列。 2.如权利要求1所述的一种黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因， 其特征在于： 所述cDNA 以黄姑鱼肝脏组织总cDNA为模板， 以正向引物F1和反向引物R1为扩增引物对， 通过PCR反应 获得， 其中， F1包括SEQ ID NO 02所示的序列， R1包括如SEQ ID NO 03所示的序列。 3.一种氨氮污染PCR检测试剂盒， 其特征在于： 基于实时荧光定量。

4、PCR， 以黄姑鱼组织中 的权利要求1所述的黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因为检测对象， 包括检测引物对和内参 引物对， 其中， 检测引物对包括正向引物F2和反向引物R2， 内参引物对包括用于检测黄姑鱼 管家基因 -actin的正向引物F3和反向引物R3。 4.如权利要求3所述的一种氨氮污染PCR检测试剂盒， 其特征在于： 所述黄姑鱼组织为 黄姑鱼的肝脏组织和鳃组织。 5.如权利要求3所述的一种氨氮污染PCR检测试剂盒， 其特征在于： 所述正向引物F2和 反向引物R2分别包括如SEQ ID NO 04和05所示的序列。 6.如权利要求3所述的一种氨氮污染PCR检测试剂盒， 其特征在于： 所述。

5、正向引物F3和 反向引物R3分别包括如SEQ ID NO 06和07所示的序列。 7.一种权利要求3至6中任一权利要求所述的氨氮污染PCR检测试剂盒的使用方法， 其 特征在于： 包括如下步骤： (1)取不同的黄姑鱼组织， 提取相应的总RNA， 然后反转录得到相应的cDNA， 以此为模 板， 通过实时荧光定量PCR扩增所述黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因； (2)采用2- Ct法对上述黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因的mRNA的时相差异表达进行 分析。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108374016 A 2 一种黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因及其应用 技术领域 0001 本发明属于。

6、氨氮污染检测技术领域， 具体涉及一种黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD 基因及其应用。 背景技术 0002 黄姑鱼(Nibea albiflora)是我国重要经济鱼类之一， 主要分布在我国沿海、 日本 及朝鲜西南岸， 在我国近海鱼类资源中占有重要地位。 海水网箱养殖黄姑鱼， 具有生长快、 抗病力强等优点， 在我国东南沿海迅速发展， 然而， 受农业径流及养殖水体内有机物(包括 养殖动物排泄物、 残饵及动植物尸体等)分解的影响， 氨氮等对鱼类有明显毒害作用的污染 物不断积累， 影响黄姑鱼的健康生长。 研究表明， 高浓度的氨氮会造成水生生物氧化损伤、 离子失衡、 伤害鱼体组织结构、 鱼类生长迟缓甚至死亡。

7、(Sinha A K， Abdelgawad H， Giblen T， et al.Anti-oxidative defences are modulated differentially in three freshwater teleosts in response to ammonia-induced oxidative stress.J.Plos One， 2014， 9(4)： e95319； Benli A C K， G， A.Sublethal ammonia exposure of Nile tilapia(Oreochromis niloticus， L.)： Effects。

8、 on gill， liver and kidney histologyJ.Chemosphere， 2008， 72(9)： 1355-1358.)。 0003 超氧化物歧化酶(SOD， EC 1.15.1.1)是抗氧化系统的关键酶， 在清除活性氧(ROS) 的过程中发挥重要的作用， 能将ROS快速歧化为普通分子氧和过氧化氢。 截至目前， 自然界 中已发现6种SOD， 按其所含金属辅基不同可分为： MnSOD、 CuZnSOD、 FeSOD、 NiSOD、 MnFeSOD和 FeZnSOD(张克烽， 张子平， 陈芸， 等.动物抗氧化系统中主要抗氧化酶基因的研究进展J. 动物学杂志， 2007。

