发明领域
本发明涉及结合GITR的免疫球蛋白单可变结构域并且更特别地涉及多肽，所述多肽包含一个或多个这样的免疫球蛋白单可变结构域或基本上由其组成(在本文中也分别被称为“本发明的ISVD”和“本发明的多肽”)。
本发明还涉及编码此种多肽的核酸(在本文中也被称为“本发明的核酸”)；涉及用于制备此种多肽的方法；涉及表达或能够表达此种多肽的宿主细胞；涉及包含此种多肽、核酸和/或宿主细胞的组合物，并且尤其涉及包含此种多肽、核酸和/或宿主细胞的药物组合物；并且涉及多肽、核酸、宿主细胞和/或组合物特别地用于预防和/或治疗目的(如本文中提及的预防和/或治疗目的)的用途。
由本文中的进一步描述，本发明的其它方面、实施方案、优点和应用将变得清楚。
背景技术
癌症在全世界造成了巨大的人员伤亡。现在，它是世界上的主要死因，其次是心脏病和中风。癌症是世界范围内发病率和死亡率的主要原因之一，在2012年约有1400万新病例和820万癌症相关死亡。预计未来20年新病例的数量将上升约70％(来源：WHO癌症)。在2008年，世界范围内癌症的过早死亡和残疾导致的总体经济影响大约为9000亿美元，占全球国内生产总值的1.5％。
多年来化疗一直是癌症治疗的中流砥柱。尽管取得了一些成功，但是化疗的治愈率仍不令人满意，并且这些治疗的严重副作用令人担忧。急切期待对抗癌症的改善疗法。
最近在癌症免疫疗法方面投入了相当大的努力，其是消除癌症的新治疗方式。癌症免疫疗法试图刺激免疫系统排斥和破坏肿瘤。
通过T细胞共同受体的共刺激和共抑制信号传导来控制免疫应答的产生和维持。免疫激活受T细胞表达的两个主要共同受体家族调节：免疫球蛋白样(Ig)超家族和TNFR超家族。糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(GITR)是后一个家族的共刺激成员。人GITR作为三聚体存在并且信号传导涉及通过三聚体GITR配体(GITRL)募集三种受体胞外域，导致3:3受体:配体复合物形成[Chattopadhyay等人,PNAS(2007)104:19452-19457]。GITR的实质水平在CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)上组成性表达，并且在由这些细胞介导的外周耐受中起到关键作用。GITR在CD4+和CD8+T细胞(T效应细胞)上也以低水平表达，并且其表达在激活后迅速增强[Nocentini等人,Br.J.Pharmacol.(2012)165:2089-2099]。另外，在树突细胞、天然杀伤(NK)细胞、B细胞、巨噬细胞和单核细胞上也已经鉴定出GITR的表达。其配体GITRL(TNFSF18)在各种抗原呈递细胞(诸如树突细胞、B细胞和巨噬细胞)表面上和内皮细胞上表达，分别触发共刺激和白细胞粘附和移行[Schaer等人J Immunother Cancer(2014)2:1-9；Lacal等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.(2013)347:164-172]。
GITR激活涉及广泛的免疫功能，涉及效应和调节性T细胞，并且因此参与针对肿瘤和传染物的免疫应答的发展。特别地，已经积累了临床前证据以表明GITR激活具有有效的抗肿瘤特性。迄今为止，针对GITR的激动性单克隆抗体已经显示出促进抗肿瘤免疫[Turk等人,J.Exp.Med.(2004)200:771-782；Ko等人,J.Exp.Med.(2005)202:885-891；Ramirez-Montagut等人,J.Immunol.(2006)176:6434-6442；Zhou等人,J.Immunol.(2007)179:7365–7375；Cohen等人,PLoS One(2010)5:e10436；Coe等人,Cancer Immunol.Immunother.(2010)59:1367-1377；Zhou等人,J.Immunother.(2010)33:789-797；Cote等人,J.Immunol.(2011)186:275-283]，增加与针对癌症抗原的疫苗结合的抗肿瘤免疫[Cohen等人,Cancer Res.(2006)66:4904-4912，Ko等人,Cancer Res.(2007)67:7477-7486，Hoffman等人,J.Immunother.(2010)33:136-145，Boczkowski等人,Cancer Gene Ther.(2009)16:900-911]，与其它免疫调节疗法起协同作用[Ko等人,J.Exp.Med.(2005)202:885-891，Houot等人,Blood(2009)113:3546-3552，Mitsui等人Clin.Can.Res.(2010)16:2781-2791]，增强对表达自身突变的肿瘤的排斥[Duan等人,Cancer Res.(2009)69:3545-3553]，以及增强过继性细胞疗法[Liu等人,Mol Ther.(2009)17:1274-81，Imai等人,Can.Sci.(2009)100:1317-25]。此外，体内靶向GITR在治疗传染性疾病方面也已经产生了一些显著结果。在小鼠的弗兰德病毒(Friend virus)感染期间，用针对GITR的激动剂抗体进行治疗逆转了天然Treg细胞的效应，导致增强的Th1和CD8+T细胞应答，降低了病毒载量和病理学并恢复了CD8+T细胞介导的抗肿瘤应答[He等人,J.Virol.(2004)78:11641-11647]。类似地，用针对GITR的激动剂抗体治疗小鼠减少了疱疹性角膜炎[Suvas等人,J.Virol.(2005)(18):11935-11942]。
几种机制似乎有助于GITR介导的治疗效果。例如体内GITR激活已经显示出削弱壁内调节性T细胞(Treg)中的FoxP3表达，导致Treg谱系稳定性的丧失，随后降低了效应T细胞(Teff)的抑制[Schaer等人,Cancer Immunol.Res.(2013)1:320-331]。此外，GITR调节通过诱导T细胞增殖和效应子功能以及通过促进T细胞存活来支持Teff活性[Mahoney等人,Nat Rev Drug Discov.(2015)14:561-84]。
尽管GITR似乎是癌症免疫疗法的有吸引力的靶点，但是抗-GITR激动性抗体是否依赖于其Fc功能用于抗肿瘤效应仍是不清楚的。Ponte等人证明了FcR介导的抗-GITR抗体的交联对于增强体液和细胞免疫不是必需的[Ponte等人,Immunol.(2010)130,231-242]。此外，Ponte显示了Fc失活的抗-GITR单克隆抗体作为单一疗法在体外肺肿瘤模型中是有效的，并且与化疗药组合增强了针对s.c.肿瘤模型中建立的肿瘤的抗肿瘤免疫(Ponte等人,Keystone symposia,2011年4月)。相反地，Bulliard等人发现激活FcγR对于抗-GITR抗体的抗肿瘤活性是必需的[Bulliard等人,J Exp Med.(2013)210:1685-1693]。
有效的免疫疗法应该抑制Treg，并且同时激活Teff，使平衡倾向于免疫激活。然而，尽管迄今为止所获得的结果将GITR确定为免疫疗法的可用靶点，但是仍不清楚GITR激动剂的哪些特定特征对于治疗目的是特别有利的。因此，本领域中存在对进一步了解使GITR激动剂在治疗上有效的特定功能特性，以及在治疗癌症和其它病症(诸如传染性疾病)方面更有效的改善的治疗性GITR激动剂的需要。
发明概述
本发明提供与现有技术氨基酸序列和抗体相比具有与改善的和期望的治疗和/或药理学特性相关的特定功能性质(并且还具有其它有利性质(诸如，例如，提高的易制备性、良好的稳定性、和/或降低的工具成本))的GITR激动剂。
基于大量筛选、表征和组合策略，本发明的发明人出人意料地观察到，与现有技术中描述的GITR激动分子相比，包含结合GITR的免疫球蛋白单可变结构域的多肽显示出改善的调节GITR活性的性质。更特别地，本发明的发明人出人意料地观察到，与现有技术抗体相比，本发明的多肽在等效或甚至更低的EC50值下表现出更高的功效。这在临床上是非常重要的，因为药物的有效性取决于其最大功效。
因此，本发明涉及包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)的多肽，所述免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)以小于200pM的EC50值与糖皮质激素诱导的TNFR家族相关受体(GITR)特异性结合，并且其中所述ISVD与所述GITR的结合增强免疫应答。
特别地，可以结合GITR并且特别是人GITR(SEQ ID NO:231)的多肽的特征在于生物学效力，适当地测量和/或表达为EC50值，如本文进一步描述和限定的，例如诸如通过NF-κB荧光素酶报告分子测定或T细胞激活测定。
在一个方面，本发明的多肽使得它们以如下的EC50与(人)GITR结合：200pM以下，诸如小于190、180、170、160、150、140、130、120、110、100或甚至更小，诸如小于90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、18、16、15、14或甚至更小，诸如小于12pM，如在NF-κB荧光素酶报告分子测定中确定的。
在另一个方面，本发明的多肽使得它们以如下EC50与(人)GITR结合：200pM以下，诸如小于190、180、170、160、150、140、130、120、110、100或甚至更小，诸如小于90、80、70、60、50、40或甚至更小，诸如小于30pM，如在T细胞激活测定中确定的。
应当理解，本发明的多肽与(人)GITR的结合可以导致增强T细胞、B细胞或天然杀伤细胞的增殖或活化，如本文所描述的。
应当进一步理解，本发明的多肽与(人)GITR的结合可以导致抑制肿瘤细胞生长，诸如如本文所描述的。
本发明的多肽和包含其的组合物的功效，可以使用任何合适的体外测定、基于细胞的测定、体内测定和/或本身已知的动物模型、或其任意组合测试，取决于涉及的具体疾病或病症。合适的测定和动物模型将对于技术人员来说是清楚的，并且例如包括用于以下实验部分和本文中引用的现有技术中的测定和动物模型。
由本文中的进一步描述和实施例，对于结合、增强免疫应答、抑制肿瘤细胞生长或本发明多肽对(人)GITR的其它体内和/或体外效力的一些优选技术值将是清楚的。
在一个方面，本发明提供如本文所述的多肽，其中所述多肽具有结构FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中CDR1、CDR2和CDR3是如本文中所限定的，并且FR1、FR2、FR3和FR4是框架序列。因此，本发明涉及(基本上)由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成的多肽，其中：
(i)CDR1选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:73-88；和
(b)与SEQ ID NO:73-88的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:90-116；和
(d)与SEQ ID NO:90-116的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(e)SEQ ID NO:118-132和282-284；和
(f)与SEQ ID NO:118-132和282-284的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在另外的方面，本发明提供如本文所述的多肽，其中所述多肽(基本上)由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
(i)CDR1选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:73-75；和
(b)与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:90-98；和
(d)与SEQ ID NO:90的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(e)SEQ ID NO:118-119、123和282-284；和
(f)与SEQ ID NO:118的氨基酸序列具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在另外的方面，本发明提供如本文所述的多肽，其中所述多肽(基本上)由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
(i)CDR1选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:73；和
(b)与SEQ ID NO:73具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置2处T已经变为S；
-在位置7处D已经变为N；
-在位置8处S已经变为A；和/或
-在位置10处A已经变为G；
和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:90；和
(d)与SEQ ID NO:90具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置1处A已经变为H、T或G；
-在位置2处I已经变为M；
-在位置3处T已经变为S；
-在位置6处G已经变为S；
-在位置7处S已经变为R或G；和/或
-在位置8处P已经变为S、T或R；
和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(e)SEQ ID NO:118；和
(f)与SEQ ID NO:118具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置9处A已经变为P；
-在位置11处M已经变为L、K、R或Q；和/或
-在位置12处D已经变为N。
在另外的方面，本发明提供如本文所述的多肽，其中所述多肽(基本上)由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
i)CDR1由SEQ ID NO:73表示，CDR2由SEQ ID NO:90表示，且CDR3由SEQ ID NO:118表示；或
ii)CDR1由SEQ ID NO:73表示，CDR2由SEQ ID NO:90表示，且CDR3由SEQ ID NO:123表示。
在另外的方面，本发明提供如本文所述的多肽，其中所述多肽(基本上)由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
(i)CDR1选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:76-78；和
(b)与SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:99-103；和
(d)与SEQ ID NO:99的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(e)SEQ ID NO:120-123；和
(f)与SEQ ID NO:120的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在另外的方面，本发明提供如本文所述的多肽，其中所述多肽(基本上)由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
(i)CDR1选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:76；和
(b)与SEQ ID NO:76具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置7处D已经变为N；和/或
-在位置8处S已经变为A；
和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:99；和
(d)与SEQ ID NO:99具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置1处A已经变为S或T；
-在位置5处S已经变为T、G或R；
-在位置6处T已经变为K；和/或
-在位置7处N已经变为I；
和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(e)SEQ ID NO:120；和
(f)与SEQ ID NO:120具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置1处E已经变为K；
-在位置4处A已经变为T；
-在位置11处I已经变为M或L；和/或
-在位置12处N已经变为D。
在另外的方面，本发明提供如本文所述的多肽，其中所述多肽(基本上)由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：CDR1由SEQ ID NO:76表示，CDR2由SEQ ID NO:99表示，且CDR3由SEQ ID NO:120表示。
在另外的方面，本发明提供如本文所述的多肽，其中所述多肽(基本上)由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
(i)CDR1选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:79-84；和
(b)与SEQ ID NO:79的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:104-108；和
(d)与SEQ ID NO:104的氨基酸序列具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(e)SEQ ID NO:124-125；和
(f)与SEQ ID NO:124的氨基酸序列具有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在另外的方面，本发明提供如本文所述的多肽，其中所述多肽(基本上)由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
(i)CDR1选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:79；和
(b)与SEQ ID NO:79具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置2处S已经变为N；
-在位置3处V已经变为I；
-在位置7处N已经变为D；
-在位置8处D已经变为S；和/或
-在位置9处M已经变为V或T；
和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:104；和
(d)与SEQ ID NO:104具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置1处D已经变为G；
-在位置5处R已经变为A；和/或
-在位置6处G已经变为D；
和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(e)SEQ ID NO:124；和
(f)与SEQ ID NO:124具有1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置4处T已经变为M。
在另外的方面，本发明提供如本文所述的多肽，其中所述多肽(基本上)由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：CDR1由SEQ ID NO:79表示，CDR2由SEQ ID NO:104表示，且CDR3由SEQ ID NO:124表示。
在另外的方面，本发明提供如本文所述的多肽，其中所述多肽(基本上)由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
(i)CDR1选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:85-86；和
(b)与SEQ ID NO:85的氨基酸序列具有1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:109-110；和
(d)与SEQ ID NO:109的氨基酸序列具有1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3是SEQ ID NO:126。
在另外的方面，本发明提供如本文所述的多肽，其中所述多肽(基本上)由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
(i)CDR1选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:85；和
(b)与SEQ ID NO:85具有1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置2处S已经变为N；
和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:109；和
(d)与SEQ ID NO:109具有1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置9处T已经变为S；
和/或
(iii)CDR3是SEQ ID NO:126。
在另外的方面，本发明提供如本文所述的多肽，其中所述多肽(基本上)由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：CDR1由SEQ ID NO:85表示，CDR2由SEQ ID NO:109表示，且CDR3由SEQ ID NO:126表示。
在另外的方面，本发明提供如本文所述的多肽，其中所述多肽(基本上)由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：CDR1由SEQ ID NO:87表示，CDR2由SEQ ID NO:111表示，且CDR3由SEQ ID NO:127表示。
在另外的方面，本发明提供如本文所述的多肽，其中所述多肽(基本上)由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
(i)CDR1是SEQ ID NO:77；和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:112-113；和
(d)与SEQ ID NO:112的氨基酸序列具有1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(e)SEQ ID NO:128-130；和
(f)与SEQ ID NO:128的氨基酸序列具有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在另外的方面，本发明提供如本文所述的多肽，其中所述多肽(基本上)由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
(i)CDR1是SEQ ID NO:77；和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:112；和
(b)与SEQ ID NO:112具有1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置4处D已经变为G；
和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:128；和
(d)与SEQ ID NO:128具有1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置9处S已经变为P；和/或
-在位置13处T已经变为A。
在另外的方面，本发明提供如本文所述的多肽，其中所述多肽(基本上)由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：CDR1由SEQ ID NO:77表示，CDR2由SEQ ID NO:112表示，且CDR3由SEQ ID NO:128表示。
在另外的方面，本发明提供如本文所述的多肽，其中所述多肽(基本上)由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
(i)CDR1是SEQ ID NO:88；和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:114-116；和
(d)与SEQ ID NO:114的氨基酸序列具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(e)SEQ ID NO:131-132；和
(f)与SEQ ID NO:131的氨基酸序列具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在另外的方面，本发明提供如本文所述的多肽，其中所述多肽(基本上)由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
(i)CDR1是SEQ ID NO:88；和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:114；和
(b)与SEQ ID NO:114具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置1处V已经变为I或A；和/或
-在位置9处M已经变为I；
和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:131；和
(d)与SEQ ID NO:131具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置4处G已经变为E；和/或
-在位置5处R已经变为Q。
在另外的方面，本发明提供如本文所述的多肽，其中所述多肽(基本上)由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：CDR1由SEQ ID NO:88表示，CDR2由SEQ ID NO:114表示，且CDR3由SEQ ID NO:131表示。
在优选的方面，所述至少一个ISVD选自ISVD的组，其中：
-CDR1是SEQ ID NO:73，CDR2是SEQ ID NO:90；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:74，CDR2是SEQ ID NO:91；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:74，CDR2是SEQ ID NO:92；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:74，CDR2是SEQ ID NO:93；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:74，CDR2是SEQ ID NO:94；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:74，CDR2是SEQ ID NO:95；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:75，CDR2是SEQ ID NO:93；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:74，CDR2是SEQ ID NO:96；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:74，CDR2是SEQ ID NO:97；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:74，CDR2是SEQ ID NO:98；且CDR3是SEQ ID NO:119；
-CDR1是SEQ ID NO:73，CDR2是SEQ ID NO:90；且CDR3是SEQ ID NO:123；
-CDR1是SEQ ID NO:73，CDR2是SEQ ID NO:90；且CDR3是SEQ ID NO:282；
-CDR1是SEQ ID NO:73，CDR2是SEQ ID NO:90；且CDR3是SEQ ID NO:283；
-CDR1是SEQ ID NO:73，CDR2是SEQ ID NO:90；且CDR3是SEQ ID NO:284；
-CDR1是SEQ ID NO:76，CDR2是SEQ ID NO:99；且CDR3是SEQ ID NO:120；
-CDR1是SEQ ID NO:77，CDR2是SEQ ID NO:100；且CDR3是SEQ ID NO:121；
-CDR1是SEQ ID NO:78，CDR2是SEQ ID NO:101；且CDR3是SEQ ID NO:122；
-CDR1是SEQ ID NO:76，CDR2是SEQ ID NO:102；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:77，CDR2是SEQ ID NO:103；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:76，CDR2是SEQ ID NO:99；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:78，CDR2是SEQ ID NO:99；且CDR3是SEQ ID NO:123；
-CDR1是SEQ ID NO:79，CDR2是SEQ ID NO:104；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:76，CDR2是SEQ ID NO:105；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:76，CDR2是SEQ ID NO:106；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:80，CDR2是SEQ ID NO:106；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:81，CDR2是SEQ ID NO:104；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:82，CDR2是SEQ ID NO:104；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:83，CDR2是SEQ ID NO:104；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:84，CDR2是SEQ ID NO:104；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:83，CDR2是SEQ ID NO:106；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:83，CDR2是SEQ ID NO:107；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:83，CDR2是SEQ ID NO:108；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:83，CDR2是SEQ ID NO:104；且CDR3是SEQ ID NO:125；
-CDR1是SEQ ID NO:85，CDR2是SEQ ID NO:109；且CDR3是SEQ ID NO:126；
-CDR1是SEQ ID NO:86，CDR2是SEQ ID NO:110；且CDR3是SEQ ID NO:126；
-CDR1是SEQ ID NO:85，CDR2是SEQ ID NO:110；且CDR3是SEQ ID NO:126；
-CDR1是SEQ ID NO:87，CDR2是SEQ ID NO:111；且CDR3是SEQ ID NO:127；
-CDR1是SEQ ID NO:77，CDR2是SEQ ID NO:112；且CDR3是SEQ ID NO:128；
-CDR1是SEQ ID NO:77，CDR2是SEQ ID NO:112；且CDR3是SEQ ID NO:129；
-CDR1是SEQ ID NO:77，CDR2是SEQ ID NO:113；且CDR3是SEQ ID NO:130；
-CDR1是SEQ ID NO:77，CDR2是SEQ ID NO:112；且CDR3是SEQ ID NO:130；
-CDR1是SEQ ID NO:88，CDR2是SEQ ID NO:114；且CDR3是SEQ ID NO:131；
-CDR1是SEQ ID NO:88，CDR2是SEQ ID NO:115；且CDR3是SEQ ID NO:131；以及
-CDR1是SEQ ID NO:88，CDR2是SEQ ID NO:116；且CDR3是SEQ ID NO:132。
本发明的多肽可以(基本上)由选自轻链可变结构域序列(例如，VL-序列)和重链可变结构域序列(例如，VH-序列)的免疫球蛋白单可变结构域组成。本发明的多肽可以(基本上)由选自来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列和选自来源于重链抗体的重链可变结构域序列的免疫球蛋白单可变结构域组成。本发明的多肽可以(基本上)由选自结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸)、单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸)、“dAb”(或适合用作dAb的氨基酸)、纳米抗体、VHH序列、骆驼源化的VH序列、或通过亲和力成熟获得的VHH序列的免疫球蛋白单可变结构域组成。在优选的方面，本发明的多肽(基本上)由部分或完全人源化的纳米抗体(诸如部分或完全人源化的VHH)组成。
本发明的优选多肽选自SEQ ID NO:1-71和268-275中的任一个，或者与SEQ ID NO:1-71和268-275中的任一个具有大于80％、优选大于90％、更优选大于95％(诸如96％、97％、98％、99％或更大)序列同一性(如本文中所限定的)的多肽。
本发明提供的多肽(也被称为“本发明的多肽”)优选地处于基本上分离的形式(如本文中所限定的)，所述多肽可以包含一个或多个ISVD或(基本上)由其组成，并且可以任选地进一步包含一个或多个另外的免疫球蛋白(全部任选地经由一个或多个合适的接头连接)。
更特别地，本发明提供多价多肽，所述多价多肽包含至少两个、至少三个、至少四个或至少五个可以与GITR结合的ISVD或者(基本上)由其组成，其中所述至少两个、所述至少三个、所述至少四个或所述至少五个ISVD可以是相同的或不同的，并且其中所述至少两个、所述至少三个、所述至少四个或所述至少五个ISVD彼此直接连接或经由接头彼此连接。
不受限制地，合适的接头可以选自具有SEQ ID NO:247-263的接头的组，其中较短的接头长度是优选的。一些特别优选的接头包含1至20个氨基酸残基，诸如2至10个氨基酸残基，诸如2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸残基。特别地，接头9GS(SEQ ID NO:251)或接头3A(SEQ ID NO:247)是尤其优选的。
在另一个方面，本发明涉及化合物或构建体(在本文中也分别被称为“本发明的化合物”或“本发明的构建体”)，所述化合物或构建体包含一个或多个本发明的多肽或者(基本上)由其组成，并且任选地还包含一个或多个其它基团、残基、部分或结合单元，其任选地经由一个或多个肽接头连接。本领域技术人员将从本文的进一步公开内容中清楚知悉，此种另外的基团、残基、部分或结合单元可以为或可以不为本发明的多肽(和/或本发明的多肽存在于其中的化合物、构建体或组合物)提供另外的功能，并且可以改变或可以不改变本发明的多肽的性质。
在本发明的一个特定方面，与相应的本发明的多肽相比，本发明的化合物或本发明的构建体可以具有增加的半衰期。这种化合物或构建体的一些优选的但非限制性的实例在本文进一步公开内容的基础上对技术人员将会变得清楚，并且例如包括已经进行化学修饰以增加其半衰期(例如通过聚乙二醇化)的本发明的多肽；包含至少一个用于结合血清蛋白(例如血清白蛋白)的另外的结合位点的本发明的多肽；或者包含与增加本发明多肽的半衰期的至少一个部分连接的至少一个本发明多肽的本发明的多肽。
包含这种延长半衰期的部分的本发明多肽的实例在本文进一步公开内容的基础上对技术人员将会变得清楚；并且例如包括但不限于其中一个或多个本发明的多肽适当地与一个或多个血清蛋白或其片段(诸如(人)血清白蛋白或其合适的片段)或与一个或多个能够结合血清蛋白的结合单元(诸如例如能够结合血清蛋白(诸如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(诸如IgG)的结构域抗体、适合用作结构域抗体的氨基酸、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的氨基酸、“dAb”、适合用作dAb的氨基酸、纳米抗体、VHH序列、人源化VHH序列或骆驼源化的VH序列；参考本文中的进一步描述和提及的参考文献)连接的多肽；其中本发明的多肽与Fc部分(诸如人Fc)或其合适的部分或片段连接的多肽；或其中一个或多个本发明的多肽适当地与一个或多个能够结合血清蛋白的小蛋白或肽(诸如但不限于WO 91/01743、WO 01/45746、WO 02/076489中描述的蛋白和肽)连接的多肽。