9、， 42(2)： 153-160)， 但是， 目前只有MnSOD和Zn/CuSOD在鱼类中有发现。 当 前， 针对MnSOD的研究主要集中在哺乳动物中， 在鱼类中的研究相对较少， 虽然MnSOD的基因 在少数鱼中已经克隆出来， 但是， 其在黄姑鱼中的研究还未报道， 此外， 氨氮对黄姑鱼中 MnSOD基因mRNA的表达情况的影响也尚未报道。 因此， 通过黄姑鱼MnSOD基因对氨氮的应急 反应， 可检测环境中氨氮对黄姑鱼生长造成的危害， 同时也是黄姑鱼养殖环境预警的一种 有效方法。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因。 0005 本发明的另一目的在于提供。

10、上述黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因的应用。 0006 本发明的技术方案如下： 0007 一种黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因， 其cDNA包括如SEQ ID NO 01所示的序列。 0008 在本发明的一个优选实施方案中， 所述cDNA以黄姑鱼肝脏组织总cDNA为模板， 以 正向引物F1和反向引物R1为扩增引物对， 通过PCR反应获得， 其中， F1包括SEQ ID NO 02所 示的序列， R1包括如SEQ ID NO 03所示的序列。 0009 一种氨氮污染PCR检测试剂盒， 基于实时荧光定量PCR， 以黄姑鱼组织中的上述黄 说明书 1/4 页 3 CN 108374016 A 3 。

11、姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因为检测对象， 包括检测引物对和内参引物对， 其中， 检测引 物对包括正向引物F2和反向引物R2， 内参引物对包括用于检测黄姑鱼管家基因 -actin的 正向引物F3和反向引物R3。 0010 在本发明的一个优选实施方案中， 所述黄姑鱼组织为黄姑鱼的肝脏组织和鳃组 织。 0011 在本发明的一个优选实施方案中， 所述正向引物F2和反向引物R2分别包括如SEQ ID NO 04和05所示的序列。 0012 在本发明的一个优选实施方案中， 所述正向引物F3和反向引物R3分别包括如SEQ ID NO 06和07所示的序列。 0013 上述氨氮污染PCR检测试剂盒的使用方。

12、法， 包括如下步骤： 0014 (1)取不同的黄姑鱼组织， 提取相应的总RNA， 然后反转录得到相应的cDNA， 以此为 模板， 通过实时荧光定量PCR扩增所述黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因； 0015 (2)采用2- Ct法对上述黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因的mRNA的时相差异表达 进行分析。 0016 本发明的有益效果是： 0017 1、 本发明首次从黄姑鱼的肝脏组织中克隆到一种超氧化物歧化酶MnSOD基因的 cDNA。 0018 2、 采用本发明试剂盒首次研究氨氮急性攻毒后， 黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基 因mRNA表达的时相变化， 该mRNA表达水平的检测在氨氮对黄姑鱼的。

13、污染检测中作为一种生 物标记， 在黄姑鱼水产养殖中对氨氮的预警有重要应用前景， 并为黄姑鱼的健康状态和生 长环境安全的检测奠定基础。 附图说明 0019 图1为本发明实施例2的实验结果图。 具体实施方式 0020 以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。 0021 实施例1超氧化物歧化酶MnSOD基因的克隆 0022 1.黄姑鱼肝脏总RNA的提取： 用手术剪刀解剖活的黄姑鱼， 取少量肝脏组织置于 RNA保护液中用于RNA的提取。 肝脏总RNA的提取使用北京全式金生物技术有限公司的 TransZol Up Plus RNA Kit， 提取方法参照使用说明书， 并采用。

14、RNase-free Dnase (Promega， USA)除去其中的DNA杂质， 产物于1琼脂糖凝胶电泳以检测RNA质量。 0023 2.黄姑鱼cDNA： cDNA第一条链的合成采用GoScriptTM Reverse Transcription kit(Promega， USA)并参照其实验说明具体操作。 0024 3.黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因克隆 0025 (1)通过PCR技术扩增黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因， 其中正向引物F1： 5 ATGAGCACTATCATGAACAT 3 (SEQ ID NO 02)， 反向引物R1： 5 CTACTTTTTGGCGATCTG 。

15、3 (SEQ ID NO 03)； 0026 PCR的试剂与条件： 说明书 2/4 页 4 CN 108374016 A 4 0027 10 xTaq DNA聚合酶缓冲液(Mg2+浓度为20mM)2 l 0028 模板肝脏cDNA 1 L 0029 正向引物F1(10 M)1 L 0030 反向引物R1(10 M)1 L 0031 脱氧核苷酸混合物(dNTP， 10mM)1.6 L 0032 Taq DNA聚合酶(5U/ L)0.5 L 0033 灭菌双蒸水12.9 L； 0034 PCR反应程序为： 94预变性5min； 然后30个下列循环： 94变性30s， 59退火 30s， 72延伸1。

16、min； 最后72延伸10min， 1.2琼脂糖凝胶电泳检测。 0035 (2)反应产物纯化： 利用北京全式金生物技术有限公司产品(EasyPure Quick Gel Extraction Kit)对PCR产物进行纯化， 操作步骤按产品说明书进行。 0036 (3)cDNA序列： 纯化后的PCR产物与pMD 19-T载体(宝生物工程(大连)有限公司)连 接， 之后采用转化DH5 (天根公司)菌株进行蓝白斑筛选， 挑取单克隆白斑扩增培养后， 提取 质粒， 以F1、 R1为引物对所提取的质粒做PCR检测， 确认插入及片段大小后进行测序验证。 测 序结果显示， 黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因c。

17、DNA全长共949bp(SEQ ID NO 01所示)， 包 括38bp的5 非编码区、 233bp的3 非编码区和678bp的开放阅读框， 该阅读框编码225个氨基 酸。 0037 实施例2 0038 本实施例根据实施例1克隆方法得到的黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因cDNA序 列， 设计相应引物， 检测被氨氮攻毒后， 该基因在肝脏和鳃组织中的mRNA表达变化。 0039 1.试验健康黄姑鱼体长为8.80.5cm， 体重为100.5g/尾。 实验前在温度为24- 26， 盐度为27-28psu和pH为7.7-7.9的充气海水中驯养两周， 备氨氮毒性试验。 20尾试验 黄姑鱼， 暴露于氯化铵。

18、(96h半致死浓度20.23mg/L)溶液中， 试验过程不投饵， 每12h用 20.23mg/L的氯化铵溶液换水1次， 换水量为50。 在攻毒0、 12、 24h后随机捞取5尾鱼， 分别 取肝脏和鳃组织， 液态氮冷冻， 存放于-80超低温冰箱备RNA提取。 实验重复3次。 0040 2.按照实施例1中组织总RNA提取方法和cDNA第一条链的合成方法， 分别提取氨氮 毒性试验黄姑鱼肝脏和鳃的总RNA并且合成cDNA第一条链， 以此为qRT-PCR的模板。 0041 3.根据实施例1克隆方法得到的黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因cDNA序列， 设计 定量引物， 其中正向引物F2： 5 TTCGT。

19、ATCGCTGCTTGTGCTAACC 3 (SEQ ID NO 04)， 反向引物 R2： 5 CGTTCCAGATTGCCTTCACATAGTCC 3 (SEQ ID NO 05)； 同时以黄姑鱼管家基因 -actin 为内参， 其内参正向引物F3： 5 TTATGAAGGCTATGCCCTGCC 3 (SEQ ID NO 06)， 反向引物R3： 5 TGAAGGAGTAGCCACGCTCTGT 3(SEQ ID NO 07) 。 qRT-PCR实验采用Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)(TAKARA， 日本)试剂盒， 并在480II(Roche， 瑞。

20、士) 实时荧光定量PCR仪上按其操作说明进行。 0042 qRT-PCR反应体系为20 L， 其试剂与条件： 0043Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)10 L， 0044 正向引物F2(10 M)0.5 L， 0045 反向引物R2(10 M)0.5 L， 0046 cDNA模板5 L 说明书 3/4 页 5 CN 108374016 A 5 0047 灭菌双蒸水4 L 0048 qRT-PCR扩增程序为： 95预变性5min； 然后40个下列循环： 95变性10s， 60退 火30s， 72延伸15s。 0049 每个样品分别进行3次重复。 0050 4.。