在一个方面，提供具有增加的半衰期的多肽的本发明化合物或构建体选自由抗体恒定区或其片段组成的组，其中所述抗体恒定区或其片段来源于人IgG，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。特别地，这种抗体恒定区包含CH1重链结构域、CH2重链结构域、CH3重链结构域和/或CL轻链结构域。
在本发明的一个特定方面，本发明的化合物或构建体包含
i)本发明的单价多肽，其中所述单价多肽与CH1重链结构域连接，随后分别是CH2重链结构域和CH3重链结构域；和/或
ii)本发明的单价多肽，其中所述单价多肽与CL轻链结构域(诸如Cκ或Cλ)连接。
本发明的优选重链和/或轻链结构域是IgG型，并且包含SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:266、SEQ ID NO:267、SEQ ID NO:291和SEQ ID NO:292之一表示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:229-230、SEQ ID NO:266-267和SEQ ID NO:291-292中任一个具有大于80％、优选大于90％、更优选大于95％(诸如96％、97％、98％、99％或更大)序列同一性(如本文中所限定的)的氨基酸序列。
通常，具有增加的半衰期的本发明的化合物或构建体的半衰期优选是相应的本发明的多肽本身的半衰期的至少1.5倍，优选至少2倍，诸如至少5倍，例如至少10倍或大于20倍。
在优选的但非限制性的方面，与相应的本发明的多肽本身相比，这种本发明的化合物或构建体具有增加大于1小时、优选大于2小时、更优选大于6小时、诸如大于12小时、或者甚至大于24、48或72小时的血清半衰期。
在另一个优选的但非限制性的方面，这种本发明的化合物或构建体表现出在人中至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更长的血清半衰期。例如，本发明的化合物或多肽可以具有至少5天(诸如约5-10天)、优选至少9天(诸如约9-14天)、更优选至少约10天(诸如约10-15天)、或者至少约11天(诸如约11-16天)、更优选至少约12天(诸如约12-18天或更长)、或者大于14天(诸如约14-19天)的半衰期。
在优选的方面，本发明涉及如上限定的化合物或构建体，其选自SEQ ID NO:206-223和285-290中的任一个，或者与SEQ ID NO:206-223和285-290中的任一个具有大于80％、优选大于90％、更优选大于95％(诸如96％、97％、98％、99％或更大)序列同一性(如本文中所限定的)的化合物或构建体(参见表A-11)。
本发明还涉及编码本发明的多肽、化合物和/或构建体的核酸或核苷酸序列。此种核酸在本文中也将被称为“本发明的核酸”，并且可以例如是遗传构建体的形式，如本文中进一步描述的。因此，本发明还涉及遗传构建体形式的核酸或核苷酸序列。
可以连接编码本发明的多肽、化合物和/或构建体的核酸以获得编码本发明的多价多肽的核酸。因此，本发明还涉及编码本发明的多肽、化合物和/或构建体的核酸或核苷酸序列用于制备编码本发明的多价多肽的遗传构建体的用途。
本发明还涉及表达(或在合适的情况下能够表达)本发明的多肽、化合物或构建体的宿主或宿主细胞；和/或含有编码本发明的核酸的宿主或宿主细胞。由本文中的进一步描述，这种宿主或宿主细胞的一些优选的但非限制性的实例将变得清楚。
本发明还涉及组合物，所述组合物含有或包含至少一种本发明的多肽、化合物和/或构建体和/或至少一种本发明的核酸，以及任选地此种组合物的本身已知的一种或多种另外的组分(即取决于组合物的目的用途)。这种组合物可以例如是药物组合物(如本文所描述的)或兽医组合物。由本文中的进一步描述，这种组合物的一些优选的但非限制性的实例将变得清楚。
本发明还涉及用于制备本文所述的多肽、化合物和/或构建体、核酸、宿主细胞和组合物的方法。用于制备本发明的多肽、化合物和/或构建体、核酸、宿主细胞和组合物的方法可以包括以下步骤：
a)在合适的宿主细胞或宿主生物体中或在另一种合适的表达系统中表达本发明的核酸或核苷酸序列，或本发明的遗传构建体；
任选地，随后是：
b)分离和/或纯化由此获得的本发明的多肽、化合物或构建体。
本发明还涉及本文所述的多肽、化合物和/或构建体、核酸、宿主细胞和组合物的应用和用途，以及涉及用于预防和/或治疗GITR相关疾病、病症或病况的方法。由本文中的进一步描述，一些优选的但非限制性的应用和用途将变得清楚。
本发明的多肽、化合物和/或构建体和组合物可以用于增强免疫应答。
特别地，本发明的多肽、化合物和/或构建体和组合物可以用于增强T细胞、B细胞或天然杀伤细胞的增殖或激活。
本发明的多肽、化合物和/或构建体和组合物可以用于抑制肿瘤生长。
本发明的多肽、化合物和/或构建体和组合物可以用于预防和/或治疗T细胞、B细胞或天然杀伤细胞介导的疾病。
本发明的多肽、化合物和/或构建体和组合物可以用于预防和/或治疗传染性疾病。根据所涉及的传染性生物体或药剂的种类，感染可以大致分为细菌、真菌、病毒或寄生虫感染。因此，本发明的多肽、化合物和/或构建体和组合物可以用于预防和/或治疗细菌、真菌、病毒或寄生虫传染性疾病。
本发明的多肽、化合物和/或构建体和组合物可以用于预防和/或治疗癌症。可以使用本发明的多肽、化合物和/或构建体和组合物抑制其生长的示例性癌症包括通常响应于免疫疗法的癌症。用于治疗的优选癌症的非限制性实例包括：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、肾癌(诸如肾细胞癌和肾母细胞瘤(Wilms’tumor))、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、前列腺癌、睾丸癌、胃肠癌、胰腺癌、胆道癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、小肠或阑尾癌、子宫或子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、唾液腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、鼻咽癌、基底细胞癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食管癌、头颈癌、白血病、淋巴瘤、梅克尔细胞癌(merkel cell cancer)和其它血液恶性肿瘤。
因此，本发明的多肽、化合物和/或构建体和组合物可以用于预防和/或治疗癌症，其中所述癌症选自：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、肾癌(诸如肾细胞癌和肾母细胞瘤)、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、前列腺癌、睾丸癌、胃肠癌、胰腺癌、胆道癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、小肠或阑尾癌、子宫或子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、唾液腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、鼻咽癌、基底细胞癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食管癌、头颈癌、白血病、淋巴瘤、梅克尔细胞癌和其它血液恶性肿瘤。
本文描述的用于增强免疫应答(特别是增强T细胞、B细胞或天然杀伤细胞的增殖或活化)的方法和用于抑制肿瘤生长的方法可以用于治疗和预防各种GITR相关疾病、病症或病况。例如，在一个方面，本发明提供了用于预防和/或治疗T细胞、B细胞或天然杀伤细胞相关疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用药物活性量的至少一种如本文所述的多肽、化合物和/或构建体和组合物。
在另一个方面，本发明提供了用于预防和/或治疗细菌、真菌、病毒或寄生虫传染性疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用药物活性量的至少一种如本文所述的多肽、化合物和/或构建体和组合物。
在又一个方面，本发明提供了用于预防和/或治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用药物活性量的至少一种如本文所述的多肽、化合物和/或构建体和组合物。特别地，本发明提供用于预防和/或治疗癌症的方法，其中所述癌症选自：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、肾癌(诸如肾细胞癌和肾母细胞瘤)、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、前列腺癌、睾丸癌、胃肠癌、胰腺癌、胆道癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、小肠或阑尾癌、子宫或子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、唾液腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、鼻咽癌、基底细胞癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食管癌、头颈癌、白血病、淋巴瘤、梅克尔细胞癌和其它血液恶性肿瘤。
应当进一步理解，本文描述的方法和组合物可以与其它药剂或治疗模式组合使用。在一个方面，本文描述的方法和组合物与化学疗法、放射疗法、癌症疫苗或者一种或多种另外的治疗剂或者前述任何的组合联合施用。可以与本发明的方法和组合物组合施用的示例性治疗剂包括PD-1,PD-L1,PD-L2,CTLA-4,4-1BB(CD137),4-1BB配体,OX40,OX40配体,CD27,TNFRSF25,TL1A,CD40,CD40配体,LIGHT,LTA,HVEM,BTLA,CD160,CEACAM-1,CEACAM-5,LAIR1,2B4,TGFR,LAG-3,TIM-3,涎免凝集素(Siglecs),ICOS(CD278),ICOS配体,B7-H3,B7-H4,B7-1,B7-2,VISTA,HHLA2,TMIGD2,BTNL2,CD244,CD48,CD2,CDS,TIGIT,PVR家族成员,KIRs,ILTs,LIRs,NKG2D,NKG2A,MICA,MICB,CSF1R,IDO,TGFβ,腺苷,ICAM-1,ICAM-2,ICAM-3,LFA-1(CD11a/CD18),LFA-2,LFA-3,BAFFR,NKG2C,SLAMF7,NKp80,CD83配体,CD24,CD39,CD30,CD70,CD73,CD7,CXCR4,CXCL12,磷脂酰丝氨酸,SIRPA,CD47,VEGF和神经毡蛋白(Neuropilin)。
本发明还涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体或本发明的组合物在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于增强免疫应答。特别地，本发明涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体或本发明的组合物在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于增强T细胞、B细胞或天然杀伤细胞的增殖或激活。
本发明也涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体或本发明的组合物在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于抑制肿瘤生长。
本发明也涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体或本发明的组合物在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防和/或治疗至少一种GITR相关疾病、病症或病况。由本文中的进一步描述，一些优选的但非限制性的疾病、病症或病况将变得清楚。
特别地，本发明涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体或本发明的组合物在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防和/或治疗T细胞、B细胞或天然杀伤细胞介导的疾病。
本发明也涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体或本发明的组合物在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防和/或治疗细菌、真菌、病毒或寄生虫传染性疾病。
本发明也涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体或本发明的组合物在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防和/或治疗癌症，其中所述癌症选自：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、肾癌(诸如肾细胞癌和肾母细胞瘤)、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、前列腺癌、睾丸癌、胃肠癌、胰腺癌、胆道癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、小肠或阑尾癌、子宫或子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、唾液腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、鼻咽癌、基底细胞癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食管癌、头颈癌、白血病、淋巴瘤、梅克尔细胞癌和其它血液恶性肿瘤。
由本文中的进一步公开内容，多肽和组合物的其它方面、优点、应用和用途将变得清楚。在本说明书的整个文本中引用了若干文件。无论是上文还是下文，本文中引用的每个文件(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)都通过引用整体并入本文。
附图说明
图1A-1D：用小鼠GITR(A)、人GITR(B)或食蟹猴(cyno)GITR(C)稳定转染的Flp-InTM-293细胞和活化T细胞(D)的质量控制。绘制每个细胞系的MFI值(平均荧光强度)。用“/”表示仅使用第二抗体的检测(即不使用抗-GITR抗体)。
图2A-2B：单价抗-GITR纳米抗体对在活化的人T细胞上表达的人GITR的剂量依赖性结合(A-B)。将MFI值(平均荧光强度)针对纳米抗体的浓度作图。
图3：多价抗-GITR纳米抗体和不相关的纳米抗体(IRR00077)对HEK293_NFkB-Nluc2P人GITR细胞的剂量依赖性结合。将MFI值(平均荧光强度)针对纳米抗体的浓度作图。
图4A-4D：表达人GITR的GloResponseTM NF-κB-Nluc2P HEK293萤光素酶报告分子细胞中的GITR激活。通过测量发光来评价激活。将RLU值(相对光单位)针对纳米抗体的浓度作图。
图5A-5F：GITR激活对T细胞激活的影响。在每个平板上，测试一系列浓度的一种纳米抗体构建体和人GITR-配体(hGITRL)(R&D Systems6987-GL-025/CF)。每个图表代表从一个平板获取的数据。通过监测IFN-γ表达来测量激活。
图6A-6D：表达人GITR的GloResponseTM NF-κB-Nluc2P HEK293萤光素酶报告分子细胞中评价的纳米抗体构建体的接头长度的影响(A-D)。在构建体A023100032和A023100035中是通过9GS接头连接的A0231005A03纳米抗体(家族7)。在构建体A023100034和A023100022中是通过35GS接头连接的A0231005A03纳米抗体。在构建体A023100045、A023100082和A023100085中是通过3A接头连接的A0231004B01纳米抗体(家族26)。在构建体A023100083和A023100084中是通过9GS接头连接的A0231004B01纳米抗体。在构建体A023100014中是通过35GS接头连接的A0231004B01纳米抗体。
图7：纳米抗体-人IgG1嵌合体的示意图。
图8A-8N：不同的测试化合物(单独地或与抗PD-1 mAb组合地)在用以下治疗的小鼠组中对通过肿瘤体积变化测量的抗肿瘤活性的影响：DTA-1(图8A)；DTA-1+抗PD-1 mAb(图8B)；抗GITR NB剂量水平1(图8C)；不相关的NB剂量水平1(图8D)；抗GITR NB剂量水平2(图8E)；不相关的NB剂量水平2(图8F)；抗GITR NB剂量水平1+抗PD-1 mAb(图8G)；抗GITR NB剂量水平2+抗PD-1 mAb(图8H)；不相关的NB剂量水平1+抗PD-1 mAb(图8I)；不相关的NB剂量水平2+抗PD-1mAb(图8J)；抗GITR Nb-大鼠IgG2b嵌合体(图8K)；抗GITR Nb-人IgG1嵌合体(图8L)；抗GITR Nb-人IgG1嵌合体+抗PD-1 mAb(图8M)和载体(图8N)。CR表示完全消退。
图9A-9D：不同的测试化合物(单独地或与抗PD-1 mAb组合地)在疗程期间对存活的影响。
图10A-10C：如T细胞激活测定中所评价的抗-GITR纳米抗体的体外基准测试。在每个平板上，测试一系列浓度的一种纳米抗体构建体和林爽阶段36E5mAb。每个图表代表从一个平板获取的数据。通过监测IFN-γ表达来测量激活。
图11：在OVA初始和第14天加强免疫后的第13天和第21天，作为抗-OVA总IgG滴度测量的抗-GITR多价纳米抗体A023100035和抗-GITR纳米抗体-huIgG1嵌合体(A-0231-00_TP008)的佐剂效应。SDL1：单一剂量水平1(在第0天和第14天)；SDL2：单一剂量水平2(在第0天和第14天)；RD1：重复给药方案1(3次注射，每2天进行1次注射，开始于第0天和第14天，Q2Dx3)；RD2：重复给药方案2(11次注射，每2天进行1次注射，Q2Dx11)。
图12A-12D：表达人GITR的GloResponseTM NF-κB-Nluc2P HEK293萤光素酶报告分子细胞中经由多价序列优化纳米抗体的GITR激活。通过测量发光来评价激活。将RLU值(相对光单位)针对纳米抗体的浓度作图。
图13A-13G：经由多价序列优化纳米抗体的GITR激活对T细胞激活的影响。在每个平板上，测试一系列浓度的一种纳米抗体构建体和人GITR-配体(hGITRL)(R&D Systems 6987-GL-025/CF)。每个图表代表从一个平板获取的数据。通过监测IFN-γ表达来测量激活。
图14A-14O：不同的测试化合物(单独地或与抗PD-1 mAb组合地)在用以下治疗的小鼠组中随时间对通过肿瘤体积变化测量的抗肿瘤活性的影响：载体(图14A)；DTA-1(图14B)；DTA-1+抗PD-1 mAb(图14C)；huIgG1同种型对照(图14D)；huIgG1同种型对照+抗PD-1(图14E)；不相关的NB(图14F)；不相关的NB+抗PD-1 mAb(图14G)；抗GITR NB A023100101(图14H)；抗GITR NB A023100101+抗PD-1 mAb(图14I)；抗GITR NB A023100107(图14J)；抗GITR NB A023100107+抗PD-1 mAb(图14K)；抗GITR NB A023100118(图14L)；抗GITR NB A023100118+抗PD-1 mAb(图14M)；抗GITR纳米抗体-huIgG1嵌合体(图14N)；抗GITR纳米抗体-huIgG1嵌合体+抗PD-1 mAb(图14O)。CR表示完全消退。
图15A-15B：不同的测试化合物(单独地或与抗PD-1 mAb组合地)在疗程期间对存活的影响。
发明详述
定义
除非另有说明或限定，使用的所有术语具有其在本领域中的通常含义，其对于本领域技术人员来说是清楚的。参考例如标准手册，诸如Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版)卷1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)，F.Ausubel等人(Current protocols in molecular biology,Green Publishing and Wiley Interscience,New York,1987)，Lewin(Genes II,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,1985)，Old等人(Principles of Gene Manipulation:An Introduction to Genetic Engineering(第2版)University of California Press,Berkeley,CA,1981)；Roitt等人(Immunology(6th.Ed.)Mosby/Elsevier,Edinburgh,2001)，Roitt等人(Roitt’s Essential Immunology(第10版)Blackwell Publishing,UK,2001)，和Janeway等人(Immunobiology(第6版)Garland Science Publishing/Churchill Livingstone,New York,2005)，以及本文引用的一般背景技术。
除非另有说明，未被特别详细地描述的所有方法、步骤、技术和操作可以并且已经以本身已知的方式进行，这对于本领域技术人员来说是清楚的。再次参考例如标准手册和本文中提及的一般背景技术并且参考其中引用的其它参考文献；以及参考例如以下综述Presta(Adv.Drug Deliv.Rev.58(5-6):640-56,2006),Levin和Weiss(Mol.Biosyst.2(1):49-57,2006),Irving等人(J.Immunol.Methods 248(1-2):31-45,2001),Schmitz等人(Placenta 21增刊A:S106-12,2000),Gonzales等人(Tumour Biol.26(1):31-43,2005)，其中描述了蛋白质工程技术，诸如亲和力成熟及用于提高蛋白质如免疫球蛋白的特异性及其它所需性质的其它技术。
如本文所用的术语“序列”(例如在术语如“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白质序列”中)通常应被理解为包括相关的氨基酸序列以及编码其的核酸或核苷酸序列，除非上下文需要更限制性的解释。
氨基酸残基用标准的三字母或单字母氨基酸代码表示。参考WO 08/020079第48页的表A-2。
当核酸或氨基酸已经与在所述来源或介质中通常与其缔合的至少一种其它组分(诸如另一种核酸，另一种蛋白质/多肽，另一种生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)分离时-认为所述核酸或氨基酸“(处于)(基本上)分离的(形式)”―例如，与其从中获得的反应介质或培养基相比。特别地，当核酸或氨基酸已经被纯化至少2倍、特别地至少10倍，更特别地至少100倍、并且多达1000倍以上时，认为所述核酸或氨基酸是“(基本上)分离的”。“处于(基本上)分离的形式”的核酸或氨基酸优选地是基本上均质的，如使用合适的技术(诸如合适的色谱技术，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳)所确定的。
当核苷酸序列或氨基酸序列被描述为分别“包含”另一个核苷酸序列或氨基酸序列，或“基本上由”另一个核苷酸序列或氨基酸序列“组成”时，这可以意指后一个核苷酸序列或氨基酸序列已经分别结合到首先提及的核苷酸序列或氨基酸序列中，但是更通常地，这一般意指首先提及的核苷酸序列或氨基酸序列分别在其序列内包含分别与后一个序列具有相同的核苷酸序列或氨基酸序列的核苷酸或氨基酸残基序列段(stretch)，而不管首先提及的序列实际上是如何制备或获得的(其可以例如通过本文所述的任何合适的方法)。通过非限制性实例，当将本发明的多肽描述为包含免疫球蛋白单可变结构域时，这可以意指所述免疫球蛋白单可变结构域序列已经结合到本发明的多肽序列中，但是更通常地，这一般意指本发明的多肽在其序列内含有免疫球蛋白单可变结构域的序列，而不管所述本发明的多肽实际上是如何制备或获得的。此外，当将核酸或核苷酸序列描述为包含另一个核苷酸序列时，首先提及的核酸或核苷酸序列优选使得，当它被表达成表达产物(例如多肽)时，由后一个核苷酸序列编码的氨基酸序列形成所述表达产物的一部分(换言之，后一个核苷酸序列是在与首先提及的较大的核酸或核苷酸序列的相同的阅读框中)。
“基本上由…组成”意指本发明的方法中使用的免疫球蛋白单可变结构域与本发明的多肽完全相同或者对应于本发明的多肽，其在免疫球蛋白单可变结构域的氨基末端、羧基末端或者氨基末端和羧基末端两者添加有限数目的氨基酸残基，诸如1-20个氨基酸残基，例如1-10个氨基酸残基，并且优选1-6个氨基酸残基，诸如1、2、3、4、5或6个氨基酸残基。
为了比较两个以上核苷酸序列，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的“序列同一性”百分比可以通过以下方式计算：将[第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中相应位置处的核苷酸相同的核苷酸的数目]除以[第一核苷酸序列中核苷酸的总数]并且乘以[100％]，其中第二核苷酸序列中核苷酸的各缺失、插入、置换或添加-与第一核苷酸序列相比-都被认为是单个核苷酸(位置)处的差异。备选地，两个以上核苷酸序列之间的序列同一性程度可以使用已知的用于序列比对的计算机算法(诸如NCBI Blast v2.0)使用标准设定计算。例如，WO 04/037999、EP 0967284、EP 1085089、WO 00/55318、WO 00/78972、WO 98/49185和GB 2357768中描述了用于确定序列同一性程度的一些其它技术、计算机算法和设定。通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两个核苷酸序列之间的“序列同一性”百分比的目的，将具有最大核苷酸数目的核苷酸序列作为“第一”核苷酸序列，并且将另一个核苷酸序列作为“第二”核苷酸序列。
为了比较两个以上氨基酸序列，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列同一性”(在本文中也被称为“氨基酸同一性”)百分比可以通过以下方式计算：将[第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置处的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数目]除以[第一氨基酸序列中氨基酸残基的总数]并且乘以[100％]，其中第二氨基酸序列中氨基酸残基的各缺失、插入、置换或添加-与第一氨基酸序列相比-被认为是单个氨基酸残基(位置)处的差异，即作为本文中所限定的“氨基酸差异”。备选地，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度可以使用已知的计算机算法(诸如上文提及的用于确定核苷酸序列的序列同一性程度的那些算法，同样使用标准设定)进行计算。通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两个氨基酸序列之间的“序列同一性”百分比的目的，将具有最大氨基酸残基数目的氨基酸序列作为“第一”氨基酸序列，并且将另一个氨基酸序列作为“第二”氨基酸序列。
此外，在确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度中，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸置换，其通常可以被描述为这样的氨基酸置换，其中氨基酸残基被具有类似化学结构并且对多肽的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或者基本上没有影响的另一种氨基酸残基替换。这种保守氨基酸置换是本领域公知的，例如，从WO 04/037999、GB 2357768、WO 98/49185、WO 00/46383和WO 01/09300中可知；并且可以这种置换的(优选)类型和/或组合可以基于来自WO 04/037999以及WO 98/49185和来自其中引用的其它参考文献的相关教导进行选择。
这种保守置换优选地是这样的取代，其中以下组(a)–(e)内的一个氨基酸被同组内的另一个氨基酸残基置换：(a)小的脂肪族的、非极性的或稍有极性的残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性的、带负电的残基及其(不带电的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性的、带正电的残基：His、Arg和Lys；(d)大的脂肪族的、非极性的残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；以及(e)芳族残基：Phe、Tyr和Trp。特别优选的保守置换如下：Ala变为Gly或变为Ser；Arg变为Lys；Asn变为Gln或变为His；Asp变为Glu；Cys变为Ser；Gln变为Asn；Glu变为Asp；Gly变为Ala或变为Pro；His变为Asn或变为Gln；Ile变为Leu或变为Val；Leu变为Ile或变为Val；Lys变为Arg、变为Gln或变为Glu；Met变为Leu、变为Tyr或变为Ile；Phe变为Met、变为Leu或变为Tyr；Ser变为Thr；Thr变为Ser；Trp变为Tyr；Tyr变为Trp；和/或Phe变为Val、变为Ile或变为Leu。
施加于本文中所述的多肽的任何氨基酸置换也可以基于由Schulz等人(“Principles of Protein Structure”,Springer-Verlag,1978)提出的不同物种的同源蛋白之间的氨基酸变化频度的分析，基于由Chou和Fasman(Biochemistry 13:211,1974；Adv.Enzymol.,47:45-149,1978)提出的结构形成潜能分析，并且基于由Eisenberg等人(Proc.Natl.Acad Sci.USA 81:140-144,1984)、Kyte和Doolittle(J.Molec.Biol.157:105-132,1981)和Goldman等人(Ann.Rev.Biophys.Chem.15:321-353,1986)提出的蛋白质中疏水模式的分析，所有这些文献都通过引用整体结合于此。本文中的描述和上述引用的一般背景技术中给出纳米抗体的一级、二级和三级结构的信息。此外，为此目的，例如在Desmyter等人(Nature Structural Biology,3:803,1996)、Spinelli等人(Natural Structural Biology,3:752-757,1996)和Decanniere等人(Structure,7(4):361,1999)中给出了来自美洲驼的VHH结构域的晶体结构。可以在上述引用的现有技术中找到关于在常规VH结构域中形成VH/VL界面和在这些位置上的可能的骆驼源化置换的一些氨基酸残基的进一步的信息。
如果氨基酸序列和核酸序列在其全长上具有100％的序列同一性(如本文所限定的)，则将其称为“完全相同”。
在比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与第二序列相比，第一序列的某个位置上单个氨基酸残基的插入、缺失或置换；应当理解，两个氨基酸序列可以包含一个、两个或更多个这种氨基酸差异。
“氨基酸差异”可以是任何一个、两个、三个或最多四个置换、缺失或插入或其任何组合，其改善本发明多肽的性质或者至少不将本发明多肽的所需性质或所需性质的平衡或组合减损太多。在此方面，与包含一个或多个CDR序列而不具有一个、两个、三个或最多四个置换、缺失或插入的多肽相比，所得的本发明多肽应该至少以相同、大约相同或更高的亲和力与GITR结合，所述亲和力是如例如通过表面等离子共振(SPR)所测量的。
例如，并且取决于用于表达本发明的多肽的宿主生物体，此种缺失和/或置换可以以这样的方式设计，以使得移除用于翻译后修饰的一个或多个位点(诸如一个或多个糖基化位点)，这将在本领域技术人员的能力范围内。
如本发明说明书所用的“纳米抗体家族”、“VHH家族”或“家族”是指这样的一组纳米抗体和/或VHH序列，其具有相同长度(即，它们在其序列内具有相同数目的氨基酸)并且其位置8和位置106(根据Kabat编号)之间的氨基酸序列具有89％以上的氨基酸序列同一性。
可互换使用的术语“表位”和“抗原决定簇”是指由抗原结合分子(诸如免疫球蛋白、常规抗体、本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽)识别并且更特别地由所述分子的抗原结合位点识别的大分子(诸如多肽或蛋白质)的一部分。表位限定了免疫球蛋白的最小结合位点，并且因此表示免疫球蛋白特异性的靶标。
抗原结合分子(诸如免疫球蛋白、常规抗体、本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽)识别表位的部分被称为“互补位”。
可以与特定表位、抗原或蛋白质(或其至少一部分、片段或表位)“结合”或“特异性结合”、对特定表位、抗原或蛋白质(或其至少一部分、片段或表位)“具有亲和力”和/或“具有特异性”的多肽(诸如免疫球蛋白、抗体、本发明的免疫球蛋白单可变结构域、多肽，或一般地其抗原结合分子或片段)被描述为“针对(against)”或者“指向(directed against)”所述表位、抗原或蛋白，或者是关于这种表位、抗原或蛋白的“结合”分子，或者被描述为是“抗”-表位、“抗”-抗原或“抗”-蛋白(例如，“抗”-GITR)。
术语“特异性”具有WO 08/020079第53-56页段n)中给出的含义；并且如其中所提及的，是指特定的抗原结合分子或抗原结合蛋白(诸如本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽)能够结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。可以基于亲和力和/或亲合力(avidity)来确定抗原结合蛋白的特异性，如WO 08/020079(通过引用结合于此)第53-56页所描述的，其还描述了用于测量抗原结合分子(诸如本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽)与相关抗原之间的结合的一些优选技术。通常，抗原结合蛋白(诸如本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽)将以10-5至10-12摩尔/升以下、并且优选10-7至10-12摩尔/升以下并且更优选10-8至10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即，以105至1012升/摩尔以上、并且优选107至1012升/摩尔以上并且更优选108至1012升/摩尔的结合常数(KA))与它们的抗原结合。任何大于10-4摩尔/升的KD值(或任何低于104M-1的KA值)通常被认为指示非特异性结合。优选地，本发明的单价多肽将以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM(诸如例如10至5nM或更小)的亲和力与所需抗原结合。抗原结合蛋白对抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以本身已知的任何合适方法确定，包括例如，斯卡查德分析(Scatchard analysis)和/或竞争结合测定，如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心竞争测定，和本领域已知的其不同变化形式；以及本文中提及的其它技术。如对于技术人员来说是清楚的，并且如WO 08/020079第53-56页所描述的，解离常数可以是实际或表观解离常数。用于确定解离常数的方法对于技术人员将是清楚的，并且例如包括WO 08/020079第53-56页提及的技术。
当免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽与第一抗原结合的亲和力(如上所述的，并且合适地表达为KD值、KA值、Koff速率和/或Kon速率)是所述免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽与第二靶标或抗原结合的亲和力的至少10倍小、诸如至少100倍、并且优选至少1000倍或更大时，将所述免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽描述为相比于第二靶标或抗原对第一靶标或抗原“具有特异性”。例如，免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽与第一靶标或抗原结合的KD值可以比所述免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽与第二靶标或抗原结合的KD小至少10倍、诸如小至少100倍、并且优选小至少1000倍或甚至更小。优选地，当与第二靶标或抗原相比，免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽对第一靶标或抗原“具有特异性”时，它针对(如本文所限定的)所述第一靶标或抗原，而不针对所述第二靶标或抗原。
术语“(交叉)-阻断((cross)-block)”、“被(交叉)-阻断((cross)-blocked)”、“竞争性结合”、“(交叉)-竞争((cross)-compete)”、“(交叉)-竞争的((cross)-competing)”“(交叉)-竞争((cross)-competition)”在本文中可互换使用，意指免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其它结合剂干扰其它免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或结合剂与给定靶标结合的能力。免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其它结合剂能够干扰另一种与靶标结合的程度，以及因此其是否可以根据本发明被描述为交叉阻断，可以使用竞争性结合检测测定。特别合适的定量交叉阻断检测在实施例中描述，并且包括例如利用细胞上表达的GITR的荧光激活的细胞分选(FACS)结合测定。(交叉)阻断的程度可以通过(减弱的)通道荧光来测量。
以下总体上描述了适用于根据本发明确定免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变区、多肽或其它结合剂是否交叉阻断或能够交叉阻断的FACS测定。应当理解，所述测定可以与本文所描述的任何免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变区、多肽或其它结合剂一起使用。根据生产商的建议操作FACS仪器(例如FACS Canto；Becton Dickinson)。
为了评价两个结合剂(诸如例如两个免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体)之间针对结合GITR的的“(交叉)阻断”或“(交叉)竞争”，可以使用过表达人GITR的细胞(诸如例如Flp-InTM-293细胞)和作为背景细胞系的亲本细胞来进行FACS竞争实验。可以使用不同的检测试剂，包括例如M2抗体(Sigma-Aldrich，目录号F1804)、单克隆抗-C-myc抗体(Sigma-Aldrich，目录号WH0004609M2)、单克隆抗-HIS TAG抗体(Sigma-Aldrich，目录号SAB1305538)，其各自具有不同标记。在流式细胞术中可以使用多种荧光团作为标记(诸如例如PE(R-藻红蛋白)、7-氨基放线菌素D(7-AAD)、吖啶橙(Acridine Orange)、多种形式的Alexa Fluor、别藻蓝蛋白(Allophycocyanin)(APC)、AmCyan、氨基香豆素(Aminocoumarin)、APC Cy5、APC Cy7、APC-H7、APC/Alexa Fluor 750、AsRed2、Azami-Green、蓝铜矿(Azurite)、B ODIPY FL C5-神经酰胺、BCECF-AM、Bis-oxonol DiBAC2(3)、BODIPY-FL、钙黄绿素(Calcein)、钙黄绿素AM、Caroxy-H2DCFDA、Cascade Blue、Cascade Yellow、Cell Tracker Green、Cerulean、CFSE、色霉素(Chromomycin)A3、CM-H2DCFDA、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy3B、Cy5、Cy5.5、Cy7、CyPet、DAF-FM DAF-FM二乙酸盐、DAPI、DCFH(2’7’二氯二氢荧光素)、DHR、二氢钙黄绿素AM、二氢罗丹明(Dihydrorhoadamine)、Dihydrothidium、DiLC1(5)、DiOC6(3)、DiOC7(3)、dKeima-Red、DRAQ5、Dronpa-Green、多种形式的DsRed dTomato、多种形式的DyLight、大肠杆菌(E.coli)BioParticles AF488、E2-Crimson、E2-Orange、EBFP2、ECFP、多种形式的eFluor、EGFP、EGFP*、Emerald、eqFP650、eqFP670、ER-Tracker Blue-White DPX、溴化乙啶、Express2、EYFP、Fc OxyBurst Green、Fc OxyBurst Green 123、FITC、Fluo-3、Fluo-4、荧光素(Fluorescein)、Fura-2、Fura-Red、GFPuv、H2DCFDA、HcRed1、Hoechst Blue(33258)、Hoechst Red(33342)、羟基香豆素(Hydroxycoumarin)、HyPer、Indo-1、Indo-1Blue(低Ca2+)、Indo-1Violet(高Ca2+)、iRFP、J-Red、JC-1、JC-9、Katushka(TurboFP635)、Katushka2Kusabira-Orange、LDS 751、丽丝胺罗丹明B(Lissamine Rhodamine B)、多种形式的Live/Dead,Lucifer yellow、Lucifer Yellow CH、Lyso Tracker Blue、Lyso Tracker Green、Lyso Tracker Red、mAmertrine、Marina Blue、mBanana、mCFP、mCherry、mCitrine、甲氧基香豆素(Methoxycoumarin)、mHoneyDew、Midoriishi-Cyan、光神霉素(Mithramycin)、Mito Tracker Deep Red、Mito Tracker Green、Mito Tracker Orange、Mito Tracker Red、MitoFluor Green、mKate(TagFP635)、mKate2、mKeima、mKeima-Red、mKO、mKOk、mNeptune、Monochlorobimane、mOrange、mOrange2、mRaspberry、mPlum、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTarquoise、mTFP1、mTFP1(Teal)、NBD、OxyBurst Green H2DCFDA、OxyBurst Green H2HFF BSA、Pacific Blue、PE(R-藻红蛋白)、PE Cy5、PE Cy5.5、PE Cy7、PE Texas Red、PE-Cy5缀合物、PE-Cy7缀合物、PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白)、PerCP Cy5.5、PhiYFP、PhiYFP-m、碘化丙啶(PI)、多种形式的Qdot、Red 613、RFP Tomato、Rhod-2、S65A、S65C、S65L、S65T、Singlet Oxygen Sensor Green、Sirius、SNARF、Superfolder GFP、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、T-Sapphire、TagBFP、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagRFP657、TagYFP、tdTomato、Texas Red、Thiazole Orange、TMRE、TMRM、Topaz、TOTO-1、TO-PRO-1、TRITC、TRITC TruRed、TurboFP602、TurboFP635、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、Venus、Vybrant CycleDye Violet、野生型GFP、X-罗丹明(X-Rhodamin)、Y66F、Y66H、Y66W、YOYO-1、YPet、ZsGreen1、ZsYellow1、Zymosan A BioParticles AF488(更多见于：http://www.thefcn.org/flow-fluorochromes)。荧光团(Fluorophore或简写为“fluor”)通常被连接至识别GITR的抗体(例如免疫球蛋白单可变结构域，诸如纳米抗体)或用作检测试剂的抗体。多种缀合的抗体是可用的，诸如(不限于)例如与罗丹明、PE、FITC和Cy3缀合的抗体。每种荧光团具有特征峰激发和发射波长。可以使用的标记的组合将取决于用于激发荧光团和在可用的检测器上使用的灯或激光的波长。
为了评价两种测试结合剂(称为A和B)之间对于结合GITR的竞争，将冷的(没有任何标记的)结合剂A的连续稀释物与标记的结合剂B*一起添加至(例如200 000个)细胞。测试混合物中结合剂B*的浓度应当足够高以易于使所述细胞上表达的GITR上的结合位点饱和。使所述细胞上表达的GITR上的结合位点对结合剂饱和的结合剂B*的浓度可以利用在GITR细胞上的结合剂B*的连续滴定和测定结合的EC50值来确定。为了在饱和浓度下工作，可以以100x EC50浓度使用结合剂B*。
在将细胞与结合剂A和结合剂B*的混合物温育并且进行细胞洗涤后，可以在FACS上进行读出。首先，在完整细胞上设定如由散开特征曲线确定的通道(gate)并且记录通道荧光的总量。
还制备了单独的结合剂B*的溶液。在该溶液中的结合剂B*应当是在与测试混合物(具有结合剂A和B*)相同的缓冲液中并处于相同浓度。也将该单独溶液添加至所述细胞。在温育和细胞洗涤后，可以在FACS上进行读出。首先，在完整细胞上设定如由散开特征曲线确定的通道(gate)并且记录通道荧光的总量。
相比于与单独的结合剂B*的溶液温育的细胞的荧光，与结合剂A和B*的混合物温育的细胞的荧光的减弱指示：结合剂A(交叉)阻断结合剂B*对结合所述细胞上表达的GITR的结合。
根据本发明，交叉阻断免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其它结合剂是这样的一种，其在以上FACS交叉阻断测定中将结合GITR，以致在所述测定期间并且在存在第二免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其它结合剂的情况下，记录的荧光是最大荧光(对于单独的标记的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其它结合剂测量的)的80％至0.1％(例如80％至4％)，特别地为最大荧光的75％至0.1％(例如75％至4％)，并且更特别地为最大荧光的70％至0.1％(例如70％至4％)(正如以上所限定的)。
两种测试结合剂(称为A*和B*)之间对于结合GITR的竞争也可以通过向表达GITR的细胞添加各自标记有不同荧光团的两种结合剂来评价。在温育和细胞洗涤后，可以在FACS上进行读出。为每种荧光团设定一个通道(gate)并且记录通道荧光的总量。一种荧光团的荧光的减弱和/或不存在指示结合剂与细胞上表达的GITR的结合被(交叉)阻断。
用于确定针对靶标的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其它结合剂是否(交叉)阻断、能够(交叉)阻断、竞争性结合或具有(交叉)竞争性(如本文中所限定)的其它方法描述于例如Xiao-Chi Jia等人(Journal of Immunological Methods 288:91–98,2004)、Miller等人(Journal of Immunological Methods 365:118–125,2011)和/或本文中所述的方法(参见例如实施例7)中。
如果氨基酸序列对两个不同的抗原或抗原决定簇(诸如例如来自两个不同哺乳动物物种的血清白蛋白，诸如例如人血清白蛋白和食蟹猴血清白蛋白，诸如例如来自不同哺乳动物物种的GITR，诸如例如人GITR、食蟹猴GITR和大鼠GITR)具有特异性(如本文所限定的)，则所述氨基酸序列被描述为对这些不同的抗原或抗原决定簇“具有交叉反应性”。
术语“糖皮质激素介导的TNF受体”，下文中称为“GITR”，也称为肿瘤坏死受体超家族18(TNFRSF18)、可诱导激活的TNFR家族受体(AITR)、TEASR、CD357和312C2。GITR在所有T细胞亚型中组成型表达，并且主要在调节性T细胞(Treg)中组成型表达，其在TCR刺激和细胞激活后在CD4+CD25-和CD8+CD25-效应细胞中上调(Nocentini等人2007,Eur J Immunol.37:1165-1169)。GITR充当效应T细胞激活中的共刺激分子并调节Treg细胞抑制活性(Esparza等人2005,J Immunol.174:7869-7874)。
在本发明的上下文中，“增强的”或“增强”通常意指增加、加强或刺激GITR的活性，如使用合适的体外、细胞或体内测定(诸如本文中提及的那些)测量的。特别地，与在相同测定中在相同条件下但是在不存在本发明的多肽的情况下的GITR的活性相比，GITR的活性增加或增强(如使用合适的体外、细胞或体内测定(诸如本文中提及的那些)测量的)至少5％，优选至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多，诸如100％。
两种化合物的“协同效应”是其中两种药剂的组合的作用大于其各自作用的总和，并且优选在统计学上不同于对照和单一药物。
如本文所用的，术语“T细胞、B细胞或天然杀伤细胞介导的疾病”是指由T细胞(包括效应T细胞(例如CD8+细胞)和辅助T细胞(例如CD4+细胞))、B细胞或天然杀伤细胞介导的任何疾病。
“GITR相关疾病、病症或病况”是指与可通过诱导、刺激或增强GITR活性(例如，经由使用本文所描述的激动剂GITR多肽)治疗的疾病相关的疾病或症状。示例性的GITR相关疾病、病症或病况包括但不限于癌症和传染性疾病。
如本文所用，“激动剂”是指在体外或在体内部分或完全增加、增强、诱导或刺激相应靶标(例如GITR)的一种或多种生物活性的化合物。这样的GITR的生物活性的实例包括促进CD4+和CD8+T细胞存活，增殖，NF-κB信号传导，白细胞介素-2产生和效应子功能以及消除Treg细胞抑制效应或Treg细胞的产生。如对于技术人员来说将是清楚的，可以以任何合适的方式和/或使用本身已知的任何合适的(体外、细胞或体内)测定来确定生物活性的这种增加，所述测定诸如本文所描述的或本文引用的现有技术中的测定。特别地，与在相同测定中在相同条件下但是在不存在本发明的多肽的情况下的生物活性相比，生物活性增加至少5％，优选至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％以上，诸如100％。
完全激动剂能够具有最大的受体刺激(功能性响应)，即它们引起与受体的内源性配体基本上相同水平的完全响应(E＝Emax＝100％)。此处，术语“基本上相同”意指与在相同的实验设置下测量并设定为100％的所述内源性配体的最大功效相比，测试化合物的功效的范围为70％至150％，更优选80％至140％，诸如90％至120％。
部分激动剂即使在饱和浓度下也不能引起受体的最大活性。换言之，即使通过增加部分激动剂的剂量，也不能由相同靶分子的部分激动剂产生由靶分子(例如GITR)的完全激动剂产生的功能性响应的最大量级。
术语“增强免疫应答”和“诱导免疫应答”在本文中可互换使用，并且是指导致T细胞、B细胞和天然杀伤(NK)细胞的一种或多种细胞应答的激活、刺激或增殖的过程。本发明的多肽能够诱导T细胞、B细胞或天然杀伤细胞的增殖或激活。测量T细胞、B细胞和天然杀伤细胞激活的合适的测定是本文所述的技术中已知的，例如分别如Buillard等人,2013,J.Exp.Med.Vol.210,9:1685-1693；Zhou等人,2010年10月,J.Immunother.Vol.33,No8；和Hanabuchi 2006,Blood,Vol.107,No 9:3617–3623中所描述的，或者如以下实施例所举例说明的。
如本文所用，术语“抑制肿瘤细胞生长”旨在包括体外肿瘤细胞增殖或体内肿瘤生长的任何可测量的减少，例如减少至少5％，优选至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多，诸如100％。
如本文中使用的，术语“效力”是药剂，如多肽、ISVD或纳米抗体，其生物学活性的测量。药剂的效力可以通过本领域中已知的任何合适的方法，如例如实验部分中所述的方法确定。基于细胞培养的效力测定常常是用于确定生物学活性的优选形式，因为它们测量药剂诱导的生理学响应，并且可以在相对短的时期产生结果。基于产物的作用机制，可以使用各种类型的基于细胞的测定，包括但不限于增殖测定、细胞毒性测定、细胞杀伤测定、报告基因测定(例如NF-κB荧光素酶报告分子测定)、T细胞激活测定、细胞表面受体结合测定和测量激活和细胞因子分泌的已知标志物的表达的测定，全部是本领域中已知的。
相对地，本发明的多肽的“功效”测量在饱和多肽浓度下其作用本身的最大强度。功效指示可从本发明的多肽获得的最大响应。其是指多肽产生所需(治疗)效果的能力。可以使用体内模型，诸如OVA免疫模型或同基因CT-26结肠癌模型(例如如实施例部分所述)，来评价本发明多肽的功效。
本发明的多肽的“半衰期”通常可以如WO 08/020079第57页段o)所描述的那样定义，并且如其中所提及的，是指例如由于通过天然机制的多肽的降解和/或多肽的清除或螯合，在体内所述多肽的血清浓度降低50％所花费的时间。本发明的多肽的体内半衰期可以以其本身已知的任何方式确定，例如通过药代动力学分析确定。合适的技术对本领域技术人员来说是清楚的，并且通常可以例如是如WO 08/020079第57页段o)所描述的。如WO 08/020079第57页段o)中还提及的，半衰期可以用参数例如t1/2-α、t1/2-β和曲线下面积(AUC)表示。例如参考标准手册，诸如Kenneth等人(Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists,John Wiley&Sons Inc,1986)以及M Gibaldi和D Perron(”Pharmacokinetics”,Marcel Dekker,第2修订版,1982)。术语“半衰期的增加”或“增加的半衰期”也如WO 08/020079第57页段o)所限定的，并且特别是指t1/2-β的增加，无论存在或不存在t1/2-α和/或AUC或两者的增加。
除非另外指明，术语“免疫球蛋白”和“免疫球蛋白序列”－不论在本文中用来指重链抗体还是常规的4链抗体―被用作一般性术语以包括全长抗体、其单独的链、以及其所有部分、结构域或片段(分别包括但不限于抗原结合结构域或片段，诸如VHH结构域或VH/VL结构域)。
如本文所用的术语(多肽或蛋白质的)“结构域”是指在独立于蛋白质的其余部分的情况下能够保持其三级结构的折叠的蛋白质结构。通常，结构域负责蛋白质的分立的功能性质，并且在很多情况下，可以被添加、去除或转移至其它蛋白质，而不损失蛋白质其余部分和/或所述结构域的功能。
如本文所用的术语“免疫球蛋白结构域”是指抗体链(诸如例如，常规4链抗体或重链抗体的链)的球状区域，或基本上由此种球状区域组成的多肽。免疫球蛋白结构域的特征在于它们保持抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，其由任选地被保守的二硫键稳定的分布在两个β-折叠中的约七个反平行的β-链的两层夹心组成。
如本文所用的术语“免疫球蛋白可变结构域”意指基本上由四个“框架区”组成的免疫球蛋白结构域，所述四个“框架区”在本领域中以及在下文中分别被称为“框架区1”或“FR1”；“框架区2”或“FR2”；“框架区3”或“FR3”；和“框架区4”或“FR4”；所述框架区被三个“互补决定区”或“CDR”间隔开，所述三个“互补决定区”或“CDR”在本领域中以及在下文中分别被称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”；和“互补决定区3”或“CDR3”。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般性结构或序列可以表示为如下：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变结构域通过带有抗原结合位点而给予抗体对抗原的特异性。
术语“免疫球蛋白单可变结构域”，可与“单可变结构域”互换使用，表示其中抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域并由单个免疫球蛋白结构域形成的分子。这将免疫球蛋白单可变结构域与“常规”免疫球蛋白或其片段区分开，在“常规”免疫球蛋白或其片段中，两个免疫球蛋白结构域，特别是两个可变结构域，相互作用以形成抗原结合位点。典型地，在常规免疫球蛋白中，重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)相互作用以形成抗原结合位点。在这种情况下，VH和VL二者的互补决定区(CDR)将对抗原结合位点有所贡献，即总共6个CDR将参与抗原结合位点形成。
鉴于以上定义，常规4链抗体(诸如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；本领域中已知的)或来源于这种常规4链抗体的Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段如二硫键连接的Fv或scFv片段或双抗体(全部是本领域中已知的)的抗原结合结构域，通常将不被认为是免疫球蛋白单可变结构域，因为，在这些情况中，与相应抗原表位的结合通常将不通过一个(单)免疫球蛋白结构域发生，而是通过一对(结合的)免疫球蛋白结构域如轻链和重链可变结构域发生，即，通过共同地结合相应抗原表位的免疫球蛋白结构域的VH-VL对发生。
相对地，免疫球蛋白单可变结构域能够在不与另外的免疫球蛋白可变结构域配对的情况下特异性结合抗原表位。免疫球蛋白单可变结构域的结合位点由单个VH/VHH或VL结构域形成。因此，免疫球蛋白单可变结构域的抗原结合位点由不超过三个CDR形成。
因此，单可变结构域可以是轻链可变结构域序列(例如，VL-序列)或其合适的片段；或重链可变结构域序列(例如，VH-序列或VHH序列)或其合适的片段；只要其能够形成单个抗原结合单元(即，基本上由单可变结构域组成的功能性抗原结合单元，使得单个抗原结合结构域不需要与另一个可变结构域相互作用以形成功能性抗原结合单元)即可。
在本发明的一个实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域是重链可变结构域序列(例如，VH-序列)；更具体地，免疫球蛋白单可变结构域可以是来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列或来源于重链抗体的重链可变结构域序列。
例如，免疫球蛋白单可变结构域可以是(单)结构域抗体(或适合用作(单)结构域抗体的氨基酸)、“dAb”或dAb(或适合用作dAb的氨基酸)或纳米抗体(如本文中所限定的，并且包括但不限于VHH)；其它单可变结构域或其中任一者的任何合适的片段。
特别地，免疫球蛋白单可变结构域可以是(如本文中限定的)或其合适的片段。[注：是埃博灵克斯股份有限公司的注册商标]。对于纳米抗体的一般性描述，参考以下进一步描述，以及本文中引用的现有技术，如例如WO 08/020079(第16页)中所描述的。
“VHH结构域”，也被称为VHH、VHH结构域、VHH抗体片段和VHH抗体，最初被描述为“重链抗体”(即，“缺少轻链的抗体”；Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-448,1993)的抗原结合免疫球蛋白(可变)结构域。选择术语“VHH结构域”以用于将这些可变结构域与常规4链抗体中存在的重链可变结构域(其在本文中被称为“VH结构域”或“VH结构域”)以及常规4链抗体中存在的轻链可变结构域(其在本文中被称为“VL结构域”或“VL结构域”)区分开来。对于VHH和纳米抗体的进一步描述，参考Muyldermans的综述文章(Reviews in Molecular Biotechnology 74:277-302,2001)，以及作为一般背景技术提及的以下专利申请：Vrije Universiteit Brussel的WO 94/04678、WO 95/04079和WO 96/34103；Unilever的WO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)的WO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016和WO 03/055527；Algonomics N.V.和埃博灵克斯股份有限公司的WO 03/050531；National Research Council of Canada的WO 01/90190；Institute of Antibodies的WO 03/025020(＝EP 1433793)；和埃博灵克斯股份有限公司的WO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO 06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787和WO 06/122825，以及Ablynx N.V的进一步公开的专利申请。还参考这些申请中提及的进一步的现有技术，并且特别地参考国际申请WO 06/040153第41-43页提及的文献列表，所述列表和文献通过引用结合于此。如这些文献中描述的，纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)可以特别地特征在于在一个或多个框架序列中存在一个或多个“标志(Hallmark)残基”。对纳米抗体的进一步描述，包括纳米抗体的人源化和/或骆驼源化，以及其它修饰，部分或片段，衍生物或“纳米抗体融合体”，多价构建体(包括接头序列的一些非限制性实例)和用于增加纳米抗体的半衰期的不同的修饰及其制备可以例如在WO 08/101985和WO 08/142164中找到。对于纳米抗体的进一步的一般性描述，参考本文中引用的现有技术，如例如WO 08/020079(第16页)中所描述的。
“结构域抗体”，也被称为“Dab”、“结构域抗体”和“dAb”(术语“Domain Antibodies”和“dAb”被GlaxoSmithKline公司集团用作商标)已经被描述在例如，EP 0368684,Ward等人(Nature 341:544-546,1989)，Holt等人(Tends in Biotechnology 21:484-490,2003)和WO 03/002609以及例如WO 04/068820、WO 06/030220、WO 06/003388和Domantis Ltd的其他公开的专利申请中。结构域抗体基本上对应于非骆驼科哺乳动物(特别是人4链抗体)的VH或VL结构域。为了作为单抗原结合结构域(即，分别地，不与VL或VH结构域配对)结合表位，需要特别的选择此种抗原结合性质，例如通过使用人单VH或VL结构域序列的文库。结构域抗体(如VHH)具有约13至约16kDa的分子量，并且如果其完全来源于人序列，则不需要人源化以用于例如在人中的治疗用途。
还应当注意的是，虽然由于其不是来源于哺乳动物的而在本发明的语境中是较不优选的，但是单可变结构域可以来源于特定鲨鱼物种(例如，所谓的“IgNAR结构域”，参见例如WO 05/18629)。
因此，在本发明的语义中，术语“免疫球蛋白单可变结构域”或“单可变结构域”包括来源于非人来源(优选骆驼科)的多肽，优选骆驼科重链抗体。其可以被人源化，如之前所描述的。此外，该术语包括已经被“骆驼源化的”来源于非骆驼科来源(例如小鼠或人)的多肽，如例如，在Davies和Riechmann(FEBS 339:285-290,1994；Biotechnol.13:475-479,1995；Prot.Eng.9:531-537,1996)以及Riechmann和Muyldermans(J.Immunol.Methods 231:25-38,1999)中所描述的。
根据Kabat等人给出的VH结构域的通用编号(”Sequence of proteins of immunological interest”,US Public Health Services,NIH Bethesda,MD,公布号91)对VHH结构域的氨基酸残基进行编号，如例如Riechmann和Muyldermans(J.Immunol.Methods 231:25-38,1999)的图2中所示的应用于骆驼科动物的VHH结构域的那样。用于对VH结构域的氨基酸残基进行编号的备选方法(所述方法也可以以类似方式应用于VHH结构域)是本领域中已知的。然而，在本说明书、权利要求和附图中，除非另外指出，则将遵循如上所述的用于VHH结构域的根据Kabat的编号。
应该注意的是-正如本领域中对于VH结构域和VHH结构域所熟知的一样-每个CDR中的氨基酸残基的总数可以变化，并且可以不对应于由Kabat编号所指出的氨基酸残基的总数(即，根据Kabat编号的一个或多个位置在实际序列中可以不被占据，或者实际序列可以含有比Kabat编号所允许的数量更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，根据Kabat的编号可以对应于或不对应于实际序列中的氨基酸残基的实际编号。VH结构域和VHH结构域中的氨基酸残基的总数将通常在110至120的范围内，通常在112至115之间。然而，应该注意的是更小且更长的序列也可以适于本文所述的目的。
CDR区的确定也可以根据不同的方法进行。在根据Kabat的CDR确定中，VHH的FR1包含位置1-30处的氨基酸残基，VHH的CDR1包含位置31-35处的氨基酸残基，VHH的FR2包含位置36-49处的氨基酸残基，VHH的CDR2包含位置50-65处的氨基酸残基，VHH的FR3包含位置66-94处的氨基酸残基，VHH的CDR3包含位置95-102处的氨基酸残基，并且VHH的FR4包含位置103-113处的氨基酸残基。
然而，在本申请中，根据Kontermann和Dübel(Eds.,Antibody Engineering,vol 2,Springer Verlag Heidelberg Berlin,Martin,Chapter 3,pp.33-51,2010)来确定CDR序列。根据该方法，FR1包含位置1-25处的氨基酸残基，CDR1包含位置26-35处的氨基酸残基，FR2包含位置36-49处的氨基酸残基，CDR2包含位置50-58处的氨基酸残基，FR3包含位置59-94处的氨基酸残基，CDR3包含位置95-102处的氨基酸残基，并且FR4包含位置103-113处的氨基酸残基(根据Kabat编号)。
免疫球蛋白单可变结构域，诸如结构域抗体和纳米抗体(包括VHH结构域)，可以进行人源化。特别地，人源化的免疫球蛋白单可变结构域，诸如纳米抗体(包括VHH结构域)，可以是这样的免疫球蛋白单可变结构域，其是如之前的段落中一般性限定的，但是其中存在至少一个氨基酸残基(并且特别地，至少一个框架残基)，所述残基是和/或对应于人源化置换(如本文中限定的)。可能有用的人源化置换可以通过将天然存在的VHH序列的框架区的序列与一个或多个紧密相关的人VH序列的相应的框架序列比较来确定，之后可以将由此确定的一个或多个可能有用的人源化置换(或其组合)引入到所述VHH序列中(以任何本身已知的方式，如本文中进一步描述的)并且可以测试所得的人源化的VHH序列对靶标的亲和力、稳定性、表达的容易性和水平、和/或其他所需的性质。以此方式，通过有限程度的尝试和误差，技术人员可以基于本文中的公开内容确定其他合适的人源化置换(或其合适的组合)。此外，基于以上，免疫球蛋白单可变结构域如纳米抗体(包括VHH结构域)(的框架区)可以被部分人源化或完全人源化。
免疫球蛋白单可变结构域，诸如结构域抗体和纳米抗体(包括VHH结构域和人源化的VHH结构域)，也可以进行亲和力成熟，所述亲和力成熟是通过在一个或多个CDR的氨基酸序列中引入一个或多个改变，所述改变导致与相应的亲本分子相比，所得的免疫球蛋白单可变结构域对其相应的抗原的亲和力提高。本发明的亲和力成熟的免疫球蛋白单可变结构域分子可以通过本领域中已知的方法制备，例如，如由Marks等人(Biotechnology 10:779-783,1992)、Barbas等人(Proc.Nat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813,1994)、Shier等人(Gene 169:147-155,1995)、Yelton等人(Immunol.155:1994-2004,1995)、Jackson等人(J.Immunol.154:3310-9,1995)、Hawkins等人(J.MoI.Biol.226:889 896,1992)、Johnson和Hawkins(Affinity maturation of antibodies using phage display,Oxford University Press,1996)所描述的。
由免疫球蛋白单可变结构域(诸如结构域抗体或纳米抗体)开始的设计/选择和/或制备多肽的过程在本文中也被称为“格式化(formatting)”所述免疫球蛋白单可变结构域；并且被制成多肽的部分的免疫球蛋白单可变结构域被描述为“被格式化成”所述多肽或处于所述多肽的“格式”。基于本文中的公开内容，可以格式化免疫球蛋白单可变结构域的方式的实例以及这种格式的实例对于本领域技术人员将是清楚的；并且这种格式化的免疫球蛋白单可变结构域形成本发明的另一个方面。
例如，并且没有限制，一个或多个免疫球蛋白单可变结构域可以用作“结合单元”、“结合结构域”或“结构单元(building block)”(这些术语可互换使用)以用于制备多肽，所述多肽可以任选地含有可以充当结合单元的一个或多个另外的免疫球蛋白单可变结构域(即，针对GITR上的相同表位或另一个表位和/或针对不同于GITR的一个或多个其他抗原、蛋白或靶标)。
单价多肽仅包含一个结合单元(诸如例如免疫球蛋白单可变结构域)或基本上由其组成。包含两个以上结合单元(诸如例如免疫球蛋白单可变结构域)的多肽在本文中也被称为“多价”多肽，并且存在于这种多肽中的结合单元/免疫球蛋白单可变结构域在本文中也被称为处于“多价格式”。例如，“二价”多肽可以包含任选地经由接头序列连接的两个免疫球蛋白单可变结构域，而“三价”多肽可以包含任选地经由两个接头序列连接的三个免疫球蛋白单可变结构域；而“四价”多肽可以包含任选地经由三个接头序列连接的四个免疫球蛋白单可变结构域；而“五价”多肽可以包含任选地经由四个接头序列连接的五个免疫球蛋白单可变结构域；而“六价”多肽可以包含任选地经由五个接头序列连接的六个免疫球蛋白单可变结构域，等等。
在多价多肽中，两个以上免疫球蛋白单可变结构域可以是相同的或不同的，并且可以针对相同的抗原或抗原决定簇(例如，针对相同的部分或表位或者针对不同的部分或表位)，或可以备选地针对不同的抗原或抗原决定簇；或其任何合适的组合。含有至少两个结合单元(诸如例如免疫球蛋白单可变结构域)的多肽(其中至少一个结合单元针对第一抗原(即，GITR)并且至少一个结合单元针对第二抗原(即，不同于GITR))也将被称为“多特异性”多肽，并且这种多肽中存在的结合单元(诸如例如免疫球蛋白单可变结构域)在本文中也将被称为处于“多特异性格式”。因此，例如，本发明的“双特异性”多肽是这样的多肽，其包含至少一个针对第一抗原(即，GITR)的免疫球蛋白单可变结构域和至少一个针对第二抗原(即，不同于GITR)的其它免疫球蛋白单可变结构域，而本发明的“三特异性”多肽是这样的多肽，其包含至少一个针对第一抗原(即，GITR)的免疫球蛋白单可变结构域、至少一个针对第二抗原(即，不同于GITR)的其它免疫球蛋白单可变结构域和至少一个针对第三抗原(即，不同于GITR和第二抗原二者)的其它免疫球蛋白单可变结构域；等等。
“多互补位多肽”，诸如例如“双互补位多肽”或“三互补位多肽”，包含两个以上各自具有不同的互补位的结合单元或基本上由其组成(如本文将进一步描述的)。
GITR激动剂
本发明提供对GITR(优选人GITR)具有特异性和/或与其结合的多肽(本文中也被称为“本发明的多肽”)。GITR，也被称为TNFRSF18、AITR、CD357、TEASR或312C2，是人中由TNFRSF18基因(根据Entrez Gene，位于1号染色体上1p36.3处)编码的蛋白质。本发明的多肽优选与人GITR(SEQ ID NO:231)结合。
本发明提供的多肽是GITR激动剂，并且因此可以诱导、增加、刺激或增强GITR信号传导。激活GITR生物途径调节T细胞激活并增强免疫应答。因此，本发明提供的多肽可以用于各种免疫治疗应用，诸如用于治疗各种癌症、免疫疾病和传染性疾病，如本文将进一步限定的。
基于大量筛选、表征和组合策略，本发明的发明人出人意料地观察到，与现有技术中描述的GITR激动分子相比，包含结合GITR的免疫球蛋白单可变结构域的多肽显示出改善的调节GITR活性的性质。更特别地，本发明的发明人出人意料地观察到，与现有技术抗体相比，本发明的多肽在等效或甚至更低的EC50值下表现出更高的功效。这在临床上是非常重要的，因为药物的有效性取决于其最大功效。
因此，本发明提供与现有技术氨基酸序列和抗体相比具有与改善的和期望的治疗和/或药理学特性相关的特定功能性质(并且还具有其它有利性质(诸如，例如，提高的易制备性、良好的稳定性、和/或降低的工具成本))的GITR激动剂。
可以在结合测定中测量本发明的多肽与GITR的结合。典型的测定包括(不限于)其中将GITR暴露于细胞(诸如例如Flp-InTM-293细胞或GloResponseTM NF-κB-Nluc2P HEK293细胞)表面上的测定。用于测量本发明的多肽与GITR的结合的优选测定是FACS测定，诸如例如实施例中描述的FACS测定，其中确定本发明的多肽与Flp-InTM-293细胞和/或活化T细胞上表达的GITR的结合。由本文中的进一步描述和实施例，本发明的多肽结合GITR的一些优选EC50值将变得清楚。