21、采用2- Ct法进行MnSOD基因在肝脏和鳃两个组织中的时相差异表达分析。 结合 SPSS19.0中的one-way ANOVA及S-N-K法(Student-Newman-Keuls method)分析该基因表达 的差异显著性(P0.05)。 0051 结果见图1， 氨氮对黄姑鱼攻毒12h和24h后， 与没有攻毒的0h对照相比， MnSOD基因 在黄姑鱼的肝脏和鳃组织中mRNA的表达量均有显著提高(P0.05)。 0052 综上可知， 本发明提供一种黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因及其克隆方法， 与此 同时， 在氨氮对黄姑鱼攻毒12h和24h后， MnSOD基因在黄姑鱼肝脏和鳃组织中的mR。

22、NA表达量 均有显著提高(P0.05)， 该基因mRNA在黄姑鱼的肝脏和鳃组织中的表达上调可作为检测 氨氮污染的一种生物标记物， 为黄姑鱼的健康状态和生长环境安全的检测奠定基础。 0053 以上述实施例1和2为基础制成一种氨氮污染PCR检测试剂盒， 基于实时荧光定量 PCR， 以实施例1所得的黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因为检测对象， 包括检测引物对和内 参引物对， 其中， 检测引物对包括实施例2中的正向引物F2和反向引物R2， 内参引物对包括 实施例2中的用于检测黄姑鱼管家基因 -actin的正向引物F3和反向引物R3。 0054 以上所述， 仅为本发明的较佳实施例而已， 故不能依此限定。

23、本发明实施的范围， 即 依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰， 皆应仍属本发明涵盖的范围内。 说明书 4/4 页 6 CN 108374016 A 6 序列表 厦门市产品质量监督检验院 集美大学 一种黄姑鱼超氧化物歧化酶MnSOD基因及其应用 7 SIPOSequenceListing 1.0 1 949 DNA 黄姑鱼(Nibea albiflora) 1 acccctgtgc cgtcaaccgc atgagcacta tcatgaacat gctttgcaga gttggtcaga 60 tacgcaggtg tgcagccagc ctgagccaaa ctataaacca 。

24、ggtggctgct tcaaggcaga 120 agcacaccct cccagacctg acctacgact atggtgccct ggagccccac atctgtgcag 180 agatcatgca gctgcaccac agcaagcacc acgccacata cgtcaacaac ctcaacgtca 240 cagaggagaa atatcaggag gcactagcaa agggagatgt gacgacacag gtcgccctcc 300 agcctgctct gaagtttaat ggaggaggcc acattaacca cactatcttc tggacaaac。

25、c 360 tctctcctaa tggtggaggc gagccacagg gggagctgat ggaggccatt aagcgggact 420 ttggctcctt ccagaaaatg aaggagaaga tgtctgctgc tacagtggcc gtgcagggct 480 cgggctgggg ctggctgggc tacgagaagg agagtggaag acttcgtatc gctgcttgtg 540 ctaaccagga tcccctgcag ggatctacag gtctcatccc cctccttggt atcgatgtat 600 gggagcatgc tta。

26、ctacctt cagtacaaaa atgtgcggcc ggactatgtg aaggcaatct 660 ggaacgtcgt caactgggag aacgtgagcg agcgtctcca gatcgccaaa aagtagaatc 720 taatcttcag agctcscgtt cacctggacc tgggtcaaat agtagatgta aataatgatc 780 agattgcatc aaagttgaat atatttgggc ggattacatt ttctttgccc tgtacgcaca 840 gaaagcttga agcaagcttt aaattatttg c。

27、aactgcttt ttatctcagg tctgacctcc 900 aggtgatttt caagcgcaca gttcggcctc cctcacatta aggctggct 949 2 20 DNA Homo sapiens 2 atgagcacta tcatgaacat 20 3 18 DNA Homo sapiens 3 序列表 1/2 页 7 CN 108374016 A 7 ctactttttg gcgatctg 18 4 23 DNA Homo sapiens 4 ttcgtatcgc tgcttgtgct aac 23 5 26 DNA Homo sapiens 5 cgttccagat tgccttcaca tagtcc 26 6 21 DNA Homo sapiens 6 ttatgaaggc tatgccctgc c 21 7 22 DNA Homo sapiens 7 tgaaggagta gccacgctct gt 22 序列表 2/2 页 8 CN 108374016 A 8 图1 说明书附图 1/1 页 9 CN 108374016 A 9 。