在这种FACS结合测定中，本发明的多肽在结合人GITR方面可以具有的EC50值为10-8M以下，更优选10-9M以下，或者甚至10-10M以下，诸如10-11M。例如，在这种FACS结合测定中，本发明的多肽在结合人GITR方面可以具有的EC50值为10-11M至10-8M，诸如10-9M至10-8M、10-10M至10-9M或10-11M至10-10M。
本发明的多肽与GITR结合并且能够调节(即，增加、增强、刺激或加强)GITR的活性。更特别地，本发明的多肽可以增强免疫应答。
因此，在一个方面，本发明涉及以小于200pM的EC50与GITR特异性结合的多肽，并且其中所述多肽与所述GITR的结合增强免疫应答。更特别地，本发明的这些多肽可以增强T细胞、B细胞或天然杀伤细胞的增殖或激活。
可以通过各种测定来确定T细胞、B细胞或天然杀伤细胞的增殖或激活，包括但不限于增殖测定、细胞毒性测定、细胞杀伤测定、报告基因测定(例如NF-κB荧光素酶报告分子测定)、T细胞激活测定、细胞表面受体结合测定和测量激活和细胞因子分泌的已知标志物的表达的测定，其全部是本领域中已知的。
例如，可以使用用于监测细胞因子产生的几种常规测定中的任何一种(诸如IFN-γ和白细胞介素)作为免疫细胞激活的量度。例如，为了跟踪T细胞激活，可以采用白细胞介素-2作为标志物，其可以如Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86:1333(1989)中描述的进行测定。
还可以采用免疫荧光和流式细胞术来监测细胞因子产生，并且监测反映细胞激活状态的细胞表面标志物。许多这样的标志物是已知的，检测抗体是广泛地可商购的，并且标志物是本领域中公知的。
T细胞增殖的常用测定需要测量氚化胸苷的结合。可以通过确定结合到培养细胞的复制DNA中的3H-标记的胸苷的量来在体外测量T细胞的增殖。因此，可以量化DNA合成的速率以及细胞分裂的速率。
由本文中的进一步描述和实施例，本发明的多肽激活GITR的一些优选EC50值将变得清楚。
在一些实施方案中，本发明的多肽在利用用抗-CD3抗体OKT3刺激的活化CD4+T细胞的T细胞激活测定中增强IFN-γ产生，如实施例10中所描述的。在该T细胞激活测定中，本发明的多肽增强IFN-γ产生的EC50值为10-7M以下，优选10-8M以下，更优选10-9M以下、10-10M以下、或甚至10-11M以下。更特别地，在该T细胞激活测定中，本发明的多肽以如下EC50值增强IFN-γ产生：200pM以下，诸如小于190、180、170、160、150、140、130、120、110、100或甚至更小，诸如小于90、80、70、60、50、40或甚至更小，诸如小于30pM。
因此，本发明涉及特异性结合GITR的多肽，并且其中所述多肽与所述GITR的结合以这样的EC50增强T细胞中的IFN-γ产生：200pM以下，诸如小于190、180、170、160、150、140、130、120、110、100或甚至更小，诸如小于90、80、70、60、50、40或甚至更小，诸如小于30pM，如在利用用抗-CD3抗体OKT3刺激的活化CD4+T细胞的T细胞激活测定中测量的(如实施例10中所描述的)。
在一些实施方案中，本发明的多肽在NF-κB荧光素酶报告分子测定中增强核因子-κB(NF-κB)的活性，如实施例9和18中所描述的。NF-κB荧光素酶报告分子测定已经描述于Buillard等人,2013,J.Exp.Med.Vol.210,9:1685-1693中。由本文中的进一步描述和实施例，本发明的多肽激活GITR的一些优选EC50值将变得清楚。
NF-κB在炎症、免疫应答和细胞增殖中起到关键作用。该测定被特别设计以检测培养的细胞中NF-κB调节的信号转导途径的活性。在该NF-κB荧光素酶报告分子测定中，本发明的多肽以这样的EC50值增强NF-κB活性(如通过添加Nano-GloTM试剂(Promega#N1120)后的发光所测量的)：10-7M以下，优选10-8M以下，更优选10-9M以下、10-10M以下、或甚至10-11M以下。更特别地，在该NF-κB荧光素酶报告分子测定中，本发明的多肽以这样的EC50值增强NF-κB活性：200pM以下，诸如小于190、180、170、160、150、140、130、120、110、100或甚至更小，诸如小于90、80、70、60、50、40、35、30、25、20、18、16、15、14或甚至更小，诸如小于12pM。
因此，本发明涉及特异性结合GITR的多肽，并且其中所述多肽与所述GITR的结合以这样的EC50增强NF-κB活性：200pM以下，诸如小于190、180、170、160、150、140、130、120、110、100或甚至更小，诸如小于90、80、70、60、50、40、35、30、25、20、18、16、15、14或甚至更小，诸如小于12pM，如在NF-κB荧光素酶报告分子测定中测量的(如实施例9和18中所述)。
可以进一步在体内模型(诸如例如在小鼠、大鼠、猪和/或灵长类动物中)评价本发明的多肽的治疗效果。BALB/c小鼠中的CT26模型提供了同基因体内测试系统，其常常用于开发和测试免疫治疗概念(Fearon等人,Cancer Res.48:2975-2980,1988)。例如，在如实施例13、14和21所述的同基因CT-26结肠癌模型中，本发明的多肽可以抑制肿瘤细胞生长。在一些实施方案中，本发明的多肽抑制肿瘤细胞生长、抑制或阻止肿瘤重量或体积的增加和/或使得肿瘤重量或体积减少至少5％，优选至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多，诸如100％。
因此，本发明涉及特异性结合GITR的多肽，并且其中在同基因CT-26结肠癌模型中，所述多肽与所述GITR的结合抑制肿瘤细胞生长(如实施例13、14和21所述)。
本发明的单价多肽
本发明提供特别适合于结合GITR的氨基酸残基序列段(SEQ ID NO:73-88、SEQ ID NO:90-116以及SEQ ID NO:118-132和282-284；表A-10)。特别地，本发明提供与GITR结合的氨基酸残基序列段，并且其中所述序列段与所述GITR的结合增强免疫应答(如上所描述的)。这些氨基酸残基序列段可以存在于，和/或可以结合到，本发明的多肽中，特别是以使得它们形成本发明的多肽的抗原结合位点(的部分)的方式。这些氨基酸残基序列段作为针对GITR产生的重链抗体或VHH序列的CDR序列产生。这些氨基酸残基序列段在本文中也被称为“本发明的CDR序列”(即，分别称为“本发明的CDR1序列”、“本发明的CDR2序列”和“本发明的CDR3序列”)。
然而，应当注意的是，本发明在其最广泛的意义上不限于这些氨基酸残基序列段在本发明的多肽中可以具有的特定结构作用或功能，只要这些氨基酸残基序列段使得本发明的多肽以特定亲和力和效力(如本文所限定的)与GITR结合即可。因此，通常，本发明在其最广泛的意义上提供这样的单价多肽(在本文中也被称为“本发明的单价多肽”)，所述单价多肽能够以特定的指定的亲和力、亲合力、功效和/或效力与GITR结合，并且包含一个或多个如本文所述的CDR序列并且特别是两个以上此种CDR序列的合适的组合，它们经由一个或多个另外的氨基酸序列彼此合适地连接，以致整个多肽形成能够结合GITR的结合结构域和/或结合单元。然而，还应当注意的是，在本发明的单价多肽中仅存在一个此种CDR序列已经可足以单独地将结合GITR的能力提供给本发明的多肽；参考例如WO 03/050531中描述的所谓的“加速片段(Expedite fragment)”。
在特定的但非限制性的方面，本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基序列段：
(i)CDR1序列：
(a)SEQ ID NO:73-88；和
(b)与SEQ ID NO:73-88的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(ii)CDR2序列：
(c)SEQ ID NO:90-116；和
(d)与SEQ ID NO:90-116的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3序列：
(e)SEQ ID NO:118-132和282-284；和
(f)与SEQ ID NO:118-132和282-284的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在另外的方面，本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基序列段：
(i)CDR1序列：
(a)SEQ ID NO:73-75；和
(b)与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(ii)CDR2序列：
(c)SEQ ID NO:90-98；和
(d)与SEQ ID NO:90的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3序列：
(e)SEQ ID NO:118-119、123和282-284；和
(f)与SEQ ID NO:118的氨基酸序列具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在另外的方面，本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基序列段：
(i)CDR1序列：
(a)SEQ ID NO:73；和
(b)与SEQ ID NO:73具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置2处T已经变为S；
-在位置7处D已经变为N；
-在位置8处S已经变为A；和/或
-在位置10处A已经变为G；
和/或
(ii)CDR2序列：
(c)SEQ ID NO:90；和
(d)与SEQ ID NO:90具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置1处A已经变为H、T或G；
-在位置2处I已经变为M；
-在位置3处T已经变为S；
-在位置6处G已经变为S；
-在位置7处S已经变为R或G；和/或
-在位置8处P已经变为S、T或R；
和/或
(iii)CDR3序列：
(e)SEQ ID NO:118；和
(f)与SEQ ID NO:118具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置9处A已经变为P；
-在位置11处M已经变为L、K、R或Q；和/或
-在位置12处D已经变为N。
在另外的方面，本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基序列段：
(i)CDR1序列SEQ ID NO:73；和/或
(ii)CDR2序列SEQ ID NO:90；和/或
(iii)CDR3序列SEQ ID NO:118，或
(i)CDR1序列SEQ ID NO:73；和/或
(ii)CDR2序列SEQ ID NO:90；和/或
(iii)CDR3序列SEQ ID NO:123。
在另外的方面，本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基序列段：
(i)CDR1序列：
(a)SEQ ID NO:76-78；和
(b)与SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(ii)CDR2序列：
(c)SEQ ID NO:99-103；和
(d)与SEQ ID NO:99的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3序列：
(e)SEQ ID NO:120-123；和
(f)与SEQ ID NO:120的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在另外的方面，本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基序列段：
(i)CDR1序列：
(a)SEQ ID NO:76；和
(b)与SEQ ID NO:76具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置7处D已经变为N；和/或
-在位置8处S已经变为A；
和/或
(ii)CDR2序列：
(c)SEQ ID NO:99；和
(d)与SEQ ID NO:99具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置1处A已经变为S或T；
-在位置5处S已经变为T、G或R；
-在位置6处T已经变为K；和/或
-在位置7处N已经变为I；
和/或
(iii)CDR3序列：
(e)SEQ ID NO:120；和
(f)与SEQ ID NO:120具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置1处E已经变为K；
-在位置4处A已经变为T；
-在位置11处I已经变为M或L；和/或
-在位置12处N已经变为D。
在另外的方面，本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基序列段：
(i)CDR1序列SEQ ID NO:76；和/或
(ii)CDR2序列SEQ ID NO:99；和/或
(iii)CDR3序列SEQ ID NO:120。
在另外的方面，本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基序列段：
(i)CDR1序列：
(a)SEQ ID NO:79-84；和
(b)与SEQ ID NO:79的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(ii)CDR2序列：
(c)SEQ ID NO:104-108；和
(d)与SEQ ID NO:104的氨基酸序列具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3序列：
(e)SEQ ID NO:124-125；和
(f)与SEQ ID NO:124的氨基酸序列具有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在另外的方面，本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基序列段：
(i)CDR1序列：
(a)SEQ ID NO:79；和
(b)与SEQ ID NO:79具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置2处S已经变为N；
-在位置3处V已经变为I；
-在位置7处N已经变为D；
-在位置8处D已经变为S；和/或
-在位置9处M已经变为V或T；
和/或
(ii)CDR2序列：
(c)SEQ ID NO:104；和
(d)与SEQ ID NO:104具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置1处D已经变为G；
-在位置5处R已经变为A；和/或
-在位置6处G已经变为D；
和/或
(iii)CDR3序列：
(e)SEQ ID NO:124；和
(f)与SEQ ID NO:124具有1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置4处T已经变为M。
在另外的方面，本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基序列段：
(i)CDR1序列SEQ ID NO:79；和/或
(ii)CDR2序列SEQ ID NO:104；和/或
(iii)CDR3序列SEQ ID NO:124。
在另外的方面，本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基序列段：
(i)CDR1序列：
(a)SEQ ID NO:85-86；和
(b)与SEQ ID NO:85的氨基酸序列具有1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(ii)CDR2序列：
(c)SEQ ID NO:109-110；和
(d)与SEQ ID NO:109的氨基酸序列具有1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3序列SEQ ID NO:126。
在另外的方面，本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基序列段：
(i)CDR1序列：
(a)SEQ ID NO:85；和
(b)与SEQ ID NO:85具有1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置2处S已经变为N；
和/或
(ii)CDR2序列：
(c)SEQ ID NO:109；和
(d)与SEQ ID NO:109具有1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置9处T已经变为S；
和/或
(iii)CDR3序列SEQ ID NO:126。
在另外的方面，本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基序列段：
(i)CDR1序列SEQ ID NO:85；和/或
(ii)CDR2序列SEQ ID NO:109；和/或
(iii)CDR3序列SEQ ID NO:126。
在另外的方面，本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基序列段：
(i)CDR1序列SEQ ID NO:87；和/或
(ii)CDR2序列SEQ ID NO:111；和/或
(iii)CDR3序列SEQ ID NO:127。
在另外的方面，本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基序列段：
(i)CDR1序列SEQ ID NO:77；和/或
(ii)CDR2序列：
(a)SEQ ID NO:112-113；和
(b)与SEQ ID NO:112的氨基酸序列具有1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3序列：
(c)SEQ ID NO:128-130；和
(d)与SEQ ID NO:128的氨基酸序列具有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在另外的方面，本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基序列段：
(i)CDR1序列SEQ ID NO:77；和/或
(ii)CDR2序列：
(a)SEQ ID NO:112；和
(b)与SEQ ID NO:112具有1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置4处D已经变为G；
和/或
(iii)CDR3序列：
(c)SEQ ID NO:128；和
(d)与SEQ ID NO:128具有1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置9处S已经变为P；和/或
-在位置13处T已经变为A。
在另外的方面，本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基序列段：
(i)CDR1序列SEQ ID NO:77；和/或
(ii)CDR2序列SEQ ID NO:112；和/或
(iii)CDR3序列SEQ ID NO:128。
在另外的方面，本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基序列段：
(i)CDR1序列SEQ ID NO:88；和/或
(ii)CDR2序列：
(a)SEQ ID NO:114-116；和
(b)与SEQ ID NO:114的氨基酸序列具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3序列：
(c)SEQ ID NO:131-132；和
(d)与SEQ ID NO:131的氨基酸序列具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在另外的方面，本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基序列段：
(i)CDR1序列SEQ ID NO:88；和/或
(ii)CDR2序列：
(a)SEQ ID NO:114；和
(b)与SEQ ID NO:114具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置1处V已经变为I或A；和/或
-在位置9处M已经变为I；
和/或
(iii)CDR3序列：
(c)SEQ ID NO:131；和
(d)与SEQ ID NO:131具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置4处G已经变为E；和/或
-在位置5处R已经变为Q。
在另外的方面，本发明的单价多肽可以包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基序列段：
(i)CDR1序列SEQ ID NO:88；和/或
(ii)CDR2序列SEQ ID NO:114；和/或
(iii)CDR3序列SEQ ID NO:131。
特别地，本发明的单价多肽可以是包含一个抗原结合位点的单价多肽，其中所述抗原结合位点包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基序列段：如上所述的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列(或其任何合适的组合)。然而，在优选的方面，本发明的单价多肽包含多于一个(诸如两个以上)选自由本发明的CDR1序列、本发明的CDR2序列和/或本发明的CDR3序列组成的组的氨基酸残基序列段。优选地，本发明的单价多肽包含三个分别选自由本发明的CDR1序列、本发明的CDR2序列和本发明的CDR3序列组成的组的氨基酸残基序列段。本文中提及的本发明的单价多肽所优选的CDR的组合列于表A-10中。
还应当注意的是，本发明不限制本发明的单价多肽的来源(或用于表达其的本发明的核酸的来源)，也不限制产生或获得(或已经产生或获得)本发明的单价多肽或核酸的方式。因此，本发明的单价多肽可以是天然存在的单价多肽(来自任何合适的物种)或者合成或半合成的单价多肽。
此外，技术人员还应该清楚，可能将一个或多个以上提及的CDR“移植(graft)”到其它“支架(scaffold)”上，所述支架包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架。适用于这种CDR移植的支架和技术对于技术人员是清楚的并且是本领域中公知的，参见例如US 7,180,370、WO 01/27160、EP 0605522、EP 0460167、US 7,054,297、Nicaise等人(Protein Science 13:1882-1891,2004)、Ewert等人(Methods 34:184-199,2004)、Kettleborough等人(Protein Eng.4:773-783,1991)、O’Brien和Jones(Methods Mol.Biol.207:81-100,2003)、Skerra(J.Mol.Recognit.13:167-187,2000)和Saerens等人(J.Mol.Biol.352:597-607,2005)以及其中引用的其它参考文献。例如，可以以类似方式使用本身已知的用于将小鼠或大鼠CDR移植到人框架和支架上的技术以提供嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含一个或多个本文中限定的用于本发明的单价多肽的CDR序列和一个或多个人框架区或序列。适用于呈递氨基酸序列的支架对于技术人员将是清楚的，并且例如包括，不限于，基于或来源于免疫球蛋白(即，不同于本文中已经描述的免疫球蛋白序列)的结合支架，来源于蛋白A结构域的蛋白质支架(诸如AffibodiesTM)，淀粉酶抑肽(tendamistat)，纤连蛋白(fibronectin)，脂笼蛋白(lipocalin)，CTLA-4，T细胞受体，设计的锚蛋白重复序列，avimer和PDZ结构域(Binz等人Nat.Biotech.,23:1257,2005)，和基于DNA或RNA的结合部分，包括但不限于DNA或RNA适配体(aptamer)(Ulrich等人Comb.Chem.High Throughput Screen 9:619-32,2006)。
在所述本发明的单价多肽中，CDR可以连接至另外的氨基酸序列和/或可以经由氨基酸序列彼此连接，其中所述氨基酸序列优选是框架序列或是充当框架序列的氨基酸序列，或一起形成用于呈递CDR的支架。
根据优选的但非限制性的实施方案，本发明的单价多肽包含与至少两个框架序列连接的至少三个CDR序列，其中优选地，三个CDR序列中的至少一个是CDR3序列，而其它两个CDR序列是CDR1或CDR2序列，并且优选地是一个CDR1序列和一个CDR2序列。根据一个特别优选的但非限制性的实施方案，本发明的单价多肽具有结构FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中CDR1、CDR2和CDR3是如本文中对于本发明的单价多肽所限定的，并且FR1、FR2、FR3和FR4是框架序列。在这种本发明的单价多肽中，框架序列可以是任何合适的框架序列，并且例如基于标准手册和本文中的进一步公开内容和提及的现有技术，合适的框架序列的实例对于技术人员将是清楚的。
因此，本发明的单价多肽基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
(i)CDR1选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:73-88；和
(b)与SEQ ID NO:73-88的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:90-116；和
(d)与SEQ ID NO:90-116的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(e)SEQ ID NO:118-132和282-284；和
(f)与SEQ ID NO:118-132和282-284的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
另外的优选CDR序列在表A-10中描述。
所得结合物的序列分析还导致鉴定了8个不同的家族，即家族7、家族26、家族82、家族109、家族85、家族38、家族110和家族108。表A-1、表A-2、表A-3、表A-4、表A-5、表A-6、表A-7和表A-8中分别提供了相应的比对。分为不同的家族是基于CDR的序列相似性和差异。家族7包括21个克隆(SEQ ID NO:1-21)，家族26包括11个克隆(SEQ ID NO:22-32)，家族82包括23个克隆(SEQ ID NO:33-55)，家族109包括6个克隆(SEQ ID NO:56-61)，家族85和108各自由仅一个克隆代表(分别为SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:72)，家族38包括6个克隆(SEQ ID NO:63-68)，并且家族110包括3个克隆(SEQ ID NO:69-71)。基于结合GITR的高亲和力和人T细胞激活(实施例5)来分离所有家族的代表物。通常，家族7、家族26和家族109代表物显示出最佳EC50值。
根据优选的但非限制性的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述至少一个免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:73-75；和
(b)与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:90-98；和
(d)与SEQ ID NO:90的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(e)SEQ ID NO:118-119、123和282-284；和
(f)与SEQ ID NO:118的氨基酸序列具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
根据优选的但非限制性的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述至少一个免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:73；和
(b)与SEQ ID NO:73具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置2处T已经变为S；
-在位置7处D已经变为N；
-在位置8处S已经变为A；和/或
-在位置10处A已经变为G；
和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:90；和
(d)与SEQ ID NO:90具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置1处A已经变为H、T或G；
-在位置2处I已经变为M；
-在位置3处T已经变为S；
-在位置6处G已经变为S；
-在位置7处S已经变为R或G；和/或
-在位置8处P已经变为S、T或R；
和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(e)SEQ ID NO:118；和
(f)与SEQ ID NO:118具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置9处A已经变为P；
-在位置11处M已经变为L、K、R或Q；和/或
-在位置12处D已经变为N。
根据优选的但非限制性的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述至少一个免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
i)CDR1由SEQ ID NO:73表示，CDR2由SEQ ID NO:90表示，且CDR3由SEQ ID NO:118表示；或
ii)CDR1由SEQ ID NO:73表示，CDR2由SEQ ID NO:90表示，且CDR3由SEQ ID NO:123表示。
根据优选的但非限制性的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述至少一个免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:76-78；和
(b)与SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:99-103；和
(d)与SEQ ID NO:99的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(e)SEQ ID NO:120-123；和
(f)与SEQ ID NO:120的氨基酸序列具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
根据优选的但非限制性的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述至少一个免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:76；和
(b)与SEQ ID NO:76具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置7处D已经变为N；和/或
-在位置8处S已经变为A；
和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:99；和
(d)与SEQ ID NO:99具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置1处A已经变为S或T；
-在位置5处S已经变为T、G或R；
-在位置6处T已经变为K；和/或
-在位置7处N已经变为I；
和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(e)SEQ ID NO:120；和
(f)与SEQ ID NO:120具有4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置1处E已经变为K；
-在位置4处A已经变为T；
-在位置11处I已经变为M或L；和/或
-在位置12处N已经变为D。
根据优选的但非限制性的方面，本发明涉及如本文所述的单价多肽，其中所述至少一个免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：CDR1由SEQ ID NO:76表示，CDR2由SEQ ID NO:99表示，且CDR3由SEQ ID NO:120表示。
根据优选的但非限制性的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述至少一个免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:79-84；和
(b)与SEQ ID NO:79的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:104-108；和
(d)与SEQ ID NO:104的氨基酸序列具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(e)SEQ ID NO:124-125；和
(f)与SEQ ID NO:124的氨基酸序列具有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
根据优选的但非限制性的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述至少一个免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:79；和
(b)与SEQ ID NO:79具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置2处S已经变为N；
-在位置3处V已经变为I；
-在位置7处N已经变为D；
-在位置8处D已经变为S；和/或
-在位置9处M已经变为V或T；
和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:104；和
(d)与SEQ ID NO:104具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置1处D已经变为G；
-在位置5处R已经变为A；和/或
-在位置6处G已经变为D；
和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(e)SEQ ID NO:124；和
(f)与SEQ ID NO:124具有1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置4处T已经变为M。
根据优选的但非限制性的方面，本发明涉及如本文所述的单价多肽，其中所述至少一个免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：CDR1由SEQ ID NO:79表示，CDR2由SEQ ID NO:104表示，且CDR3由SEQ ID NO:124表示。
根据优选的但非限制性的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述至少一个免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:85-86；和
(b)与SEQ ID NO:85的氨基酸序列具有1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:109-110；和
(d)与SEQ ID NO:109的氨基酸序列具有1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3是SEQ ID NO:126。
根据优选的但非限制性的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述至少一个免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:85；和
(b)与SEQ ID NO:85具有1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置2处S已经变为N；
和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:109；和
(d)与SEQ ID NO:109具有1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置9处T已经变为S；
和/或
(iii)CDR3是SEQ ID NO:126。
根据优选的但非限制性的方面，本发明涉及如本文所述的单价多肽，其中所述至少一个免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：CDR1由SEQ ID NO:85表示，CDR2由SEQ ID NO:109表示，且CDR3由SEQ ID NO:126表示。
根据优选的但非限制性的方面，本发明涉及如本文所述的单价多肽，其中所述至少一个免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：CDR1由SEQ ID NO:87表示，CDR2由SEQ ID NO:111表示，且CDR3由SEQ ID NO:127表示。
根据优选的但非限制性的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述至少一个免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1是SEQ ID NO:77；和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:112-113；和
(b)与SEQ ID NO:112的氨基酸序列具有1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:128-130；和
(d)与SEQ ID NO:128的氨基酸序列具有1个氨基酸差异的氨基酸序列。
根据优选的但非限制性的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述至少一个免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1是SEQ ID NO:77；和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:112；和
(b)与SEQ ID NO:112具有1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置4处D已经变为G；
和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:128；和
(d)与SEQ ID NO:128具有1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置9处S已经变为P；和/或
-在位置13处T已经变为A。
根据优选的但非限制性的方面，本发明涉及如本文所述的单价多肽，其中所述至少一个免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：CDR1由SEQ ID NO:77表示，CDR2由SEQ ID NO:112表示，且CDR3由SEQ ID NO:128表示。
根据优选的但非限制性的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述至少一个免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1是SEQ ID NO:88；和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:114-116；和
(d)与SEQ ID NO:114的氨基酸序列具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(e)SEQ ID NO:131-132；和
(f)与SEQ ID NO:131的氨基酸序列具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
根据优选的但非限制性的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述至少一个免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1是SEQ ID NO:88；和/或
(ii)CDR2选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:114；和
(b)与SEQ ID NO:114具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置1处V已经变为I或A；和/或
-在位置9处M已经变为I；
和/或
(iii)CDR3选自由以下组成的组：
(c)SEQ ID NO:131；和
(d)与SEQ ID NO:131具有2或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-在位置4处G已经变为E；和/或
-在位置5处R已经变为Q。
根据优选的但非限制性的方面，本发明涉及如本文所述的单价多肽，其中所述至少一个免疫球蛋白单可变结构域基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：CDR1由SEQ ID NO:88表示，CDR2由SEQ ID NO:114表示，且CDR3由SEQ ID NO:131表示。
根据优选的但非限制性的方面，本发明涉及如本文所述的单价多肽，其中所述至少一个免疫球蛋白单可变结构域选自ISVD的组，其中：
-CDR1是SEQ ID NO:73，CDR2是SEQ ID NO:90；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:74，CDR2是SEQ ID NO:91；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:74，CDR2是SEQ ID NO:92；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:74，CDR2是SEQ ID NO:93；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:74，CDR2是SEQ ID NO:94；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:74，CDR2是SEQ ID NO:95；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:75，CDR2是SEQ ID NO:93；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:74，CDR2是SEQ ID NO:96；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:74，CDR2是SEQ ID NO:97；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:74，CDR2是SEQ ID NO:98；且CDR3是SEQ ID NO:119；
-CDR1是SEQ ID NO:73，CDR2是SEQ ID NO:90；且CDR3是SEQ ID NO:123；
-CDR1是SEQ ID NO:73，CDR2是SEQ ID NO:90；且CDR3是SEQ ID NO:282；
-CDR1是SEQ ID NO:73，CDR2是SEQ ID NO:90；且CDR3是SEQ ID NO:283；
-CDR1是SEQ ID NO:73，CDR2是SEQ ID NO:90；且CDR3是SEQ ID NO:284；
-CDR1是SEQ ID NO:76，CDR2是SEQ ID NO:99；且CDR3是SEQ ID NO:120；
-CDR1是SEQ ID NO:77，CDR2是SEQ ID NO:100；且CDR3是SEQ ID NO:121；
-CDR1是SEQ ID NO:78，CDR2是SEQ ID NO:101；且CDR3是SEQ ID NO:122；
-CDR1是SEQ ID NO:76，CDR2是SEQ ID NO:102；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:77，CDR2是SEQ ID NO:103；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:76，CDR2是SEQ ID NO:99；且CDR3是SEQ ID NO:118；
-CDR1是SEQ ID NO:78，CDR2是SEQ ID NO:99；且CDR3是SEQ ID NO:123；
-CDR1是SEQ ID NO:79，CDR2是SEQ ID NO:104；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:76，CDR2是SEQ ID NO:105；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:76，CDR2是SEQ ID NO:106；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:80，CDR2是SEQ ID NO:106；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:81，CDR2是SEQ ID NO:104；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:82，CDR2是SEQ ID NO:104；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:83，CDR2是SEQ ID NO:104；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:84，CDR2是SEQ ID NO:104；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:83，CDR2是SEQ ID NO:106；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:83，CDR2是SEQ ID NO:107；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:83，CDR2是SEQ ID NO:108；且CDR3是SEQ ID NO:124；
-CDR1是SEQ ID NO:83，CDR2是SEQ ID NO:104；且CDR3是SEQ ID NO:125；
-CDR1是SEQ ID NO:85，CDR2是SEQ ID NO:109；且CDR3是SEQ ID NO:126；
-CDR1是SEQ ID NO:86，CDR2是SEQ ID NO:110；且CDR3是SEQ ID NO:126；
-CDR1是SEQ ID NO:85，CDR2是SEQ ID NO:110；且CDR3是SEQ ID NO:126；
-CDR1是SEQ ID NO:87，CDR2是SEQ ID NO:111；且CDR3是SEQ ID NO:127；
-CDR1是SEQ ID NO:77，CDR2是SEQ ID NO:112；且CDR3是SEQ ID NO:128；
-CDR1是SEQ ID NO:77，CDR2是SEQ ID NO:112；且CDR3是SEQ ID NO:129；
-CDR1是SEQ ID NO:77，CDR2是SEQ ID NO:113；且CDR3是SEQ ID NO:130；
-CDR1是SEQ ID NO:77，CDR2是SEQ ID NO:112；且CDR3是SEQ ID NO:130；
-CDR1是SEQ ID NO:88，CDR2是SEQ ID NO:114；且CDR3是SEQ ID NO:131；
-CDR1是SEQ ID NO:88，CDR2是SEQ ID NO:115；且CDR3是SEQ ID NO:131；以及
-CDR1是SEQ ID NO:88，CDR2是SEQ ID NO:116；且CDR3是SEQ ID NO:132。
具有如上所述的CDR的本发明的代表性多肽在表A-10中显示。
在一个方面，单价多肽在其序列内具有与SEQ ID NO:1-21中任一个相比相同数目的氨基酸。在另一个方面，单价多肽的位置8和位置106(根据Kabat编号)之间的氨基酸序列与SEQ ID NO:1-21中任一个相比具有89％以上的序列同一性。优选地，单价多肽在其序列内具有与SEQ ID NO:1-21中任一个相比相同数目的氨基酸，并且单价多肽的位置8和位置106(根据Kabat编号)之间的氨基酸序列与SEQ ID NO:1-21中任一个相比具有89％以上的序列同一性。在另一个优选的方面，单价多肽属于家族7，诸如例如选自SEQ ID NO:1-21中任一个的单价多肽。
在一个方面，单价多肽在其序列内具有与SEQ ID NO:22-32中任一个相比相同数目的氨基酸。在另一个方面，单价多肽的位置8和位置106(根据Kabat编号)之间的氨基酸序列与SEQ ID NO:22-32中任一个相比具有89％以上的序列同一性。优选地，单价多肽在其序列内具有与SEQ ID NO:22-32中任一个相比相同数目的氨基酸，并且单价多肽的位置8和位置106(根据Kabat编号)之间的氨基酸序列与SEQ ID NO:22-32中任一个相比具有89％以上的序列同一性。在另一个优选的方面，单价多肽属于家族26，诸如例如选自SEQ ID NO:22-32中任一个的单价多肽。
在一个方面，单价多肽在其序列内具有与SEQ ID NO:33-55中任一个相比相同数目的氨基酸。在另一个方面，单价多肽的位置8和位置106(根据Kabat编号)之间的氨基酸序列与SEQ ID NO:33-55中任一个相比具有89％以上的序列同一性。优选地，单价多肽在其序列内具有与SEQ ID NO:33-55中任一个相比相同数目的氨基酸，并且单价多肽的位置8和位置106(根据Kabat编号)之间的氨基酸序列与SEQ ID NO:33-55中任一个相比具有89％以上的序列同一性。在另一个优选的方面，单价多肽属于家族82，诸如例如选自SEQ ID NO:33-55中任一个的单价多肽。
在一个方面，单价多肽在其序列内具有与SEQ ID NO:56-61中任一个相比相同数目的氨基酸。在另一个方面，单价多肽的位置8和位置106(根据Kabat编号)之间的氨基酸序列与SEQ ID NO:56-61中任一个相比具有89％以上的序列同一性。优选地，单价多肽在其序列内具有与SEQ ID NO:56-61中任一个相比相同数目的氨基酸，并且单价多肽的位置8和位置106(根据Kabat编号)之间的氨基酸序列与SEQ ID NO:56-61中任一个相比具有89％以上的序列同一性。在另一个优选的方面，单价多肽属于家族109，诸如例如选自SEQ ID NO:56-61中任一个的单价多肽。
在一个方面，单价多肽在其序列内具有与SEQ ID NO:63-68中任一个相比相同数目的氨基酸。在另一个方面，单价多肽的位置8和位置106(根据Kabat编号)之间的氨基酸序列与SEQ ID NO:63-68中任一个相比具有89％以上的序列同一性。优选地，单价多肽在其序列内具有与SEQ ID NO:63-68中任一个相比相同数目的氨基酸，并且单价多肽的位置8和位置106(根据Kabat编号)之间的氨基酸序列与SEQ ID NO:63-68中任一个相比具有89％以上的序列同一性。在另一个优选的方面，单价多肽属于家族38，诸如例如选自SEQ ID NO:63-68中任一个的单价多肽。
在一个方面，单价多肽在其序列内具有与SEQ ID NO:69-71中任一个相比相同数目的氨基酸。在另一个方面，单价多肽的位置8和位置106(根据Kabat编号)之间的氨基酸序列与SEQ ID NO:69-71中任一个相比具有89％以上的序列同一性。优选地，单价多肽在其序列内具有与SEQ ID NO:69-71中任一个相比相同数目的氨基酸，并且单价多肽的位置8和位置106(根据Kabat编号)之间的氨基酸序列与SEQ ID NO:69-71中任一个相比具有89％以上的序列同一性。在另一个优选的方面，单价多肽属于家族110，诸如例如选自SEQ ID NO:69-71中任一个的单价多肽。
包含一个或多个以上指定的氨基酸残基序列段的单价多肽可以调节(即，增加、增强、刺激或加强)GITR的活性。更特别地，本发明的单价多肽可以增强免疫应答。同样地，这些本发明的多肽可以增强T细胞、B细胞或天然杀伤细胞的增殖或激活。
可以通过各种测定来确定T细胞、B细胞或天然杀伤细胞的增殖或激活，包括但不限于增殖测定、细胞毒性测定、细胞杀伤测定、报告基因测定(例如NF-κB荧光素酶报告分子测定)、T细胞激活测定、细胞表面受体结合测定和测量激活和细胞因子分泌的已知标志物的表达的测定，其全部是本领域中已知的。
例如，可以使用用于监测细胞因子产生的几种常规测定中的任何一种(诸如IFN-γ和白细胞介素)作为免疫细胞激活的量度。例如，为了跟踪T细胞激活，可以采用白细胞介素-2作为标志物，其可以如Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86:1333(1989)中描述的进行测定。
还可以采用免疫荧光和流式细胞术来监测细胞因子产生，并且监测反映细胞激活状态的细胞表面标志物。许多这样的标志物是已知的，检测抗体是广泛地可商购的，并且标志物是本领域中公知的。
T细胞增殖的常用测定需要测量氚化胸苷的结合。可以通过确定结合到培养细胞的复制DNA中的3H-标记的胸苷的量来在体外测量T细胞的增殖。因此，可以量化DNA合成的速率以及细胞分裂的速率。
可以在结合测定中测量本发明的单价多肽与GITR的结合。典型的测定包括(不限于)其中将GITR暴露于细胞(诸如例如Flp-InTM-293细胞或GloResponseTM NF-κB-Nluc2P HEK293细胞)表面上的测定。用于测量本发明的多肽与GITR的结合的优选测定是FACS测定，诸如例如实施例中描述的FACS测定，其中确定本发明的多肽与Flp-InTM-293细胞和/或活化T细胞上表达的GITR的结合。由本文中的进一步描述和实施例，本发明的多肽结合GITR的一些优选EC50值将变得清楚。
在这种FACS结合测定中，本发明的单价多肽在结合人GITR方面可以具有的EC50值为10-8M以下，更优选10-9M以下，或者甚至10-10M以下。例如，在这种FACS结合测定中，本发明的单价多肽在结合人GITR方面可以具有的EC50值为10-10M至10-8M，诸如10-9M至10-8M、10-10M至10-9M。
本发明还涉及与SEQ ID NO:1-71的氨基酸序列中的至少一个具有至少80％氨基酸同一性(或如本文中所限定的序列同一性)，优选至少85％氨基酸同一性，更优选至少90％氨基酸同一性，诸如95％、96％、97％、98％、99％氨基酸同一性以上或甚至(基本上)100％氨基酸同一性的单价多肽。
在一个特定的但非限制性的方面，本发明的单价多肽可以是包含免疫球蛋白折叠的单价多肽或在合适的条件(诸如生理条件)下能够形成免疫球蛋白折叠(即，通过折叠)的单价多肽。特别参考Halaby等人的综述(J.Protein Eng.12:563-71,1999)。优选地，当正确折叠从而形成免疫球蛋白折叠时，氨基酸残基的序列段可以能够正确地形成结合GITR的抗原结合位点。因此，在优选的方面，本发明的单价多肽是免疫球蛋白，诸如例如免疫球蛋白单可变结构域。
因此，框架序列优选地是免疫球蛋白框架序列或来源于免疫球蛋白框架序列(例如，通过序列优化如人源化或骆驼源化)的框架序列(的合适的组合)。例如，框架序列可以是来源于免疫球蛋白单可变结构域如轻链可变结构域(例如，VL-序列)和/或重链可变结构域(例如，VH-序列)的框架序列。在一个特别优选的方面，框架序列是来源于VHH-序列的框架序列(其中所述框架序列可以任选地被部分或完全人源化)或是已被骆驼源化的常规VH序列(如本文中限定的)。
框架序列可以优选是这样的，其使得本发明的单价多肽是免疫球蛋白单可变结构域，诸如结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸序列)；单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸)；“dAb”(或适合用作dAb的氨基酸)；VHH序列；人源化的VHH序列；骆驼源化的VH序列；或通过亲和力成熟获得的VHH序列。同样地，例如基于标准手册和本文中的进一步公开内容和提及的现有技术，合适的框架序列对于技术人员将是清楚的。
特别地，存在于本发明的单价多肽中的框架序列可以含有一个或多个标志残基(如WO 08/020079(表A-3至A-8)中限定的)，以使得本发明的单价多肽是纳米抗体。这种框架序列(的合适的组合)的一些优选的但非限制性的实例将由本文中的进一步公开(参见例如表A-10)而变得清楚。通常，纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)可以特别地特征在于在一个或多个框架序列中存在一个或多个“标志残基”(如例如在WO 08/020079第61页第24行至第98页第3行中进一步描述的)。
更特别地，本发明提供包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，所述免疫球蛋白单可变结构域是具有以下(一般性)结构的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别是指框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补决定区1至3，并且所述结构：
i)与SEQ ID NO:1-71(参见表A-9)的氨基酸序列中的至少一个具有至少80％、更优选90％、甚至更优选95％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度，不考虑形成CDR序列的氨基酸残基。在这方面，同样参考表A-10，其列出了SEQ ID NO:1-71(参见表A-9)的免疫球蛋白单可变结构域的框架1序列(SEQ ID NO:134-152)、框架2序列(SEQ ID NO:153-162)、框架3序列(SEQ ID NO:163-200)和框架4序列(SEQ ID NO:201-205)；或
ii)如表A-10中所示的框架序列的组合；
并且其中：
iii)优选地，根据Kabat编号的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108处的一个或多个氨基酸残基选自WO 08/020079的表A-3至表A-8中提及的标志残基。
本发明还提供若干序列优化的免疫球蛋白单可变结构域。
特别地，序列优化的免疫球蛋白单可变结构域可以是如先前段落中对于免疫球蛋白单可变结构域一般性限定的氨基酸序列，但是其中存在至少一个氨基酸残基(并且特别地，在至少一个框架残基中)，所述残基是和/或对应于人源化置换(如本文中限定的)。基于本文中的公开内容，一些优选的但非限制性的人源化置换(及其合适的组合)对于技术人员将是清楚的。另外地或备选地，其它可能有用的人源化置换可以通过将天然存在的VHH序列的框架区的序列与一个或多个紧密相关的人VH序列的相应的框架序列比较来确定，之后可以将由此确定的一个或多个可能有用的人源化置换(或其组合)引入到所述VHH序列中(以任何本身已知的方式，如本文中进一步描述的)并且可以测试所得的人源化的VHH序列对靶标的亲和力、稳定性、表达的容易性和水平、和/或其他所需的性质。以此方式，通过有限程度的尝试和误差，技术人员可以基于本文中的公开内容确定其他合适的人源化置换(或其合适的组合)。此外，基于以上，免疫球蛋白单可变结构域(的框架区)可以被部分人源化或完全人源化。
本发明还提供若干序列优化的免疫球蛋白单可变结构域，其可以在稳定性研究期间的存储后显示出提高的表达和/或增加的稳定性。本发明的氨基酸序列可以显示减少的N-末端的焦谷氨酸翻译后修饰并且因此具有增加的产物稳定性。另外，相比于其相应的亲本氨基酸序列，本发明的氨基酸序列可以显示其他改善的性质，诸如例如较小的免疫原性，改善的对GITR的结合特性(合适地被测量和/或表示为KD-值(实际或表观)、KA-值(实际或表观)、kon-速率和/或koff-速率，或备选地为IC50值，如本文中进一步描述的)，对GITR的提高的亲和力和/或提高的亲合力和/或使GITR激动的提高的功效和/或效力。
一些特别优选的本发明的序列优化的免疫球蛋白单可变结构域是SEQ ID NO:1-71的免疫球蛋白单可变结构域的序列优化的变体；SEQ ID NO:268-275的氨基酸序列是一些尤其优选的实例。
因此，一些其它优选的本发明的免疫球蛋白单可变结构域是这样的纳米抗体，其可以结合(如本文中进一步限定的)GITR并且：
i)是SEQ ID NO:1-71的免疫球蛋白单可变结构域中的一个的序列优化的变体；和/或
ii)与SEQ ID NO:1-71的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一个和/或SEQ ID NO:268-275的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一个(参见表A-9)具有至少80％氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度，不考虑形成CDR序列的氨基酸残基；在这方面，同样参考表A-10，其列出了SEQ ID NO:1-71和268-275(参见表A-9)的免疫球蛋白单可变结构域的框架1序列(SEQ ID NO:134-152、276和278)、框架2序列(SEQ ID NO:153-162)、框架3序列(SEQ ID NO:163-200、277和279-281)和框架4序列(SEQ ID NO:201-205)；或
iii)具有表A-10中所示的框架序列的组合；
并且其中：
iv)优选地，根据Kabat编号的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108处的一个或多个氨基酸残基选自WO 08/020079的表A-3至表A-8中提及的标志残基。
本发明的免疫球蛋白(并且特别是免疫球蛋白单可变结构域)也可以包含标题都为“改进的免疫球蛋白可变结构域”的以下共同未决的美国临时申请中描述的特定突变/氨基酸残基：2014年5月16日提交的US 61/994552；2014年6月18日提交的US 61/014,015；2014年8月21日提交的US 62/040,167；和2014年9月8日提交的US 62/047,560(皆让与埃博灵克斯股份有限公司)，以及基于这些临时申请并于2015年11月19日公开的国际申请WO 2015/173325。
特别地，本发明的免疫球蛋白(并且特别是免疫球蛋白单可变结构域)可以合适地含有(i)位置112处的K或Q；或(ii)位置110处的K或Q连同位置11处的V；或(iii)位置89处的T；或(iv)位置89处的L以及位置110处的K或Q；或(v)位置11处的V和位置89处的L；或者(i)至(v)的任何合适的组合。
如同样在所述共同未决的美国临时申请中所描述的，当本发明的免疫球蛋白含有根据以上(i)至(v)之一的突变(或其合适的组合)时：
-位置11处的氨基酸残基优选地选自L、V或K(并且最优选是V)；并且
-位置14处的氨基酸残基优选地合适地选自A或P；并且
-位置41处的氨基酸残基优选地合适地选自A或P；并且
-位置89处的氨基酸残基优选地合适地选自T、V或L；并且
-位置108处的氨基酸残基优选地合适地选自Q或L；并且
-位置110处的氨基酸残基优选地合适地选自T、K或Q；并且
-位置112处的氨基酸残基优选地合适地选自S、K或Q。
如在所述共同未决的美国临时申请中提及的，所述突变可以有效地防止或减少所谓的“预先存在的(pre-existing)抗体”与本发明的免疫球蛋白和化合物的结合。为此，本发明的免疫球蛋白还可以含有(任选地与所述突变组合的)C-端延伸(X)n(其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(并且优选1或2，诸如1)；并且各X是独立选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，并且优选地独立地选自由以下组成的组：丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I))，关于这点可再次参考所述美国临时申请以及WO 12/175741。特别地，当C-端延伸形成包含其的蛋白质、多肽或其他化合物或构建体的C-端末端时，本发明的免疫球蛋白可以含有这种C-端延伸(同样，如所述美国临时申请以及WO 12/175741中进一步描述的)。
含有这种突变和/或这种C-端延伸的本发明的免疫球蛋白的一些特别优选的但非限制性的实例在SEQ ID NO:268-275和285-290中给出。
在优选的方面，本发明提供选自SEQ ID NO:1-71和268-275中任一个的免疫球蛋白或单价多肽。
本发明还涉及针对GITR的单价多肽和/或免疫球蛋白单可变结构域，其交叉阻断具有SEQ ID NO:1-71和268-275的免疫球蛋白中的至少一个与GITR结合和/或被具有SEQ ID NO:1-71和268-275的免疫球蛋白中的至少一个交叉-阻断其与GITR结合。
本发明还涉及针对GITR的单价多肽和/或免疫球蛋白单可变结构域，其与本发明的单价多肽(更特别是具有SEQ ID NO:1-71和268-275的单价多肽)结合相同的表位。
在特别的方面，本发明涉及针对GITR的单价多肽和/或免疫球蛋白单可变结构域，其与属于家族7、家族26、家族82、家族85和家族38的本发明的单价多肽(更特别是具有SEQ ID NO:1-55、62-68和269-275的单价多肽)结合相同的表位。
在另一个特别的方面，本发明涉及针对GITR的单价多肽和/或免疫球蛋白单可变结构域，其与属于家族109和家族110的本发明的单价多肽(更特别是具有SEQ ID NO:56-61、69-71和268的单价多肽)结合相同的表位。
而且，这种单价多肽可以是以任何合适的方式衍生的和来自任何合适的来源的免疫球蛋白(诸如免疫球蛋白单可变结构域)，并且可以例如是天然存在的VHH序列(即，来自合适的骆驼科物种)或者合成的或半合成的氨基酸序列，包括但不限于“人源化的”(如本文中限定的)纳米抗体或VHH序列，“骆驼源化的”(如本文中限定的)免疫球蛋白序列(并且特别是骆驼源化的重链可变结构域序列)，以及已经通过诸如亲和力成熟(例如，由合成的、随机的或天然存在的免疫球蛋白序列开始)、CDR移植、镶饰(veneering)、组合来源于不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR组装的技术和技术人员熟知的用于改造免疫球蛋白序列的类似技术获得的纳米抗体；或前述任一种的任何合适的组合，如本文中进一步描述的。同样地，当免疫球蛋白包含VHH序列时，所述免疫球蛋白可以被合适地人源化，如本文中进一步描述的，从而提供一个或多个另外的(部分地或完全地)人源化的本发明的免疫球蛋白。类似地，当免疫球蛋白包含合成的或半合成的序列(如部分人源化的序列)时，所述免疫球蛋白可以任选地被进一步合适地人源化(同样如本文所描述的)，从而同样提供一个或多个另外的(部分地或完全地)人源化的本发明的免疫球蛋白。
这些本发明的单价多肽，并且特别是本发明的包含CDR序列的免疫球蛋白，特别适合用作用于制备多价多肽的结构单元或结合单元。
因此，结合GITR的本发明的单价多肽可以基本上处于分离的形式(如本文中限定的)，或者它们可以形成蛋白或多肽的一部分，所述蛋白或多肽可以包含一个或多个结合GITR的单价多肽或基本上由其组成并且可以任选地进一步包含一个或多个另外的氨基酸序列(全部任选地经由一个或多个合适的接头连接)。本发明还涉及包含一个或多个本发明的单价多肽(或其合适的片段)或基本上由其组成的蛋白或多肽。
所述一个或多个本发明的单价多肽因此被用作这种蛋白或多肽中的结合单元或结构单元，从而分别提供本发明的单价、多价或多互补位多肽，全部如本文所描述的。本发明因此还涉及这样的多肽，所述多肽是包含一个本发明的单价多肽或基本上由其组成的单价构建体。本发明因此还涉及这样的多肽，所述多肽是包含两个以上本发明的单价多肽或基本上由其组成的多价多肽，诸如例如二价、三价、四价、五价或六价多肽(对于含有一个或多个VHH结构域的多价和多特异性多肽及其制备，同样参考Conrath等人(J.Biol.Chem.276:7346-7350,2001)，以及例如WO 96/34103、WO 99/23221和WO 2010/115998)。
本发明的多价多肽
本发明还涉及多价多肽(在本文中也被称为“本发明的多价多肽”)，所述多价多肽包含至少一个针对GITR(优选人GITR)的免疫球蛋白单可变结构域(或其合适的片段)和一个另外的免疫球蛋白单可变结构域，或(基本上)由其组成。
在优选的方面，本发明的多价多肽包含两个以上针对GITR的免疫球蛋白单可变结构域，或基本上由其组成。所述两个以上免疫球蛋白单可变结构域可以任选地经由一个或多个肽接头连接。
在本发明的多价多肽中，两个以上免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体可以是相同的或不同的，并且可以针对相同的抗原或抗原决定簇(例如，针对相同的部分或表位或者针对不同的部分或表位)或可以备选地针对不同的抗原或抗原决定簇；或其任何合适的组合。例如，本发明的二价多肽可以包含：(a)两个相同的免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体；(b)针对蛋白或抗原的第一抗原决定簇的第一免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，和针对所述蛋白或抗原的相同的抗原决定簇的第二免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，所述第二免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体不同于所述第一免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体；(c)针对蛋白或抗原的第一抗原决定簇的第一免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，和针对所述蛋白或抗原的另一个抗原决定簇的第二免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体；或(d)针对第一蛋白或抗原的第一免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，和针对第二蛋白或抗原(即，不同于所述第一蛋白或抗原)的第二免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体。类似地，本发明的三价多肽可以，例如且不限于此，包含：(a)三个相同的免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体；(b)针对蛋白或抗原的第一抗原决定簇的两个相同的免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，和针对相同蛋白或抗原的不同抗原决定簇的第三免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体；(c)针对蛋白或抗原的第一抗原决定簇的两个相同的免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，和针对不同于所述第一蛋白或抗原的第二蛋白或抗原的第三免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体；(d)针对第一蛋白或抗原的第一抗原决定簇的第一免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，针对所述第一蛋白或抗原的第二抗原决定簇的第二免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，和针对不同于所述第一蛋白或抗原的第二蛋白或抗原的第三免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体；或(e)针对第一蛋白或抗原的第一免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，针对不同于所述第一蛋白或抗原的第二蛋白或抗原的第二免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，和针对不同于所述第一和第二蛋白或抗原的第三蛋白或抗原的第三免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体。
含有至少两个免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体的本发明的多肽(其中至少一个免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体针对第一抗原(即，针对GITR)并且至少一个免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体针对第二抗原(即，不同于GITR))也被称为本发明的“多特异性”多肽，并且存在于这种多肽中的免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体在本文中也被称为处于“多特异性格式”。因此，例如，本发明的“双特异性”多肽是这样的多肽，其包含至少一个针对第一抗原(即GITR)的免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体和至少一个针对第二抗原(即，不同于GITR)的另外的免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，而本发明的“三特异性”多肽是这样的多肽，其包含至少一个针对第一抗原(即GITR)的免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体、至少一个针对第二抗原(即，不同于GITR)的另外的免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体、和至少一个针对第三抗原(即，不同于GITR和第二抗原二者)的另外的免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体；等等。
因此，在一个方面，以其最简单的形式，本发明的多价多肽是本发明的二价多肽，其包含针对GITR的第一免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，和针对GITR的相同的第二免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，其中所述第一和第二免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体可以任选地经由接头序列连接(如本文中限定的)；以其最简单的形式，本发明的多价多肽可以是本发明的三价多肽，其包含针对GITR的第一免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体、针对GITR的相同的第二免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体、和针对GITR的相同的第三免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，其中所述第一、第二和第三免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体可以任选地经由一个或多个(并且特别是两个)接头序列连接。
在另一个方面，本发明的多价多肽可以是本发明的双特异性多肽，其包含针对GITR的第一免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，和针对第二抗原的第二免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，其中所述第一和第二免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体可以任选地经由接头序列连接(如本文中限定的)；而本发明的多价多肽还可以是本发明的三特异性多肽，其包含针对GITR的第一免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体、针对第二抗原的第二免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体、和针对第三抗原的第三免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，其中所述第一、第二和第三免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体可以任选地经由一个或多个(并且特别是两个)接头序列连接。
在优选的方面，本发明的多肽是三价、双特异性多肽。本发明的三价、双特异性多肽，以其最简单的形式，可以是本发明的三价多肽(如本文中限定的)，其包含针对GITR的两个相同的免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，和针对另一个抗原(例如血清白蛋白)的第三免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，其中所述第一、第二和第三免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体可以任选地经由一个或多个(并且特别是两个)接头序列连接。根据本发明的特别优选的三价、双特异性多肽是本文描述的实施例和表A-11中所示的那些多肽。
在另一个优选的方面，本发明的多肽是四价、双特异性多肽。本发明的四价、双特异性多肽，以其最简单的形式，可以是本发明的四价多肽(如本文中限定的)，其包含针对GITR的三个相同的免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，和针对另一个抗原(例如血清白蛋白)的第四免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，其中所述第一、第二、第三和第四免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体可以任选地经由一个或多个(并且特别是三个)接头序列连接。根据本发明的特别优选的四价、双特异性多肽是本文描述的实施例和表A-11中所示的那些多肽。
在另一个优选的方面，本发明的多肽是五价、双特异性多肽。本发明的五价、双特异性多肽，以其最简单的形式，可以是本发明的五价多肽(如本文中限定的)，其包含针对GITR的四个相同的免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，和针对另一个抗原(例如血清白蛋白)的第五免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，其中所述第一、第二、第三、第四和第五免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体可以任选地经由一个或多个(并且特别是四个)接头序列连接。
在另一个优选的方面，本发明的多肽是六价、双特异性多肽。本发明的六价、双特异性多肽，以其最简单的形式，可以是本发明的六价多肽(如本文中限定的)，其包含针对GITR的五个相同的免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，和针对另一个抗原(例如血清白蛋白)的第六免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，其中所述第一、第二、第三、第四、第五和第六免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体可以任选地经由一个或多个(并且特别是五个)接头序列连接。
在另外的方面，本发明的多肽是多互补位多肽(在本文中也被称为“本发明的多互补位多肽”)，诸如例如(a)“本发明的双互补位多肽”或“本发明的三互补位多肽”。如本文所用的术语“多互补位”(抗原-)结合分子或“多互补位”多肽应意指包含至少两个(即两个以上)免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中“第一”免疫球蛋白单可变结构域针对GITR并且“第二”免疫球蛋白单可变结构域针对GITR，并且其中这些“第一”和“第二”免疫球蛋白单可变结构域具有不同的互补位。因此，多互补位多肽包含两个以上针对GITR的免疫球蛋白单可变结构域或由其组成，其中至少一个“第一”免疫球蛋白单可变结构域针对GITR上的第一表位并且至少一个“第二”免疫球蛋白单可变结构域针对GITR上的第二表位，该第二表位不同于GITR上的第一表位。
在另外的方面，本发明的多肽是双互补位多肽。如本文所用的术语“双互补位”(抗原-)结合分子或“双互补位”多肽应意指这样的多肽，所述多肽包含针对GITR的“第一”免疫球蛋白单可变结构域和针对GITR的“第二”免疫球蛋白单可变结构域，其中这些“第一”和“第二”免疫球蛋白单可变结构域具有不同的互补位。因此，所述双互补位多肽包含两个以上针对GITR的免疫球蛋白单可变结构域或由其组成，其中“第一”免疫球蛋白单可变结构域针对GITR上的第一表位并且“第二”免疫球蛋白单可变结构域针对GITR上的第二表位，该第二表位不同于GITR上的第一表位。
在其它另外的方面，本发明的多肽是三互补位多肽。如本文所用的术语“三互补位”(抗原-)结合分子或“三互补位”多肽应意指这样的多肽，所述多肽包含针对GITR的“第一”免疫球蛋白单可变结构域、针对GITR的“第二”免疫球蛋白单可变结构域和针对GITR的“第三”免疫球蛋白单可变结构域，其中这些“第一”、“第二”和“第三”免疫球蛋白单可变结构域具有不同的互补位。因此，所述三互补位多肽包含三个以上针对GITR的免疫球蛋白单可变结构域或由其组成，其中“第一”免疫球蛋白单可变结构域针对GITR上的第一表位，“第二”免疫球蛋白单可变结构域针对GITR上的第二表位(该第二表位不同于GITR上的第一表位)，并且“第三”免疫球蛋白单可变结构域针对GITR上的第三表位(该第三表位不同于GITR上的第一表位和第二表位)。
存在于本发明的多价多肽中的两个以上(诸如两个、三个、四个、五个或六个)免疫球蛋白单可变结构域可以由轻链可变结构域序列(例如，VL-序列)或重链可变结构域序列(例如，VH-序列)组成；其可以由来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列或来源于重链抗体的重链可变结构域序列组成。在优选的方面，其由结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸)、单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸)、“dAb”(或适合用作dAb的氨基酸)、(包括但不限于VHH)、人源化的VHH序列、骆驼源化的VH序列；或通过亲和力成熟获得的VHH序列组成。所述两个以上免疫球蛋白单可变结构域可以由部分或完全人源化的纳米抗体或部分或完全人源化的VHH组成。在本发明优选的方面，包含在本发明的多价多肽中的免疫球蛋白单可变结构域是一个或多个如本文中所限定的本发明的单价多肽。
可以在结合测定中测量本发明的多价多肽与GITR的结合。典型的测定包括(不限于)其中将GITR暴露于细胞(诸如例如Flp-InTM-293细胞或GloResponseTMNF-κB-Nluc2P HEK293细胞)表面上的测定。用于测量本发明的多价多肽与GITR的结合的优选测定是FACS测定，诸如例如实施例中描述的FACS测定，其中确定本发明的多价多肽与Flp-InTM-293细胞和/或活化T细胞上表达的GITR的结合。由本文中的进一步描述和实施例，本发明的多肽结合GITR的一些优选EC50值将变得清楚。
在这种FACS结合测定中，本发明的多价多肽在结合人GITR方面可以具有的EC50值为10-8M以下，更优选10-9M以下，或者甚至10-10M以下，诸如10-11M。例如，在这种FACS结合测定中，本发明的多价多肽在结合人GITR方面可以具有的EC50值为10-11M至10-8M，诸如10-11M至10-10M、10-10M至10-9M或10-11M至10-10M。更特别地，包含2个以上属于家族7、26、82、85和109的单价多肽的本发明的多价多肽在结合人GITR方面可以具有的EC50值为10-11M至10-9M，诸如10-11M至10-10M。
本发明的多价多肽与GITR结合并且能够调节(即，增加、增强、刺激或加强)GITR的活性。更特别地，本发明的多肽可以增强免疫应答，诸如增强T细胞、B细胞或天然杀伤细胞的增殖或激活。
可以通过各种测定来确定T细胞、B细胞或天然杀伤细胞的增殖或激活，包括但不限于增殖测定、细胞毒性测定、细胞杀伤测定、报告基因测定(例如NF-κB荧光素酶报告分子测定)、T细胞激活测定、细胞表面受体结合测定和测量激活和细胞因子分泌的已知标志物的表达的测定，其全部是本领域中已知的。
例如，可以使用用于监测细胞因子产生的几种常规测定中的任何一种(例如，IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-2、IL-4和IL-10)作为免疫细胞激活的量度。例如，为了跟踪T细胞激活，可以采用白细胞介素-2作为标志物，其可以如Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86:1333(1989)中描述的进行测定。
还可以采用免疫荧光和流式细胞术来监测细胞因子产生，并且监测反映细胞激活状态的细胞表面标志物。许多这样的标志物是已知的，检测抗体是广泛地可商购的，并且标志物是本领域中公知的。
T细胞增殖的常用测定需要测量氚化胸苷的结合。可以通过确定结合到培养细胞的复制DNA中的3H-标记的胸苷的量来在体外测量T细胞的增殖。因此，可以量化DNA合成的速率以及细胞分裂的速率。
由本文中的进一步描述和实施例，本发明的多价多肽激活GITR的一些优选EC50值将变得清楚。
在一些实施方案中，本发明的多价多肽在利用用抗-CD3抗体OKT3刺激的活化CD4+T细胞的T细胞激活测定中增强IFN-γ产生，如实施例10中所描述的。在该T细胞激活测定中，本发明的多价多肽增强IFN-γ产生的EC50值为10-7M以下，优选10-8M以下，更优选10-9M以下、10-10M以下、或甚至10-11M以下。更特别地，包含2个以上属于家族7、26和109的单价多肽的本发明的多价多肽对增强IFN-γ产生可以具有的EC50值为10-11M至10-9M，诸如10-11M至10-10M。优选地，在该T细胞激活测定中，本发明的多价多肽以这样的EC50值增强IFN-γ产生：200pM以下，诸如小于190、180、170、160、150、140、130、120、110、100或甚至更小，诸如小于90、80、70、60、50、40或甚至更小，诸如小于30pM。
在一些实施方案中，本发明的多价多肽在NF-κB荧光素酶报告分子测定中增强核因子-κB(NF-κB)的活性，如实施例9中所描述的。NF-κB荧光素酶报告分子测定已经描述于Buillard等人,2013,J.Exp.Med.Vol.210,9:1685-1693中。由本文中的进一步描述和实施例，本发明的多肽激活GITR的一些优选EC50值将变得清楚。
NF-κB在炎症、免疫应答和细胞增殖中起到关键作用。该测定被特别设计以检测培养的细胞中NF-κB调节的信号转导途径的活性。在该NF-κB荧光素酶报告分子测定中，本发明的多价多肽以这样的EC50值增强NF-κB活性(如通过添加Nano-GloTM试剂(Promega#N1120)后的发光所测量的)：10-7M以下，优选10-8M以下，更优选10-9M以下、10-10M以下、或甚至10-11M以下。更特别地，包含2个以上属于家族7、26、38、82、85和109的单价多肽的本发明的多价多肽对增强NF-κB活性可以具有的EC50值为10-11M至10-9M，诸如10-11M至10-10M。优选地，在该NF-κB荧光素酶报告分子测定中，本发明的多价多肽以这样的EC50值增强NF-κB活性：200pM以下，诸如小于190、180、170、160、150、140、130、120、110、100或甚至更小，诸如小于90、80、70、60、50、40、35、30、25、20、18、16、15、14或甚至更小，诸如小于12pM。
可以进一步在体内模型(诸如例如在小鼠、大鼠、猪和/或灵长类动物中)评价本发明的多价多肽的治疗效果。BALB/c小鼠中的CT26模型提供了同基因体内测试系统，其常常用于开发和测试免疫治疗概念(Fearon等人,Cancer Res.48:2975-2980,1988)。例如，在如实施例13、14和21所述的同基因CT-26结肠癌模型中，本发明的多价多肽可以抑制肿瘤细胞生长。在一些实施方案中，本发明的多价多肽抑制肿瘤细胞生长、抑制或阻止肿瘤重量或体积的增加和/或使得肿瘤重量或体积减少至少5％，优选至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多，诸如100％。
本发明的化合物、构建体和/或多肽
本发明的单价多肽和本发明的多价多肽，可以或可以不进一步包含一个或多个其它基团、残基、部分或结合单元(这些单价多肽以及多价多肽(不论具有或不具有另外的基团、残基、部分或结合单元)都被称为“本发明的化合物”、“本发明的构建体”和/或“本发明的多肽”)。如果存在，此种另外的基团、残基、部分或结合单元可以为或可以不为免疫球蛋白单可变结构域(和/或免疫球蛋白单可变结构域存在于其中的多肽)提供另外的功能，并且可以改变或可以不改变免疫球蛋白单可变结构域的性质。
例如，这种另外的基团、残基、结构部分或结合单元可以是一个或多个另外的氨基酸序列，以致所述多肽是(融合)蛋白或(融合)多肽。在优选的但非限制性的方面，所述一个或多个其它基团、残基、部分或结合单元是免疫球蛋白。甚至更优选地，所述一个或多个其它基团、残基、部分或结合单元是选自由以下组成的组的免疫球蛋白单可变结构域：结构域抗体、适合用作结构域抗体的氨基酸、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的氨基酸、“dAb”、适合用作dAb的氨基酸、纳米抗体(诸如例如VHH、人源化的VHH或骆驼源化的VH序列)。
如上所述，可以连接另外的结合单元，诸如具有不同抗原特异性的免疫球蛋白单可变结构域，以形成多特异性多肽。通过将两种以上特异性的免疫球蛋白单可变结构域组合，可以形成双特异性、三特异性等构建体。例如，根据本发明的多肽可以包含一个、两个、三个、四个、五个或更多个针对GITR的免疫球蛋白单可变结构域和一个针对另一个靶标的免疫球蛋白单可变结构域。这种构建体及技术人员可以容易地预期的其改进都被如本文中所使用的术语“本发明的化合物、本发明的构建体和/或本发明的多肽”所涵盖。
在上述化合物、构建体和/或多肽中，一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个免疫球蛋白单可变结构域和一个或多个基团、残基、部分或结合单元可以彼此直接连接和/或经由一个或多个合适的接头或间隔子连接。例如，当所述一个或多个基团、残基、部分或结合单元是氨基酸序列时，接头也可以是氨基酸序列，以使所得的多肽是融合(蛋白)或融合(多肽)。
所述一个或多个另外的基团、残基、部分或结合单元可以是任何合适的和/或所需的氨基酸序列。所述另外的氨基酸序列可以或可以不转变、改变或以其他方式影响本发明的多肽的(生物学)性质，并且可以或可以不给本发明的多肽增加另外的功能性。优选地，所述另外的氨基酸序列是这样的，以致其给予本发明的多肽一种或多种所需的性质或功能性。
这种氨基酸序列的实例对于技术人员将是清楚的，并且可以通常包含在基于常规抗体及其片段(包括但不限于ScFv和单结构域抗体)的肽融合体中使用的所有氨基酸序列。例如参考Holliger和Hudson的综述(Nature Biotechnology 23:1126-1136,2005)。
例如，这种氨基酸序列可以是或可以不是这样的氨基酸序列，与本发明的多肽本身相比，所述氨基酸序列增加本发明的化合物、构建体和/或多肽的半衰期、溶解性或吸收，减少本发明的化合物、构建体和/或多肽的免疫原性或毒性，消除或减弱本发明的化合物、构建体和/或多肽的不良副作用，和/或给予本发明的化合物、构建体和/或多肽其它有利的性质和/或减少本发明的化合物、构建体和/或多肽的非所需的性质。这种氨基酸序列的一些非限制性实例是血清蛋白，诸如人血清白蛋白(参见例如WO 00/27435)或半抗原分子(例如循环的抗体所识别的半抗原，参见例如WO 98/22141)。
在本发明的一个特定方面，制备与相应的本发明的多肽相比具有增加的半衰期的多肽。包含这种延长半衰期的部分的本发明多肽的实例例如包括，但不限于，这样的多肽，其中免疫球蛋白单可变结构域适当地连接至一个或多个血清蛋白或其片段(诸如(人)血清白蛋白或其合适的片段)或一个或多个能够结合血清蛋白的结合单元(诸如例如结构域抗体、适合用作结构域抗体的氨基酸、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的氨基酸、“dAb”、适合用作dAb的氨基酸、纳米抗体、VHH序列、人源化VHH序列或骆驼源化的VH序列)，所述结合单元可以结合血清蛋白(诸如血清白蛋白(诸如人血清白蛋白))、血清免疫球蛋白(诸如IgG)、转铁蛋白或WO 04/003019中列出的其它血清蛋白之一；这样的多肽，其中免疫球蛋白单可变结构域连接至Fc部分(诸如人Fc)、抗体恒定区(诸如来自IgG的抗体恒定区)或其合适的部分或片段；或这样的多肽，其中一个或多个免疫球蛋白单可变结构域适当地连接至一个或多个能够结合血清蛋白的小蛋白或肽(诸如但不限于WO 91/01743、WO 01/45746、WO 02/076489中描述的蛋白和肽)连接的多肽。同样参考WO 03/002609和WO 04/003019中描述的dAb和Harmsen等人(Vaccine 23:4926-42,2005)；EP 0368684，以及埃博灵克斯股份有限公司的WO 08/028977、WO 08/043821、WO 08/043822以及WO 08/068280。
根据本发明的具体的但非限制性的方面，除了一个或多个针对GITR的本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽以外，本发明的多肽还可以包含至少一个针对人血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域。这些针对人血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域可以是如以上引用的埃博灵克斯股份有限公司的申请(参见例如WO 04/062551)中一般性描述的。提供增加的半衰期并且可以用于本发明的多肽的一些特别优选的纳米抗体包括WO 06/122787中公开的纳米抗体ALB-1至ALB-10(参见表II和III)(其中ALB-8(WO 06/122787中的SEQ ID NO:62)是特别优选的)，以及WO 2012/175400中公开的纳米抗体(WO 2012/175400的SEQ ID NO:1-11)和题为“改进的免疫球蛋白单可变结构域”的共同未决的美国临时申请号62/047,560(申请日：2014年9月8日；受让人：埃博灵克斯股份有限公司)中公开的具有SEQ ID NO:109的纳米抗体，以及题为“改进的血清白蛋白结合剂”的共同未决的美国临时申请号62/256,841(申请日：2015年11月18日；受让人：埃博灵克斯股份有限公司)中公开的纳米抗体(其中Alb92和Alb223是特别优选的(分别为US 62/256,841中的SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:63))。
在本发明的特别优选但非限制性方面，本发明提供这样的本发明的多肽：包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)；并且进一步包含一种以上(优选为一种)如本文所述的结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域，例如Alb11、Alb23、Alb129、Alb132、Alb8、Alb11(S112K)-A、Alb82、Alb82-A、Alb82-AA、Alb82-AAA、Alb82-G、Alb82-GG、Alb82-GGG、Alb92或Alb223(参见表A-14)。
因此，本发明的多肽可以例如是本发明的四价、双特异性多肽，其包含三个免疫球蛋白单可变结构域(优选针对GITR的本发明的单价多肽)和针对(人)血清白蛋白的第四免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体，其中所述第一、第二、第三和第四免疫球蛋白单可变结构域可以任选地经由一个或多个(并且特别是三个)接头序列连接。
根据另一个方面，一个或多个本发明的多肽可以连接至(任选地经由合适的接头或铰链区)一个或多个恒定结构域(例如，可以是用作Fc部分的一部分/形成Fc部分的2或3个恒定结构域)、连接至Fc部分、连接至IgG型的抗体恒定区、和/或连接至给予本发明的多肽一种或多种效应子功能和/或可以给予与一个或多个Fc受体结合的能力的一个或多个抗体部分、片段或结构域。例如，为此，并且不限于此，一个或多个另外的氨基酸序列可以包含一个或多个抗体的CH2和/或CH3结构域，诸如来自重链抗体(如本文中所述的)并且更优选地来自常规人4链抗体；和/或可以形成Fc区(的部分)，例如来自IgG(例如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、来自IgE或来自另一种人Ig(诸如IgA、IgD或IgM)。例如，WO 94/04678描述了包含骆驼科VHH结构域或其人源化衍生物的重链抗体(即纳米抗体)，其中骆驼科CH2和/或CH3结构域被人CH2和CH3结构域替代，从而提供由2个各自包含纳米抗体和人CH2和CH3结构域(但没有CH1结构域)的重链组成的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白具有由CH2和CH3结构域提供的效应子功能，并且所述免疫球蛋白可以在不存在任何轻链的情况下发挥功能。在本发明的更优选的方面，所述一个或多个另外的氨基酸序列可以包含一个或多个抗体的CH1、CH2、CH3和/或CL结构域或其片段，优选来自常规人4链抗体；和/或可以形成人抗体恒定区(的部分)，例如来自IgG(例如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、来自IgE或来自另一种人Ig(诸如IgA、IgD或IgM)，从而提供由以下组成的化合物或构建体(诸如纳米抗体-IgG嵌合体)：i)2个重链，其各自包含纳米抗体和人CH1、CH2和CH3重链结构域，其中CH1重链结构域与纳米抗体的C-端部分直接连接，和ii)2个轻链，其各自包含纳米抗体和人CL轻链结构域(诸如Cκ或Cλ)，其中CL轻链结构域与纳米抗体的C-端部分直接连接(参见图7)。更特别地，这种化合物或构建体是IgG型，并且包含SEQ ID NO:229、230、291和SEQ ID NO:292之一表示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:229-230和291-292中任一个具有大于80％、优选大于90％、更优选大于95％(诸如96％、97％、98％、99％或更大)序列同一性(如本文中所限定的)的氨基酸序列。
可以合适地连接至本发明的多肽从而提供效应子功能的其它氨基酸序列对于技术人员将是清楚的，并且可以基于所需的效应子功能进行选择。例如参考WO 04/058820、WO 99/42077、WO 02/056910和WO 05/017148，以及Holliger和Hudson的综述(同上)；并且参考WO 09/068628。本发明的多肽与Fc部分或抗体恒定区的偶联也可以导致与相应的本发明的多肽相比增加的半衰期。
具有增加的体内半衰期的包含一个或多个本发明的多肽和一个或多个恒定结构域的其它合适的构建体对于技术人员将是清楚的，并且可以例如包含任选地经由接头序列连接至CH3结构域的多肽。通常，任何具有增加的半衰期的融合蛋白或衍生物将优选地具有超过50kD(肾吸收的临界值)的分子量。
在另一个具体的但非限制性的方面，本发明的多肽可以连接(任选地经由合适的接头或铰链区)至天然存在的、合成的或半合成的恒定结构域(或其类似物、变体、突变体、部分或片段)，所述恒定结构域(或其类似物、变体、突变体、部分或片段)自我缔合成二聚体的倾向减弱(或基本上没有这样的倾向)(即与常规4链抗体中天然存在的恒定结构域相比)。这种单体(即不自我缔合的)Fc链变体或其片段对于技术人员将是清楚的。例如，Helm等人(J.Biol.Chem.271:7494,1996)描述了可以用于本发明的多肽链中的单体Fc链变体。
此外，这种单体Fc链变体优选是这样的，以致其仍然能够结合补体或相关Fc受体(这取决于其所来源于的Fc部分)，和/或以致其仍然具有其所来源于的Fc部分的某些或全部效应子功能(或以降低的但仍然适用于目的用途的水平)。备选地，在这种本发明的多肽链中，单体Fc链可以用于给予多肽链增加的半衰期，在所述情况中，单体Fc链也可以不具有或基本上不具有效应子功能。
通常，具有增加的半衰期的本发明的多肽的半衰期优选是相应的本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽本身的半衰期的至少1.5倍，优选至少2倍，诸如至少5倍，例如至少10倍或大于20倍。
通常，具有增加的半衰期的本发明的多肽优选地具有与相应的本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽本身相比增加大于1小时、优选大于2小时、更优选大于6小时、诸如大于12小时、或甚至大于24、48或72小时的半衰期。
在另一个优选的但非限制性的方面，这种本发明的多肽表现出在人中至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更长的血清半衰期。例如，本发明的多肽可以具有至少5天(诸如约5-10天)、优选至少9天(诸如约9-14天)、更优选至少约10天(诸如约10-15天)、或者至少约11天(诸如约11-16天)、更优选至少约12天(诸如约12-18天或更长)、或者大于14天(诸如约14-19天)的半衰期。
所述另外的氨基酸残基可以或可以不转变、改变或以其他方式影响本发明的多肽的其它(生物学)性质，并且可以或可以不给本发明的多肽增加另外的功能性。例如，这种氨基酸残基：
a)可以包含N-端Met残基，例如作为在异源宿主细胞或宿主生物中表达的结果。
b)可以形成信号序列或前导序列，所述信号序列或前导序列指引多肽在合成后自宿主细胞分泌(例如提供前-、前体-或前体前形式的本发明的多肽，这取决于用于表达本发明的多肽的宿主细胞)。合适的分泌前导肽对于技术人员将是清楚的，并且可以是如本文中进一步描述的。通常，这种前导序列将连接至多肽的N-末端，但是本发明在其最广泛的意义中不限于此；
c)可以形成“标签(tag)”，例如允许或促进纯化所述多肽的氨基酸序列或残基，例如使用针对所述序列或残基的亲和技术。之后，所述序列或残基可以被去除(例如通过化学或酶促切割)从而提供所述多肽(为此，所述标签可以任选地经由可切割的接头序列连接至氨基酸序列或多肽序列或者含有可切割的基序)。这种残基的一些优选的但非限制性的实例是多个组氨酸残基、谷胱甘肽残基和myc-标签诸如AAAEQKLISEEDLNGAA；
d)可以是一个或多个已被功能化和/或可以充当功能基团的结合位点的氨基酸残基。合适的氨基酸残基和功能基团对于技术人员将是清楚的并且包括，但不限于，本文中对于本发明的多肽的衍生物所提及的氨基酸残基和功能基团。
本发明的多价多肽通常通常可以通过这样的方法制备，所述方法至少包括以下步骤：将本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽合适地连接至一个或多个另外的本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽(任选地经由一个或多个合适的接头)，从而提供本发明的多价多肽。本发明的多肽还可以通过这样的方法制备，所述方法通常至少包括以下步骤：提供编码本发明的多肽的核酸，以合适的方式表达所述核酸，并且回收表达的本发明的多肽。这种方法可以以本身已知的方式进行，其对于技术人员将是清楚的，例如基于本文中进一步描述的方法和技术。
用于制备本发明的多价多肽的方法可以至少包括以下步骤：以合适的方式将两个以上本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽和例如一个或多个接头连接在一起。本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽(以及接头)可以通过本领域中已知的和如本文中进一步描述的任何方法偶联。优选的技术包括将编码本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽(以及接头)的核酸序列连接以制备表达多价多肽的遗传构建体。用于连接氨基酸或核酸的技术对于技术人员将是清楚的，并且还可以参考标准手册，诸如以上提及的Sambrook等人和Ausubel等人，以及如下实施例。
因此，本发明还涉及本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽在制备本发明的多价多肽中的用途。用于制备多价多肽的方法将包括将本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽连接至至少一个另外的本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽(任选地经由一个或多个接头)。然后，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽被用作结合结构域或结合单元从而提供和/或制备包含两个(例如，在二价多肽中)、三个(例如，在三价多肽中)、四个(例如，在四价多肽中)、五个(例如，在五价多肽中)、六个(例如，在六价多肽中)或更多个(例如，在多价多肽中)结合单元的多价多肽。在这方面，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽可以被用作结合结构域或结合单元以提供和/或制备包含两个、三个、四个、五个、六个或更多个结合单元的本发明的多价(诸如二价、三价、四价、五价或六价)多肽。
因此，本发明还涉及本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或特别是单价多肽(如本文中所述的)在制备多价多肽中的用途。用于制备多价多肽的方法将包括将本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽连接至至少一个另外的本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或单价多肽(任选地经由一个或多个接头)。
适用于本发明的多价多肽的间隔区或接头对于技术人员将是清楚的，并且可以通常是本领域中用于连接氨基酸序列的任何接头或间隔区。优选地，所述接头或间隔区适用于构建预期用于药物用途的多肽。
一些特别优选的间隔区包括本领域中用于连接抗体片段或抗体结构域的间隔区和接头。这些包括以上引用的一般性背景技术中提及的接头，以及例如本领域中用于构建双抗体或ScFv片段的接头(然而，就这一点，应当注意的是，虽然在双抗体和ScFv片段中，使用的接头序列应该具有允许相关VH和VL结构域一起形成完整的抗原-结合位点的长度、柔性程度和其他性质，但是对用于本发明的多肽的接头的长度或柔性没有特别的限制，因为各免疫球蛋白单可变结构域本身形成完整的抗原-结合位点)。
例如，接头可以是合适的氨基酸序列，并且特别是1至50个、优选1至30个、诸如1至10个氨基酸残基的氨基酸序列。这样的氨基酸序列的一些优选的实例包括gly-ser接头，例如如WO 99/42077中所述的类型(glyxsery)z(诸如例如(gly4ser)3或(gly3ser2)3)的接头，铰链样区域，诸如天然存在的重链抗体或类似序列的铰链区(诸如WO 94/04678中所述的)。
一些其它特别优选的接头在表A-15中提及，其中GS9(SEQ ID NO:251)是特别优选的。
其它合适的接头通常包括有机化合物或聚合物，特别是适用于用于药物用途的蛋白的那些。例如，聚(乙二醇)部分已经被用于连接抗体结构域，参见例如WO 04/081026。
包括在本发明的范围内的是，使用的一个或多个接头的长度、柔性程度和/或其他性质(但并不是关键的，因为其通常用于在ScFv片段中使用的接头)可以对最终的本发明的多肽的性质(包括但不限于对GITR、或对一种或多种其他抗原的亲和力、特异性或亲合力)具有一些影响。基于本文中的公开内容，任选地在一些有限的常规实验后，技术人员将能够确定用于特定的本发明的多肽的一个或多个最佳接头。
还在本发明的范围内的是，使用的一个或多个接头给予本发明的多肽一种或多种其他有利的性质或功能性，和/或提供一个或多个用于形成衍生物和/或用于连接功能基团的位点(例如，如本文中对于本发明的多肽的衍生物所述的)。例如，含有一个或多个带电荷的氨基酸残基的接头可以提供改善的亲水性质，而形成或含有小的表位或标签的接头可以用于检测、鉴定和/或纯化的目的。再次，基于本文中的公开内容，任选地在一些有限的常规实验后，技术人员将能够确定用于特定的本发明的多肽的最佳接头。
最后，当两个以上接头用于本发明的多肽时，这些接头可以是相同的或不同的。再次，基于本文中的公开内容，任选地在一些有限的常规实验后，技术人员将能够确定用于特定的本发明的多肽的最佳接头。
通常，为了易于表达和制备，本发明的多肽将是线性多肽。然而，在其最广泛的意义上，本发明不限于此。例如，当本发明的多肽包含三个以上氨基酸序列或纳米抗体时，可能通过使用具有三个以上“臂”的接头将它们连接，每个“臂”被连接至氨基酸序列或纳米抗体，从而提供“星形”构建体。尽管通常不是优选的，但是还可能使用环形构建体。
本发明还涵盖包含本发明的免疫球蛋白或多肽并且还包含标签或其他功能部分(例如，毒素、标记、放射性化学品等)的化合物、构建体和/或多肽。
备选地，所述另外的基团、残基、部分或结合单元可以例如是化学基团、残基、部分，其本身可以具有或不具有生物学和/或药理学活性。例如，并且不受限制地，这种基团可以与一个或多个本发明的免疫球蛋白单可变结构域或单价多肽连接以提供本发明的多肽的“衍生物”。
因此，本发明在其最广泛的意义上也包括作为本发明的多肽的衍生物的化合物、构建体和/或多肽。这种衍生物通常可以通过修饰，并且特别是通过化学和/或生物学(例如，酶促)修饰本发明的多肽和/或修饰形成本发明的多肽的氨基酸残基中的一个或多个来获得。
这种修饰的实例，以及多肽序列内可以以这种方式修饰的氨基酸残基(即，在蛋白主链上，但是优选地在侧链上)的实例，可以用于引入这种修饰的方法和技术和这种修饰的潜在用途和优势对于技术人员将是清楚的(也参见Zangi等人,Nat Biotechnol 31(10):898-907,2013)。
例如，这种修饰可以包括(例如，通过共价连接或以任何其它合适的方式)将一个或多个功能基团、残基或部分引入到本发明的多肽中或本发明的多肽上，并且特别是引入一个或多个给予本发明的多肽一种或多种所需的性质或功能性的功能基团、残基或部分。这种功能基团的实例对于技术人员将是清楚的。
例如，这种修饰可以包括引入(例如，通过共价连接或以任何其他合适的方式)一个或多个功能基团，所述功能基团增加本发明的多肽的半衰期、溶解性和/或吸收，降低本发明的多肽的免疫原性和/或毒性，消除或减弱本发明的多肽的任何非所需的副作用，和/或给予本发明的多肽其它有利的性质和/或减小本发明的多肽的非所需的性质；或上述中的两项或更多项的任意组合。这种功能基团和用于将其引入的技术的实例对于技术人员将是清楚的，并且通常可以包括上文中引用的一般背景技术中提及的所有功能基团和技术以及本身已知用于修饰药物蛋白的功能基团和技术，并且特别是本身已知用于修饰抗体或抗体片段(包括ScFv和单结构域抗体)的功能基团和技术，关于其可例如参考Remington(Pharmaceutical Sciences,第16版,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1980)。这种功能基团可以例如直接(例如共价地)连接至本发明的多肽，或任选地经由合适的接头或间隔物连接至本发明的多肽，如同样对技术人员是清楚的。
一个具体实例是衍生的本发明的多肽，其中本发明的多肽被化学修饰以增加其半衰期(例如，通过PEG化)。这是一种被最广泛地用于增加药物蛋白的半衰期和/或减少其免疫原性的技术并且包括连接合适的药用聚合物，如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(诸如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。通常，可以使用任何合适形式的PEG化，诸如本领域中用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv)的PEG化；参考例如Chapman(Nat.Biotechnol.54:531-545,2002)、Veronese和Harris(Adv.Drug Deliv.Rev.54:453-456,2003)、Harris和Chess(Nat.Rev.Drug.Discov.2:214-221,2003)以及WO 04/060965。多种用于蛋白PEG化的试剂也是可商购的，例如购自Nektar Therapeutics,USA。
优选地，使用定点PEG化，特别是经由半胱氨酸-残基(参见例如Yang等人(Protein Engineering 16:761-770,2003)。例如，为此，可以将PEG连接至本发明的多肽中天然存在的半胱氨酸残基，本发明的多肽可以被修饰从而合适地引入一个或多个用于连接PEG的半胱氨酸残基，或包含一个或多个用于连接PEG的半胱氨酸残基的氨基酸序列可以被融合至本发明的多肽的N-末端和/或C-末端，全部使用本身为技术人员所知的蛋白工程改造技术。
优选地，对于本发明的多肽，使用分子量大于5000道尔顿、诸如大于10,000且小于200,000、诸如小于100,000；例如范围为20,000-80,000道尔顿的PEG。
另一种通常较不优选的修饰包括N-连接的或O-连接的糖基化，通常是作为共翻译和/或翻译后修饰的一部分，这取决于用于表达本发明的多肽的宿主细胞。
另一种修饰可以包括引入一种或多种可检测的标记或其它信号生成基团或部分，这取决于标记的本发明的多肽的目的用途。合适的标记和用于连接、使用和检测其的技术对于技术人员将是清楚的，并且例如包括，但不限于，荧光标记(诸如荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、和荧光胺以及荧光金属如152Eu或其它镧系金属)，磷光标记，化学发光标记或生物发光标记(诸如鲁米那(luminal)、异鲁米诺(isoluminol)、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐、草酸酯、二氧杂环丁烷或GFP及其类似物)，放射性同位素(诸如3H、125I、32P、35S、14C、51Cr、36Cl、57Co、58Co、59Fe和75Se)，金属、金属螯合物或金属阳离子(例如金属阳离子如99mTc、123I、111In、131I、97Ru、67Cu、67Ga和68Ga或特别适用于体内、体外或原位诊断和成像的其它金属或金属阳离子，诸如(157Gd、55Mn、162Dy、52Cr和56Fe))，以及发色团和酶(诸如苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-甾体异构酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、生物素亲和素过氧化物酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶)。其它合适的标记对于技术人员将是清楚的，并且例如包括可以使用NMR或ESR光谱学检测的部分。
这种标记的本发明的多肽可以例如用于体外、体内或原位测定(包括本身已知的免疫测定，诸如ELISA、RIA、EIA和其它“夹心测定”等)以及体内诊断和成像用途，这取决于具体标记的选择。
如对于技术人员是清楚的，另一种修饰可以包括引入螯合基团，例如从而螯合以上提及的一种金属或金属阳离子。合适的螯合基团例如包括但不限于，二乙三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
另一种修饰可以包括引入作为特定的结合对(诸如生物素-(链霉)亲和素结合对)的一部分的功能基团。这种功能基团可以用于将本发明的多肽连接至与所述结合对的另一半结合的另一种蛋白、多肽或化学化合物(即通过形成结合对)。例如，本发明的多肽可以缀合至生物素，并且连接至与亲和素或链霉亲和素缀合的另一种蛋白、多肽、化合物或载体。例如，这种缀合的本发明的多肽可以用作例如诊断系统中的报告物，在所述系统中可检测的信号产生剂被缀合至亲和素或链霉亲和素。这种结合对也可以例如用于将本发明的多肽与载体结合，所述载体包括适用于药物用途的载体。一个非限制性实例是由Cao和Suresh描述的脂质体制剂(Journal of Drug Targeting 8:257,2000)。这种结合对也可以用于将治疗活性剂连接至本发明的多肽。
其它可能的化学和酶促修饰对于技术人员将是清楚的。也可以引入这种修饰以用于研究目的(例如为了研究功能-活性关系)。例如参考Lundblad和Bradshaw(Biotechnol.Appl.Biochem.26:143-151,1997)。
优选地，所述化合物、构建体、多肽和/或衍生物是这样的，以致其以如本文中所限定的(即如对于本发明的多肽所限定的)亲和力(合适地测量和/或表示为KD-值(实际或表观)、KA-值(实际或表观)、kon-速率和/或koff-速率，或备选地IC50值，如本文中进一步描述的)与GITR结合。这种衍生物通常也将具有如本文中所限定的GITR功效和/或效力。
这种本发明的化合物、构建体和/或多肽及其衍生物也可以处于基本上分离的形式(如本文中限定的)。
本发明还涉及用于制备本文中所述的化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞和组合物的方法。
本发明的多肽和核酸可以以本身已知的方式制备，如由本文中的进一步描述对技术人员将是清楚的。例如，本发明的多肽可以以本身已知的用于制备抗体并且特别是用于制备抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的任何方式制备。一些优选的但非限制性的用于制备多肽和核酸的方法包括本文中描述的方法和技术。
用于制备本发明的多肽的方法可以包括以下步骤：
-在合适的宿主细胞或宿主生物体(在本文中也被称为“本发明的宿主”)中或在另一种合适的表达系统中表达编码所述本发明的多肽的核酸(在本文中也被称为“本发明的核酸”)，
任选地，随后是：
-分离和/或纯化由此获得的本发明的多肽。
特别地，这种方法可以包括以下步骤：
-在使得本发明的宿主表达和/或产生至少一种本发明的多肽的条件下培养和/或维持所述本发明的宿主；
任选地，随后是：
-分离和/或纯化由此获得的本发明的多肽。
因此，本发明还涉及编码本发明的多肽的核酸或核苷酸序列(也被称为“本发明的核酸”)。本发明的核酸可以是单链或双链DNA或RNA的形式，并且优选是双链DNA的形式。例如，本发明的核苷酸序列可以是基因组DNA、cDNA或合成的DNA(诸如具有已经专门适用于在目标宿主细胞或宿主生物体中表达的密码子使用的DNA)。
根据本发明的一个实施方案，本发明的核酸处于基本上分离的形式，如本文中所限定的。本发明的核酸还可以是载体的形式、存在于载体中和/或作为载体的一部分，所述载体诸如例如质粒、粘粒或YAC，其也可以处于基本上分离的形式。
基于本文中给出的关于本发明的多肽的信息，本发明的核酸可以以本身已知的方式制备或获得，和/或可以从合适的天然来源分离。同样，如技术人员将清楚的，为了制备本发明的核酸，还可以以合适的方式将若干核苷酸序列(诸如至少两个编码本发明的免疫球蛋白单可变结构域或单价多肽的核苷酸序列)和例如编码一个或多个接头的核酸连接在一起。
用于产生本发明的核酸的技术对于技术人员将是清楚的，并且可以例如包括但不限于自动化DNA合成；定点诱变；组合两个以上天然存在的和/或合成的序列(或其两个以上部分)，引入导致截短的表达产物表达的突变；引入一个或多个限制性酶切位点(例如以产生可以使用合适的限制内切酶可以容易地消化和/或连接的盒和/或区域)，和/或使用一个或多个“错配”引物通过PCR反应引入突变。这些和其它技术对于技术人员将是清楚的，并且还可以参考标准手册，诸如以上提及的Sambrook等人和Ausubel等人，以及以下实施例。
本发明的核酸还可以是遗传构建体的形式、存在于遗传构建体中和/或作为遗传构建体的一部分，如对于本领域技术人员将清楚的。这种遗传构建体通常包含至少一种本发明的核酸，所述核酸任选地连接至本身已知的遗传构建体的一个或多个元件，诸如例如一个或多个合适的调控元件(诸如合适的启动子、增强子、终止子等)和本文中提及的遗传构建体的其它元件。包含至少一种本发明的核酸的这种遗传构建体在本文中也被称为“本发明的遗传构建体”。
本发明的遗传构建体可以是DNA或RNA，并且优选是双链DNA。本发明的遗传构建体还可以是适合于转化目标宿主细胞或宿主生物体的形式，适合于整合到目标宿主细胞的基因组DNA中的形式，或适合于目标宿主生物体中的独立复制、维持和/或遗传的形式。例如，本发明的遗传构建体可以是载体的形式，所述载体诸如例如质粒、粘粒、YAC、病毒载体或转座子。特别地，载体可以是表达载体，即可以提供体外和/或体内表达(例如在合适的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中)的载体。
在优选的但非限制性的实施方案中，本发明的遗传构建体包含
a)至少一个本发明的核酸；所述核酸被可操作地连接至
b)一个或多个调控元件，诸如启动子和任选地合适的终止子；
以及还任选地
c)本身已知的遗传构建体的一个或多个另外的元件；
其中术语“调控元件”、“启动子”、“终止子”和“可操作地连接”具有其在本领域中的通常含义(如本文中进一步所描述的)：并且其中存在于遗传构建体中的所述“另外的元件”可以例如是3’-或5’-UTR序列、前导序列、选择标志物、表达标志物/报告基因、和/或可以促进或增加转化或整合(的效率)的元件。用于这种基因构建体的这些和其它合适的元件对于技术人员将是清楚的，并且可以例如取决于所使用的构建体的类型；目标宿主细胞或宿主生物体；表达目标的本发明的核苷酸序列的方式(例如通过组成型、瞬时或诱导表达)：和/或要使用的转化技术。例如，本身已知用于表达和生产抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的调控序列、启动子和终止子可以以基本上类似的方式使用。
优选地，在本发明的遗传构建体中，所述至少一个本发明的核酸和所述调节元件，以及任选地所述一个或多个另外的元件彼此“可操作地连接”，其通常意指它们彼此具有功能性关系。例如，如果所述启动子能够启动或以其它方式控制/调节编码序列的转录和/或表达(其中所述编码序列应该被理解为“在”所述启动子的“控制下”)，则认为所述启动子与所述编码序列“可操作地连接”。通常，当两个核苷酸序列可操作地连接时，它们将处于相同的取向并且通常也处于相同的阅读框中。它们通常也将是基本上连续的，但是这也可以不是必须的。
优选地，本发明的遗传构建体的调控和另外的元件是这样的，以致其能够在目标宿主细胞或宿主生物体中提供其目标生物学功能。
例如，启动子、增强子或终止子在目标宿主细胞或宿主生物体中应当是“可操作的”，“可操作的”表示(例如)所述启动子应当能够启动或以其它方式控制/调节与其可操作地连接的(如本文中限定的)核苷酸序列(例如，编码序列)的转录和/或表达。
一些特别优选的启动子包括，但不限于，本身已知用于在本文中提及的宿主细胞中表达的启动子；并且特别是用于在细菌细胞中表达的启动子，诸如本文中提及的那些和/或实施例中使用的那些启动子。
选择标志物应当是这样的，以致其允许-即在适当的选择条件下-已经将(成功地)转化有本发明的核苷酸序列的宿主细胞和/或宿主生物体与未被(成功地)转化的宿主细胞/生物体相区别。这种标志物的一些优选的但非限制性的实例是提供针对抗生素(诸如卡那霉素或氨苄青霉素)的抗性的基因，提供温度抗性的基因，或允许宿主细胞或宿主生物体在培养基中不存在对于未转化的细胞或生物体的存活必要的某些因素、化合物和/或(食物)组分的情况下得以维持的基因。
前导序列应当是这样的，以致-在目标宿主细胞或宿主生物体中-其允许所需的翻译后修饰和/或使得其将转录的mRNA指引向细胞的所需部分或细胞器。前导序列也可以允许表达产物自所述细胞分泌。同样地，前导序列可以是在宿主细胞或宿主生物体中可操作的任何前体-(pro-)、前-(pre-)或前体前-(prepro-)序列。对于细菌细胞中的表达可以不需要前导序列。例如，本身已知用于表达和制备抗体和抗体片段(包括但不限于单结构域抗体和ScFv片段)的前导序列可以以基本上类似的方式使用。
表达标志物或报告基因应当是这样的，以致-在宿主细胞或宿主生物体中-其允许检测遗传构建体(上存在的基因或核苷酸序列)的表达。表达标志物可以任选地还允许定位表达的产物，例如，在细胞的特定部分或细胞器中和/或在多细胞生物体的特定细胞、组织、器官或部分中。这种报告基因也可以被表达为与本发明的氨基酸序列或多肽融合的蛋白。一些优选的但非限制性的实例包括荧光蛋白，诸如GFP。
合适的启动子、终止子和另外的元件的一些优选的但非限制性的实例包括可以用于在本文中提及的宿主细胞中表达的那些；并且特别是适合用于在细菌细胞中表达的那些，诸如本文中提及的那些和/或以下实施例中使用的那些。对于可以存在于/用于本发明的遗传构建体中的启动子、选择标志物、前导序列、表达标志物和另外的元件的一些(另外的)非限制性实例-诸如终止子、转录和/或翻译增强子和/或整合因子-参考一般手册，诸如以上提及的Sambrook等人和Ausubel等人，以及WO 95/07463、WO 96/23810、WO 95/07463、WO 95/21191、WO 97/11094、WO 97/42320、WO 98/06737、WO 98/21355、US 7,207,410、US 5,693,492和EP 1085089中给出的实例。其它实例对于技术人员将是清楚的。同样参考以上引用的一般性背景技术和本文中引用的其它文献。
本发明的遗传构建体通常可以通过合适地将本发明的核苷酸序列连接至一个或多个以上描述的另外的元件来提供，例如使用一般手册如以上提及的Sambrook等人和Ausubel等人中描述的技术来提供。
通常，本发明的遗传构建体将通过将本发明的核苷酸序列插入在本身已知的合适的(表达)载体中来获得。合适的表达载体的一些优选的但非限制性的实例是以下实施例中使用的那些，以及本文中提及的那些。
本发明的核酸和/或本发明的遗传构建体可以用于转化宿主细胞或宿主生物体，即用于表达和/或制备本发明的多肽。合适的宿主或宿主细胞对于技术人员将是清楚的，并且可以是例如任何合适的真菌、原核或真核细胞或细胞系或任何合适的真菌、原核或(非人)真核生物体，例如：
-细菌菌株，包括但不限于革兰氏阴性菌株，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)的菌株；变形杆菌属(Proteus)的菌株，例如奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)；假单胞菌属(Pseudomonas)的菌株，例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)；和革兰氏阳性菌株，诸如芽胞杆菌属(Bacillus)的菌株，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的菌株；链霉菌属(Streptomyces)的菌株，例如变青链霉菌(Streptomyces lividans)；葡萄球菌属(Staphylococcus)的菌株，例如肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)的菌株；和乳球菌属(Lactococcus)的菌株，例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的菌株；
-真菌细胞，包括但不限于来自木霉属(Trichoderma)种属的细胞，例如来自里氏木霉(Trichoderma reesei)；来自链孢霉属(Neurospora)种属的细胞，例如来自粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；来自粪壳属(Sordaria)种属的细胞，例如来自大孢粪壳(Sordaria macrospora)；来自曲霉属(Aspergillus)种属的细胞，例如来自黑曲霉(Aspergillus niger)或来自酱油曲霉(Aspergillus sojae)；或来自其它丝状真菌；
-酵母细胞，包括但不限于来自酵母属(Saccharomyces)种属的细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的细胞；来自裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)种属的细胞，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的细胞；来自毕赤酵母属(Pichia)种属的细胞，例如毕赤酵母(Pichia pastoris)或甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)的细胞；来自汉逊酵母属(Hansenula)种属的细胞，例如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)的细胞；来自克鲁维酵母属(Kluyveromyces)种属的细胞，例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的细胞；来自Arxula种属的细胞，例如Arxula adeninivorans的细胞；来自耶氏酵母属(Yarrowia)种属的细胞，例如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的细胞；
-两栖动物细胞或细胞系，诸如爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)；
-来源于昆虫的细胞或细胞系，诸如来源于鳞翅目的细胞/细胞系，包括但不限于夜蛾属(Spodoptera)SF9和Sf21细胞或来源于果蝇属(Drosophila)的细胞/细胞系，诸如Schneider和Kc细胞；
-植物或植物细胞，例如在烟草植物中的；和/或
-哺乳动物细胞或细胞系，例如来源于人的细胞或细胞系，来自哺乳动物的细胞或细胞系，包括但不限于CHO-细胞(例如CHO-K1细胞)、BHK-细胞和人细胞或细胞系诸如HeLa、COS、Caki和HEK293H细胞；
以及本身已知的用于表达和制备抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的所有其它宿主细胞或(非人)宿主，这对于技术人员将是清楚的。同样参考上文中引用的一般背景领域，以及例如WO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken等人(Res Immunol.149:589-99,1998)；Riechmann和Muyldermans(1999),同上；van der Linden(J.Biotechnol.80:261-70,2000)；Joosten等人(Microb.Cell Fact.2:1,2003)；Joosten等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.66:384-92,2005)；以及本文中引用的其它文献。
还可以将本发明的多肽表达为所谓的“胞内抗体”，如例如WO 94/02610、WO 95/22618和US 7,004,940；WO 03/014960；在Cattaneo和Biocca(“Intracellular Antibodies:Development and Applications”Landes and Springer-Verlag,1997)；和在Kontermann(Methods 34:163-170,2004)中所描述的。
本发明的多肽也可以例如在转基因哺乳动物的乳汁中产生，例如在兔、牛、山羊或绵羊的乳汁中产生(对于用于将转基因引入哺乳动物的一般技术，参见例如US 6,741,957、US 6,304,489和US 6,849,992)，在植物或植物的部分(包括但不限于其叶、花、果实、种子、根或块茎)中(例如在烟草、玉米、大豆或苜蓿中)产生或在例如家蚕(Bombix mori)的蛹中产生。
此外，本发明的多肽也可以在无细胞表达系统中表达和/或制备，并且这种系统的合适的实例对于技术人员将是清楚的。一些优选的但非限制性的实例包括在小麦胚芽系统中表达；在兔网织红细胞裂解物中表达；或在大肠杆菌Zubay系统中表达。
优选地，在本发明中，使用(体内或体外)表达系统，诸如细菌表达系统，所述表达系统提供适用于药物用途的形式的本发明的多肽，并且这种表达系统对于技术人员同样是清楚的。如同样对于技术人员是清楚的，适用于药物用途的本发明的多肽可以使用用于肽合成的技术制备。
为了以工业规模生产，优选的用于(工业)制备免疫球蛋白单可变结构域或含免疫球蛋白单可变结构域的多肽治疗剂的异源宿主包括适用于大规模表达/生产/发酵(并且特别是用于大规模药物表达/生产/发酵)的大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母的菌株。这种菌株的合适的实例对于技术人员将是清楚的。这种菌株和制备/表达系统也可获自公司如Biovitrum(Uppsala,Sweden)。
备选地，哺乳动物细胞系，特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，可以用于大规模表达/生产/发酵，并且特别是用于大规模药物表达/生产/发酵。同样这种表达/制备系统可以获自以上提及的一些公司。
具体表达系统的选择将部分取决于对于特定翻译后修饰(更特别是糖基化)的需要。制备想要或需要糖基化的含免疫球蛋白单可变结构域的重组蛋白将需要使用能够将表达的蛋白糖基化的哺乳动物表达宿主。在这方面，对于技术人员清楚的是，获得的糖基化模式(即，连接的残基的种类、数量和位置)将取决于用于表达的细胞或细胞系。优选地，使用人细胞或细胞系(即，产生基本上具有人糖基化模式的蛋白)或使用另一种可以提供基本上和/或在功能性上与人糖基化相同的糖基化模式或至少模仿人糖基化的哺乳动物细胞系。通常，原核宿主诸如大肠杆菌不能够将蛋白糖基化，并且使用低等真核生物诸如酵母通常导致与人糖基化不同的糖基化模式。然而，应当理解的是，所有前述宿主细胞和表达系统都可以用于本发明，这取决于所要获得的多肽。
因此，根据本发明的一个非限制性实施方案，本发明的多肽是糖基化的。根据本发明的另一个非限制性实施方案，本发明的多肽是非糖基化的。
根据本发明的一个优选的但非限制性的实施方案，本发明的多肽在细菌细胞、特别是适用于大规模药物生产的细菌细胞(诸如以上提及的菌株的细胞)中制备。
根据本发明的另一个优选的但非限制性的实施方案，本发明的多肽在酵母细胞、特别是适用于大规模药物生产的酵母细胞(诸如以上提及的种属的细胞)中制备。
根据本发明的又一个优选的但非限制性的实施方案，本发明的多肽在哺乳动物细胞中制备，特别是在人细胞中或在人细胞系的细胞中制备，并且更特别是在适用于大规模药物生产的人细胞或人细胞系的细胞(诸如上文中提及的细胞系)中制备。
当使用宿主细胞中的表达来制备本发明的多肽时，本发明的多肽可以在细胞内(例如，在细胞溶质中，在周质中或在包涵体中)制备，然后从宿主细胞分离并任选地被进一步纯化；或者可以在细胞外(例如，在培养宿主细胞的培养基中)制备，然后从培养基分离并任选地被进一步纯化。当使用真核宿主细胞时，胞外制备通常是优选的，因为这相当有利于获得的多肽的进一步分离和下游加工。细菌细胞，诸如以上提及的大肠杆菌的菌株，通常不将蛋白分泌到细胞外，除了少数几类蛋白如毒素和溶血素以外，并且大肠杆菌中的分泌制备是指将蛋白跨内膜转运至周质空间。相对于细胞溶质制备，周质制备提供若干优点。例如，在通过特定信号肽酶切割分泌信号序列后，分泌的产物的N-端氨基酸序列可以与天然基因产物相同。并且，周质中的蛋白酶活性似乎比细胞溶质中小得多。此外，由于周质中较少的污染蛋白，蛋白纯化更简单。另一个优点是，因为与细胞溶质相比，周质提供更为氧化性的环境，所以可以形成正确的二硫键。大肠杆菌中过表达的蛋白通常在不可溶的聚集体(所谓的包涵体)中被发现。这些包涵体可以位于细胞溶质中或周质中；具有生物学活性的蛋白自这些包涵体恢复需要变性/再折叠过程。许多重组蛋白，包括治疗性蛋白，恢复自包涵体。备选地，如对技术人员是清楚的，可以使用已经被基因修饰以分泌所需蛋白并且特别是本发明的多肽的重组细菌菌株。
因此，根据本发明的一个非限制性实施方案，本发明的多肽是这样的多肽，所述多肽在细胞内制备并且分离自宿主细胞，并且特别是分离自细菌细胞或细菌细胞中的包涵体。根据本发明的另一个非限制性实施方案，本发明的多肽是这样的多肽，所述多肽在细胞外制备，并且分离自培养宿主细胞的培养基。
用于与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的启动子包括：
-用于在大肠杆菌中表达：lac启动子(及其衍生物，诸如lacUV5启动子)；阿拉伯糖启动子；噬菌体λ的左向(PL)和右向(PR)启动子；trp操纵子的启动子；杂合lac/trp启动子(tac和trc)；T7-启动子(更具体地是T7-噬菌体基因10的启动子)和其它T-噬菌体启动子；Tn10四环霉素抗性基因的启动子；包含外源调控操作子序列的一个或多个拷贝的以上启动子的工程改造的变体；
-用于在酿酒酵母中表达：组成型：ADH1(醇脱氢酶1)、ENO(烯醇酶)、CYC1(细胞色素c iso-1)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、PGK1(磷酸甘油酸激酶)、PYK1(丙酮酸激酶)；调节型：GAL1、10、7(半乳糖代谢酶)、ADH2(醇脱氢酶2)、PHO5(酸式磷酸酶)、CUP1(铜金属硫蛋白)；异源的：CaMV(花椰菜花叶病毒35S启动子)；
-用于在毕赤酵母中表达：AOX1启动子(醇氧化酶I)；
-用于在哺乳动物细胞中表达：人巨细胞病毒(hCMV)立即早期增强子/启动子；含两个四环素操作子序列以使启动子可以被Tet抑制子调控的人巨细胞病毒(hCMV)立即早期启动子变体；单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)启动子；劳氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)长末端重复(RSV LTR)增强子/启动子；来自人、黑猩猩、小鼠或大鼠的延伸因子1α(hEF-1α)启动子；SV40早期启动子；HIV-1长末端重复启动子；β-肌动蛋白启动子；
用于与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的载体包括：
-用于在哺乳动物细胞中表达的载体：pMAMneo(Clontech)、pcDNA3(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2-neo(ATCC 37593)、pBPV-1(8-2)(ATCC 37110)、pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC 37224)、pRSVgpt(ATCC37199)、pRSVneo(ATCC37198)、pSV2-dhfr(ATCC 37146)、pUCTag(ATCC 37460)和1ZD35(ATCC 37565)，以及基于病毒的表达系统，诸如基于腺病毒的那些；
-用于在细菌细胞中表达的载体：pET载体(Novagen)和pQE载体(Qiagen)；
-用于在酵母或其它真菌细胞中表达的载体：pYES2(Invitrogen)和Pichia表达载体(Invitrogen)；
-用于在昆虫细胞中表达的载体：pBlueBacII(Invitrogen)和其它杆状病毒载体
-用于在植物或植物细胞中表达的载体：例如基于花椰菜花叶病毒或烟草花叶病毒的载体，农杆菌的合适的菌株，或基于Ti-质粒的载体。
用于与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的分泌序列包括：
-用于细菌细胞诸如大肠杆菌：PelB、Bla、OmpA、OmpC、OmpF、OmpT、StII、PhoA、PhoE、MalE、Lpp、LamB等；TAT信号肽、溶血素C-端分泌信号；
-用于酵母：α-配对因子前体前-序列、磷酸酶(pho1)、转化酶(Suc)等；
-用于哺乳动物细胞：固有信号(在靶蛋白为真核来源的情况下)；鼠Igκ-链V-J2-C信号肽；等等。
适用于转化本发明的宿主或宿主细胞的技术对于技术人员将是清楚的，并且可以取决于目标宿主细胞/宿主生物体和要使用的遗传构建体。再次参考以上提及的手册和专利申请。
转化后，可以进行用于检测和选择已经成功转化有本发明的核苷酸序列/遗传构建体的那些宿主细胞或宿主生物体的步骤。这可以例如是基于存在于本发明的遗传构建体中的可选择标记的选择步骤，或涉及例如使用特定抗体检测本发明的多肽的步骤。
转化的宿主细胞(其可以是稳定的细胞系的形式)或宿主生物体(其可以是稳定的突变体系或株系的形式)形成本发明的另外的方面。
优选地，这些宿主细胞或宿主生物体使得它们表达或者(至少)能够表达(例如在合适的条件下)本发明的多肽(并且在宿主生物的情况下：在其至少一个细胞、部分、组织或器官中)。本发明还包括本发明的宿主细胞或宿主生物体的子代、后裔和/或后代，其可以例如通过细胞分裂或通过有性或无性繁殖获得。
为了制备/获得本发明的多肽的表达，通常可以将转化的宿主细胞或转化的宿主生物体在使得(所需的)本发明的多肽表达/产生的条件下保持、维持和/或培养。合适的条件对于技术人员将是清楚的，并且通常将取决于所使用的宿主细胞/宿主生物体，以及控制本发明的(相关)核苷酸序列的表达的调控元件。再次参考在以上关于本发明的遗传构建体的段落中提及的手册和专利申请。
通常，合适的条件可以包括使用合适的培养基，存在合适的食物来源和/或合适的营养物，使用合适的温度，并且任选地存在合适的诱导因子或化合物(例如当本发明的核苷酸序列在诱导型启动子的控制下时)；所有这些都是可以由技术人员选择的。同样，在这样的条件下，本发明的多肽可以以组成型方式表达，以瞬时方式表达，或者仅当被合适地诱导时表达。
同样对于技术人员将是清楚的是，本发明的多肽可以(首先)以未成熟的形式产生(如以上所提及的)，然后可以对所述未成熟的形式进行翻译后修饰，这取决于所使用的宿主细胞/宿主生物体。同样，本发明的多肽可以是糖基化的，这同样取决于所使用的宿主细胞/宿主生物体。
然后可以使用本身已知的蛋白质分离和/或纯化技术，诸如(制备型)色谱和/或电泳技术、示差沉淀技术、亲和技术(例如，使用与本发明的多肽融合的特定的可切割的氨基酸序列)和/或制备型免疫技术(即，使用针对待分离的多肽的抗体)，将本发明的多肽从宿主细胞/宿主生物体和/或从其中培养所述宿主细胞或宿主生物体的培养基中分离。
本发明的组合物
通常，对于药物用途，本发明的多肽、化合物和/或构建体可以配制成药物制剂或组合物，所述药物制剂或组合物包含至少一种本发明的多肽、化合物和/或构建体和至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或辅剂，以及任选地一种或多种另外的具有药物活性的多肽和/或化合物。作为非限制性实例，这种制剂可以是适用于经口施用、肠胃外施用(诸如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注)、局部施用、通过吸入施用、通过皮肤贴剂、通过植入物、通过栓剂等施用的形式，其中肠胃外施用是优选的。这种合适的施用形式-其可以是固体、半固体或液体，这取决于施用方式-以及用于制备其的方法和载体，对于技术人员将是清楚的，并且在本文中被进一步描述。这种药物制剂或组合物在本文中通常被称为“药物组合物”。用于非人生物体的药物制剂或组合物在本文中通常被称为“兽医组合物”。
因此，在另外的方面，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物含有至少一种本发明的多肽、至少一种本发明的化合物、至少一种本发明的构建体或至少一种本发明的核酸，以及至少一种合适的载体、稀释剂或赋形剂(即，适用于药物用途)，以及任选地一种或多种另外的活性物质。在特别的方面，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物含有SEQ ID NO:1-71、206-223、229-230、266-275和285-292中的至少一个和至少一种合适的载体、稀释剂或赋形剂(即，适用于药物用途)，以及任选地一种或多种另外的活性物质。
通常，本发明的多肽、化合物和/或构建体可以以任何本身已知的合适的方式配制和施用。例如参考以上引用的一般背景技术(并且特别是WO 04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、WO 04/041867和WO 08/020079)以及至标准手册，诸如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Company,USA(1990)；Remington,the Science and Practice of Pharmacy,第21版,Lippincott Williams and Wilkins(2005)；或Handbook of Therapeutic Antibodies(S.Dubel编著),Wiley,Weinheim,2007(参见例如第252-255页)。
本发明的多肽、化合物和/或构建体可以以任何本身已知用于常规抗体和抗体片段(包括ScFv和双抗体)和其它具有药物活性的蛋白的方式配制和施用。这种制剂和用于制备其的方法对于技术人员将是清楚的，并且例如包括适用于肠胃外施用(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、腔内、动脉内或鞘内施用)或局部(即，经皮或皮内)施用的制剂。
用于肠胃外施用的制剂可以例如是适用于输注或注射的无菌溶液、悬浮液、分散体或乳剂。适用于这种制剂的载体或稀释剂例如包括但不限于，WO 08/020079第143页上提及的那些。通常，水溶液或悬浮液将是优选的。
本发明的多肽、化合物和/或构建体也可以使用已知用于基因疗法的递送方法施用，参见例如美国专利号5,399,346，其通过引用其基因疗法递送方法结合。使用基因疗法递送方法，转染有编码本发明的多肽、化合物和/或构建体的基因的原代细胞可以另外地用组织特异性启动子转染以靶向特定器官、组织、移植物、肿瘤或细胞并且可以另外地用信号和稳定化序列转染以用于亚细胞定位表达。
因此，本发明的多肽、化合物和/或构建体可以系统施用，例如，经口、与药用载体如惰性稀释剂或可同化的可食用载体组合。其可以被封装在硬壳或软壳明胶胶囊中，可以被压制成片剂，或可以与患者食谱中的食物直接掺合。对于口服治疗剂施用，本发明的多肽、化合物和/或构建体可以与一种或多种赋形剂组合并且以可吸收片剂、颊含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、薄片(wafer)等的形式使用。这种组合物和制剂应当含有至少0.1％的本发明的多肽、化合物和/或构建体。其在组合物和制剂中的百分比当然可以变化并且可以方便地为给定单位剂型的重量的约2至约60％。本发明的多肽、化合物和/或构建体在这种治疗有效的组合物中的量是这样的，以致将获得有效剂量水平。
所述片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可以含有粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂和甜味剂或调味剂，例如WO 08/020079第143-144页上提及的那些。当所述单元剂型是胶囊时，其除了以上类型的物质以外还可以含有液体载体，诸如植物油或聚乙二醇。多种其它物质可以作为包衣存在或以其它方式改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用明胶、蜡、虫胶或糖等包被。糖浆或酏剂可以含有本发明的多肽、化合物和/或构建体，作为甜味剂的蔗糖或果糖，作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，染料和调味剂(诸如樱桃或橙调味剂)。当然，用于制备任何单位剂型的任何物质都应当是药用的并且在使用的量上是基本上无毒性的。另外，本发明的多肽、化合物和/或构建体可以结合到持续释放制剂和装置中。
用于口服施用的制备物和制剂也可以设置有肠溶包衣，其允许本发明的构建体抵抗胃环境并且进入肠。更通常地，用于口服施用的制备物和制剂可以合适地配制以用于向胃肠道的任何需要的部分递送。另外，合适的栓剂可以用于向胃肠道的递送。
本发明的多肽、化合物和/或构建体也可以通过输注或注射静脉内或腹膜内施用。特别的实例是如WO 08/020079第144页和第145页上或PCT/EP2010/062975(整个文献)中进一步描述的。
对于局部施用，本发明的多肽、化合物和/或构建体可以以纯的形式应用(即，当其是液体时)。然而，通常理想的是将其作为组合物或制剂(与可以是固体或液体的皮肤用载体组合)施用至皮肤。特别的实例是如WO 08/020079第145页上进一步描述的。
本发明的多肽、化合物和/或构建体的有用剂量可以通过比较其体外活性和动物模型中的体内活性来确定。用于将在小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人的方法是本领域中已知的；例如，参见US 4,938,949。
通常，本发明的多肽、化合物和/或构建体在液体组合物(诸如洗剂)中的浓度将为约0.1-25重量％，优选约0.5-10重量％。在半固体或固体组合物(诸如凝胶或粉剂)中的浓度将为约0.1-5重量％，优选约0.5-2.5重量％。
用于治疗所需的本发明的多肽、化合物和/或构建体的量不仅随选择的特定多肽、化合物和/或构建体而变化，而且还随施用途径、治疗的病症的性质和患者的年龄和状况而变化，并且最终取决于在场医生或临床医生的判断。同样，本发明的多肽、化合物和/或构建体的剂量取决于靶细胞、肿瘤、组织、移植物或器官而变化。
所需剂量可以方便地以单次剂量呈递或作为以适当的间隔施用的分开的剂量(例如，每天两个、三个、四个或更多个亚剂量)呈递。亚剂量自身可以被进一步分开，例如，分成若干次不连续松散间隔的施用。
施用方案可以包括长期的每日治疗。“长期”是指至少两周并且优选地，数周、数月或数年的持续时间。在给出本文中的教导的情况下，本领域技术人员仅使用常规实验就可以确定在该剂量范围中的必要改变。在存在任何并发症的情况下，剂量也可以由个体医生来调整。
本发明的多肽、化合物和/或构建体的用途
本发明还涉及本文所述的多肽、化合物和/或构建体、核酸、宿主细胞和组合物的应用和用途，以及涉及用于预防和/或治疗GITR相关疾病、病症或病况(诸如各种癌症和传染性疾病)的方法。由本文中的进一步描述，一些优选的但非限制性的应用和用途将变得清楚。
本发明的多肽、化合物和/或构建体通常可以用于增强免疫应答。特别地，与不存在本发明的多肽、化合物和/或构建体的情况下的T细胞、B细胞或天然杀伤细胞的激活状态相比，本发明的多肽、化合物和/或构建体可以使T细胞、B细胞或天然杀伤细胞的增殖或激活增加至少5％，优选至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％以上，诸如100％，如通过合适的测定(诸如本文中描述的那些)确定的。
在另一个方面，与不存在本发明的多肽、化合物和/或构建体的情况下的个体中的肿瘤、无进展存活期和/或总存活期相比，本发明的多肽、化合物和/或构建体可以在具有肿瘤的个体中抑制肿瘤生长、诱导肿瘤消退、增加无进展存活期和/或延长总存活期达至少5％，优选至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％以上，诸如100％，如通过合适的测定(诸如本文中描述的那些)确定的。
在另外的方面，本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种GITR相关疾病、病症或病况的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用药物活性量的本发明的多肽、本发明的化合物、本发明的构建体和/或包含其的药物组合物。
在本发明的上下文中，术语“预防和/或治疗”不仅包括预防和/或治疗疾病，而且通常还包括预防疾病的发作，减慢或逆转疾病的进程，预防或减慢与疾病相关的一种或多种症状的发作，减少和/或缓和与疾病相关的一种或多种症状，减小疾病和/或与其相关的任何症状的严重度和/或持续时间和/或预防疾病和/或与其相关的任何症状的严重度的进一步增加，预防、减少或逆转由疾病引起的任何生理学损伤，并且通常对治疗的患者有益的任何药理作用。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但特别是哺乳动物，并且更特别是人类。如对于技术人员将是清楚的，待治疗的受试者将特别是患有本文中提及的疾病、病症和病况或处于其风险中的人。
本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种与GITR、其生物学或药理学活性、和/或其中有GITR参与的生物学途径或信号传导相关的疾病、病症或病况的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用药物活性量的本发明的多肽、本发明的化合物、本发明的构建体和/或包含其的药物组合物。特别地，所述药物有效量可以是足以刺激、增强或激动GITR、其生物学或药理学活性、和/或其中有GITR参与的生物学途径或信号传导的量；和/或在循环中提供足以刺激、增强或激动GITR、其生物学或药理学活性、和/或其中有GITR参与的生物学途径或信号传导的本发明的多肽、本发明的化合物和/或本发明的构建体的水平的量。
本发明还涉及用于预防和/或治疗至少一种可以通过向患者施用本发明的多肽、本发明的化合物和/或本发明的构建体来预防和/或治疗的疾病、病症和/或病况的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用药物活性量的本发明的多肽、本发明的化合物、本发明的构建体和/或包含其的药物组合物。
更特别地，本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种选自由本文中列出的疾病、病症和病况组成的组的疾病、病症和/或病况的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用药物活性量的本发明的多肽、本发明的化合物、本发明的构建体和/或包含其的药物组合物。
本发明还涉及用于增强免疫应答的方法。
本发明还涉及用于增强T细胞、B细胞或天然杀伤细胞的增殖或激活的方法。
本发明还涉及用于抑制肿瘤生长的方法。
本发明还涉及用于预防和/或治疗T细胞、B细胞或天然杀伤细胞介导的疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用药物活性量的本发明的多肽、本发明的化合物、本发明的构建体和/或包含其的药物组合物。
更特别地，本发明还涉及用于增强T细胞、B细胞或天然杀伤细胞的增殖或激活的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用药物活性量的本发明的多肽、本发明的化合物、本发明的构建体和/或包含其的药物组合物。
本发明还涉及用于抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用药物活性量的本发明的多肽、本发明的化合物、本发明的构建体和/或包含其的药物组合物。
本发明还涉及用于预防和/或治疗细菌、真菌、病毒或寄生虫传染性疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用药物活性量的本发明的多肽、本发明的化合物、本发明的构建体和/或包含其的药物组合物。
本发明还涉及用于预防和/或治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用药物活性量的本发明的多肽、本发明的化合物、本发明的构建体和/或包含其的药物组合物。
更特别地，本发明还涉及用于增强T细胞、B细胞或天然杀伤细胞的增殖或激活的方法，所述方法包括施用药物活性量的SEQ ID NO:1-71、206-223、229-230、266-275和285-292中的至少一种和/或包含其的药物组合物。
本发明还涉及用于抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括施用药物活性量的SEQ ID NO:1-71、206-223、229-230、266-275和285-292中的至少一种和/或包含其的药物组合物。
本发明还涉及用于预防和/或治疗T细胞、B细胞或天然杀伤细胞介导的疾病的方法，所述方法包括施用药物活性量的SEQ ID NO:1-71、206-223、229-230、266-275和285-中的至少一种和/或包含其的药物组合物。
本发明还涉及用于预防和/或治疗细菌、真菌、病毒或寄生虫传染性疾病的方法，所述方法包括施用药物活性量的SEQ ID NO:1-71、206-223、229-230、266-275和285-292中的至少一种和/或包含其的药物组合物。根据所涉及的传染性生物体或药剂的种类，感染可以大致分为细菌、真菌、病毒或寄生虫感染。引起感染的细菌、真菌、病毒和寄生虫的实例是本领域公知的。
引起可通过本发明的方法治疗的感染的致病细菌的一些优选的但非限制性的实例包括梅毒、衣原体、立克次氏体细菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌和conococci、克雷伯氏菌、变形杆菌、沙雷氏菌、假单胞菌、军团菌、白喉、沙门氏菌、芽孢杆菌、霍乱、破伤风、肉毒中毒、炭疽、鼠疫、钩端螺旋体病和莱姆病(Lymes disease)细菌。
引起可通过本发明的方法治疗的感染的致病病毒的一些优选的但非限制性的实例包括HIV、肝炎(A、B或C)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、EB病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒(cornovirus)、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒、虫媒病毒性脑炎病毒和埃博拉病毒(例如，BDBV、EBOV、RESTV、SUDV和TAFV)。
引起可通过本发明的方法治疗的感染的致病真菌的一些优选的但非限制性的实例包括念珠菌(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克柔念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲霉属(烟曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger)等)、毛霉菌属(Genus Mucorales)(毛霉菌(mucor)、犁头霉(absidia)、如根霉(rhizophus))、申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
引起可通过本发明的方法治疗的感染的致病真菌的一些优选的但非限制性的实例包括溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴(Naegleriafowleri)、棘阿米巴属(Acanthamoeba sp.)、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lambia)、隐孢子虫属(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、微小巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、弓形虫(Toxoplasma gondi)和巴西钩虫(Nippostrongylus brasiliensis)。因此，本发明涉及用于预防和/或治疗这些细菌、真菌、病毒或寄生虫的传染性疾病的方法。
本发明还涉及用于预防和/或治疗癌症的方法，所述方法包括施用药物活性量的SEQ ID NO:1-71、206-223、229-230、266-275和285-292中的至少一种和/或包含其的药物组合物。
特别地，本发明涉及用于预防和/或治疗以下疾病的方法：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、肾癌(诸如肾细胞癌和肾母细胞瘤)、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、前列腺癌、睾丸癌、胃肠癌、胰腺癌、胆道癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、小肠或阑尾癌、子宫或子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、唾液腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、鼻咽癌、基底细胞癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食管癌、头颈癌、白血病、淋巴瘤、梅克尔细胞癌和其它血液恶性肿瘤。
在另一个特别的方面，本发明涉及用于预防和/或治疗以下疾病的方法：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、肾癌(诸如肾细胞癌和肾母细胞瘤)、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、前列腺癌、睾丸癌、胃肠癌、胰腺癌、胆道癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、小肠或阑尾癌、子宫或子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、唾液腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、鼻咽癌、基底细胞癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食管癌、头颈癌、白血病、淋巴瘤、梅克尔细胞癌和其它血液恶性肿瘤，所述方法包括施用药物活性量的SEQ ID NO:1-72、206-223、229-230、266-275和285-292中的至少一种和/或包含其的药物组合物。
在另外的方面，本发明涉及用于免疫疗法的方法，所述方法包括向患有本文中提及的疾病和病症或处于其风险中的受试者施用药物活性量的本发明的多肽、本发明的化合物、本发明的构建体和/或包含其的药物组合物。
在上述方法中，本发明的多肽、化合物和/或构建体和/或包含其的组合物可以以任何合适的方式施用，这取决于待使用的特定的药物制剂或组合物。因此，本发明的多肽、化合物和/或构建体和/或包含其的组合物可以例如经口、腹膜内(例如，静脉内、皮下、肌内或经由避开胃肠道的任何其它施用途径)、鼻内、经皮、局部、通过栓剂、通过吸入施用，这同样取决于待使用的特定的药物制剂或组合物。临床医生将能够选择合适的施用途径和用于所述施用的合适的药物制剂或组合物，这取决于要预防或治疗的疾病、病症或病况以及临床医生公知的其它因素。
本发明的多肽、化合物和/或构建体和/或包含其的组合物根据适用于预防和/或治疗要被预防或治疗的疾病、病症或病况的治疗方案来施用。临床医生将通常能够根据以下因素来确定合适的治疗方案，诸如待预防或治疗的疾病、病症或病况，待治疗的疾病的严重度和/或其症状的严重度，要使用的特定的本发明的多肽、化合物和/或构建体，要使用的特定的施用途径和药物制剂或组合物，患者的年龄、性别、体重、饮食、综合病况，以及临床医生公知的类似因素。
通常，所述治疗方案将包括以一种或多种药学有效量或剂量施用一种或多种本发明的多肽、化合物和/或构建体，或一种或多种包含其的组合物。临床医生可以确定施用的具体量或剂量(同样基于上述因素)。
通常，取决于待治疗的特定疾病、病症或病况，要使用的特定的本发明的多肽、化合物和/或构建体的效力，使用的具体施用途径和具体药物制剂或组合物，临床医生将能够确定合适的日剂量。
通常，在以上方法中，将使用本发明的多肽、化合物和/或构建体。然而，组合使用两种以上本发明的多肽、化合物和/或构建体在本发明的范围之内。
本发明的多肽、化合物和/或构建体可以与一种或多种另外的药物活性化合物或成分组合使用，即作为组合治疗方案，其可以产生或者可以不产生协同效应。
同样，基于上文引用的因素及其专业判断，临床医生将能够选择这种另外的化合物或成分，以及合适的组合治疗方案。
特别地，本发明的多肽、化合物和/或构建体可以与其它药物活性化合物或成分组合使用，所述其它药物活性化合物或成分用于或者能够用于预防和/或治疗本文引用的疾病、病症和病况，其结果是可以获得或者可以不获得协同效应。这种化合物和成分的实例，以及用于施用它们的途径、方法和药物制剂或组合物，对于临床医生将是清楚的。
更特别地，本发明的多肽、组合物和/或构建体可以与化学疗法、放射疗法、癌症疫苗和/或一种或多种另外的治疗剂共同施用。用于共同施用其他的此种药剂或治疗模式或用其治疗的方法是本领域公知的，参见例如Hardman等人,(eds.)(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,第10版,McGraw-Hill,New York,NY；Poole和Peterson(eds.)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,PA；Chabner和Longo(eds.)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,PA。
例如，在一个实施方案中，本发明的多肽、化合物和/或构建体与一种或多种另外的治疗剂组合施用。这种药剂可以包括例如PD-1,PD-L1,PD-L2,CTLA-4,4-1BB(CD137),4-1BB配体,OX40,OX40配体,CD27,TNFRSF25,TL1A,CD40,CD40配体,LIGHT,LTA,HVEM,BTLA,CD160,CEACAM-1,CEACAM-5,LAIR1,2B4,TGFR,LAG-3,TIM-3,涎免凝集素,ICOS(CD278),ICOS配体,B7-H3,B7-H4,B7-1,B7-2,VISTA,HHLA2,TMIGD2,BTNL2,CD244,CD48,CD2,CDS,TIGIT,PVR家族成员,KIRs,ILTs,LIRs,NKG2D,NKG2A,MICA,MICB,CSF1R,IDO,TGFβ,腺苷,ICAM-1,ICAM-2,ICAM-3,LFA-1(CD11a/CD18),LFA-2,LFA-3,BAFFR,NKG2C,SLAMF7,NKp80,CD83配体,CD24,CD39,CD30,CD70,CD73,CD7,CXCR4,CXCL12,磷脂酰丝氨酸,SIRPA,CD47,VEGF和神经毡蛋白。
在另一个实施方案中，本发明的多肽、化合物和/或构建体与抗-PD-1抗体或其抗原结合片段组合施用，其中所述抗-PD-1抗体或其抗原结合片段与本发明的多肽、化合物和/或构建体同时施用，或在施用本发明的多肽、化合物和/或构建体之前或之后施用。如实施例14和21中所示，将本发明的多肽、化合物和/或构建体与抗-PD-1抗体组合施用至小鼠在抑制肿瘤生长中具有协同效应。
在另一个实施方案中，本发明的多肽、化合物和/或构建体与抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段组合施用，其中所述抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段与本发明的多肽、化合物和/或构建体同时施用，或在施用本发明的多肽、化合物和/或构建体之前或之后施用。
在另一个实施方案中，本发明的多肽、化合物和/或构建体与抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段组合施用，其中所述抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段与本发明的多肽、化合物和/或构建体同时施用，或在施用本发明的多肽、化合物和/或构建体之前或之后施用。
在又一个实施方案中，本发明的多肽、化合物和/或构建体与抗-PD-1抗体(或其抗原结合片段)和5-FU组合施用。
当两种以上物质或成分作为组合治疗方案的一部分使用时，它们可以通过相同的施用途径或者通过不同的施用途径在基本上相同的时间或在不同的时间(例如，基本上同时地、连续地或者按照交替的方案)施用。当所述物质或成分通过相同的施用途径同时施用时，它们可以作为不同的药物制剂或组合物或者作为组合的药物制剂或组合物的一部分进行施用，如对于技术人员将是清楚的。
同样，当两种以上活性物质或成分作为组合治疗方案的一部分使用时，各物质或成分可以以与单独使用所述化合物或成分时使用的相同的量并根据相同的方案施用，并且这种组合使用可以产生或可以不产生协同效应。然而，当组合使用两种以上活性物质或成分产生协同效应时，同样可能减少待施用的一种、多种或所有物质或成分的量，同时仍然实现所需的治疗作用。这可以例如对避免、限制或减少当一种或多种物质或成分以其通常量使用时与所述物质或成分的使用相关的任何非所需的副作用，同时仍然获得所需的药物或治疗效果是有用的。
根据本发明使用的治疗方案的有效性可以以任何本身已知用于涉及的疾病、病症或病况的方式确定和/或跟踪，如对临床医生将是清楚的。临床医生也能够在适当时逐例地改变或改进具体的治疗方案，从而实现所需的治疗效果，以避免、限制或减少非所需的副作用，和/或实现一方面实现所需的治疗效果和另一方面避免、限制或减少非所需的副作用之间的适当平衡。
通常，将遵循治疗方案直至实现所需的治疗效果和/或只要所需的治疗效果得以维持即可。同样，这可以由临床医生确定。
在另一个方面，本发明涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体在制备用于预防和/或治疗至少一种GITR相关疾病、病症和病况的药物组合物中的用途；和/或用于一种或多种本文中提及的治疗方法的用途。
本发明还涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防和/或治疗至少一种与GITR和/或其中有GITR参与的信号传导途径和/或生物学功能和响应相关的疾病、病症和病况；和/或用于本文中所述的一种或多种方法的用途。
本发明还涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防和/或治疗至少一种可以通过刺激、增强或激动GITR、其生物学或药理学活性、和/或其中有GITR参与的生物学途径或信号传导来预防和/或治疗的疾病或病症。
本发明还涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防和/或治疗至少一种可以通过向患者施用本发明的多肽、化合物和/或构建体来预防和/或治疗的疾病、病症和病况。
更特别地，本发明涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于增强免疫应答。
本发明还涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于增强T细胞、B细胞或天然杀伤细胞的增殖或激活。
本发明还涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于抑制肿瘤生长。
本发明还涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防和/或治疗T细胞、B细胞或天然杀伤细胞介导的疾病。
本发明还涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防和/或治疗细菌、真菌、病毒或寄生虫传染性疾病。
本发明还涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防和/或治疗癌症。
更特别地，本发明涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防和/或治疗以下疾病：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、肾癌(诸如肾细胞癌和肾母细胞瘤)、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、前列腺癌、睾丸癌、胃肠癌、胰腺癌、胆道癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、小肠或阑尾癌、子宫或子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、唾液腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、鼻咽癌、基底细胞癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食管癌、头颈癌、白血病、淋巴瘤、梅克尔细胞癌和其它血液恶性肿瘤。
本发明还涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体或包含其的药物组合物，其用于预防和/或治疗至少一种GITR相关疾病、病症和/或病况。
本发明还涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体或包含其的药物组合物，其用于预防和/或治疗至少一种与GITR、其生物学或药理学活性、和/或其中有GITR参与的生物学途径或信号传导相关的疾病、病症和/或病况。
本发明还涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体或包含其的药物组合物，其用于预防和/或治疗至少一种可以通过刺激、增加或激动GITR、其生物学或药理学活性、和/或其中有GITR参与的生物学途径或信号传导来预防和/或治疗的疾病、病症和/或病况。
本发明还涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体或包含其的药物组合物，其用于预防和/或治疗至少一种可以通过向患者施用本发明的多肽、化合物和/或构建体来预防和/或治疗的疾病、病症和/和病况。更特别地，本发明还涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体或包含其的药物组合物，其用于增强免疫应答。
本发明还涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体或包含其的药物组合物，其用于增强T细胞、B细胞或天然杀伤细胞的增殖或激活。
本发明还涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体或包含其的药物组合物，其用于抑制肿瘤生长。
本发明还涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体或包含其的药物组合物，其用于预防和/或治疗T细胞、B细胞或天然杀伤细胞介导的疾病。
本发明还涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体或包含其的药物组合物，其用于预防和/或治疗细菌、真菌、病毒或寄生虫传染性疾病。
本发明还涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体或包含其的药物组合物，其用于预防和/或治疗癌症。
更特别地，本发明涉及本发明的多肽、化合物和/或构建体或包含其的药物组合物，其用于预防和/或治疗以下疾病：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、肾癌(诸如肾细胞癌和肾母细胞瘤)、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、前列腺癌、睾丸癌、胃肠癌、胰腺癌、胆道癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、小肠或阑尾癌、子宫或子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、唾液腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、鼻咽癌、基底细胞癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食管癌、头颈癌、白血病、淋巴瘤、梅克尔细胞癌和其它血液恶性肿瘤。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但特别是哺乳动物，并且更特别是人类。在兽医应用中，待治疗的受试者包括出于商业目的培养或作为宠物饲养的任何动物。如对于技术人员将是清楚的，待治疗的受试者将特别是患有本文中提及的疾病、病症和病况或处于其风险中的人。
同样，在这种药物组合物中，一种或多种本发明的多肽、化合物和/或构建体，或编码其的核苷酸，和/或包含其的药物组合物，也可以与一种或多种其它活性成分(诸如本文中提及的那些)合适地组合。
本发明还涉及用于体外(例如，在体外或细胞测定中)或体内(例如，在单细胞或多细胞生物体中，并且特别是在哺乳动物中，并且更特别是在人类中，诸如在处于本发明的疾病、病症或病况的风险中或患有其的人类中)使用的组合物(诸如，不限于，如本文中进一步描述的药物组合物或制剂)。
本发明的多肽、化合物和/或构建体在同基因CT-26结肠癌模型中抑制肿瘤生长。基于其作用模式，本发明的多肽、化合物和/或构建体可以用于治疗其他GITR相关疾病，包括但不限于多种类型的癌症和传染性疾病。
应当理解的是，除非明确地另有所指，则对治疗的提及包括对确定的症状的治疗和预防性治疗。
现在，将通过以下非限制性的优选方面、实施例和附图来进一步描述本发明。
本申请通篇引用的所有参考文献(包括著作文献、发表的专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请)的全部内容通过引用明确地结合于此，，特别是对于上文中参考的教导。
实施例
实施例1：产生GITR表达细胞系和重组食蟹猴GITR和食蟹猴GITR-Fc
1.1GITR表达细胞系
产生稳定的Flp-InTM-293细胞(Life technologies R750-07)和GloResponseTMNF-κB-Nluc2P HEK293(Promega CS188801)细胞系，其重组过表达人GITR、食蟹猴GITR和小鼠GITR。为此，将GITR的编码序列克隆到来源于pcDNA3.1的载体中，位于CMV启动子的下游。人GITR和小鼠GITR的序列从UniprotKB获取(人GITR：Q9Y5U5[SEQ ID NO:231]，小鼠GITR：O35714[SEQ ID NO:232])。食蟹猴GITR的序列从NCBI数据库获取(XP_005545180,SEQ ID NO:233)。使用人源化IgG1抗-人GITR抗体(HuQ6C8-Agly，参见WO06105021)和小鼠IgG1抗-人GITR克隆#110416(R&D Systems MAB689)来确认人GITR的细胞表面表达，使用HuQ6C8-Agly来确认食蟹猴GITR表达，并且使用大鼠IgG2b抗-小鼠GITR克隆DTA-1(eBioscience#16-5874)来确认小鼠GITR表达(图1A-C)。
1.2重组食蟹猴GITR和食蟹猴GITR-Fc
用HIS标签或用人IgG1Fc延长食蟹猴GITR的胞外结构域，并且将各自的cDNA序列克隆到哺乳动物表达载体中。将所得质粒转染到HEK.EBNA细胞中，并且分别通过IMAC和蛋白A层析、随后是脱盐至PBS缓冲液的步骤，从收获的细胞上清液中纯化蛋白质。
实施例2：用人GITR免疫美洲驼，克隆仅重链的抗体片段库以及制备噬菌体
2.1免疫
在伦理委员会(埃博灵克斯股份有限公司,比利时-EC2012#2)批准后，用编码人GITR的基于CMV启动子的DNA对6只骆驼进行免疫。另外地，用重组小鼠GITR-Fc(R&D Systems,524-GR-050)对一只骆驼进行免疫。
2.2仅重链的抗体片段库的克隆和噬菌体的制备。
每只动物在注射一种免疫抗原后收集血样。使用Ficoll-Hypaque，根据制造商的说明书(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ,USA)由这些血样制备PBMC。对于每只免疫的美洲驼，通过汇集从源自免疫时间表的特定子集(即，在一种免疫抗原之后)的样品中分离的总RNA来构建文库。简言之，通过特定的限制性位点将PCR扩增的VHH库克隆到经设计用于促进VHH文库的噬菌体展示的载体中。载体来源于pUC119。与VHH编码序列同框，载体编码C-末端3xFLAG和HIS6标签。根据标准方案(参见例如WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858和其它现有技术和本文中引用的埃博灵克斯股份有限公司提交的申请)制备噬菌体。
实施例3：经由噬菌体展示选择GITR特异性VHH
在应用多重选择条件时，将从所有美洲驼获得并克隆为噬菌体文库的VHH库用于不同的选择策略。变量包括：i)GITR的呈递形式(在不同的细胞背景上)，ii)物种来源的变换(人/食蟹猴/小鼠GITR)，iii)抗原浓度，iv)选择轮次的数量，v)特定GITR表位的遮蔽。简言之，将细胞(参见实施例1)或可溶性抗原(人GITR-Fc(Enzo Life Sciences,ALX-522-061-C050)，食蟹猴GITR(内部制备)，食蟹猴GITR-Fc(内部制备)，小鼠GITR(R&D Systems,524-GR-050)与噬菌体文库温育1-2小时，然后充分洗涤；用胰蛋白酶(1mg/mL)洗脱结合的噬菌体15分钟，然后通过应用0.8mM蛋白酶抑制剂ABSF立即中和蛋白酶活性。作为对照，平行进行亲本细胞系的选择或无抗原的选择。
使用噬菌体输出(outputs)感染大肠杆菌以分析单个VHH克隆。根据标准方案(参见例如WO 03/035694，WO 04/041865，WO 04/041863，WO 04/062551和其它现有技术和本文中引用的埃博灵克斯股份有限公司提交的和申请)制备周质提取物。
实施例4：纳米抗体-IgG嵌合体的构建
4.1纳米抗体-人IgG1嵌合体的构建
纳米抗体-人IgG1嵌合体由两条重链和两条轻链构成。重链包含与人IgG1恒定结构域CH1-CH3融合的抗-GITR纳米抗体。轻链由与人轻链恒定结构域CL(κ)融合的相同的抗-GITR纳米抗体组成。纳米抗体-人IgG1嵌合体的示意图描绘于图7中。
将各个cDNA序列克隆在哺乳动物表达载体中在两个分开的表达盒中。将所得质粒转染到HEK.EBNA细胞中，并且通过蛋白A层析和脱盐至PBS缓冲液，从收获的细胞上清液中纯化蛋白质。
4.2纳米抗体-大鼠IgG2b嵌合体的构建
纳米抗体-大鼠IgG2b嵌合体由两条重链和两条轻链构成。重链包含与大鼠IgG2b恒定结构域CH1-CH3融合的抗-GITR纳米抗体。轻链由与大鼠轻链恒定结构域CL(λ)融合的相同的抗-GITR纳米抗体组成。
将各个cDNA序列克隆在哺乳动物表达载体中在两个分开的表达盒中。将所得质粒转染到HEK.EBNA细胞中，并且通过蛋白A层析和脱盐至PBS缓冲液，从收获的细胞上清液中纯化蛋白质。
实施例5：筛选
5.1在结合ELISA中筛选结合GITR的纳米抗体
在人GITR(Enzo Life Sciences,ALX-522-061-C050)和食蟹猴GITR(内部制备)的结合ELISA中筛选周质提取物。为此，用人或食蟹猴GITR(0.5μg/ml)包被微量滴定板，在4℃过夜温育。用75μl PBS中的1％酪蛋白将平板在室温封闭1小时。将平板用PBS-吐温洗涤。将周质提取物(在含有0.1％酪蛋白+0.05％吐温的PBS中1/5或1/8000稀释)在室温温育至少1小时。将平板用PBS-吐温洗涤6次，然后用在含有0.1％酪蛋白+0.05％吐温20的PBS中的抗-FLAG-HRP(Sigma-Aldrich,A8592)mAb 1/5000检测VHH的结合。用底物esTMB(SDT试剂)进行染色，并且15分钟后在450nm下测量信号。
对结合ELISA中评分为阳性的纳米抗体进行测序。序列分析导致鉴定了8个不同的家族，即家族7、家族26、家族82、家族109、家族85、家族38、家族110和家族108。表A-1、表A-2、表A-3、表A-4、表A-5、表A-6、表A-7和表A-8中分别提供了相应的比对。分为不同的家族是基于CDR的序列相似性和差异。相对于各家族的代表物的序列可变性在下表中描述。
对于家族7，使用克隆A0231005A03的CDR的氨基酸序列作为参考，将所有其它家族7克隆的CDR与其进行比较。相对于A0231005A03的序列可变性在下表中描述。
*在位置2是S的情况下，那么位置8也是A，并且位置10也是G。
*引入变体以替代甲硫氨酸从而避免该残基的氧化
对于家族26，使用克隆A0231004B01的CDR的氨基酸序列作为参考，将所有其它家族26克隆的CDR与其进行比较。相对于A0231004B01的序列可变性在下表中描述。
对于家族82，使用克隆A0231034A08的CDR的氨基酸序列作为参考，将所有其它家族82克隆的CDR与其进行比较。相对于A0231034A08的序列可变性在下表中描述。
对于家族109，使用克隆A0231052E08的CDR的氨基酸序列作为参考，将所有其它家族109克隆的CDR与其进行比较。相对于A0231052E08的序列可变性在下表中描述。
对于家族85，克隆A0231033B02的CDR的氨基酸序列在下表中描述。
对于家族38，使用克隆A0231003D11的CDR的氨基酸序列作为参考，将所有其它家族38克隆的CDR与其进行比较。相对于A0231003D11的序列可变性在下表中描述。
对于家族110，使用克隆A0231052A08的CDR的氨基酸序列作为参考，将所有其它家族110克隆的CDR与其进行比较。相对于A0231052A08的序列可变性在下表中描述。
对于家族108，克隆A0231051E01的CDR的氨基酸序列在下表中描述。
5.2单价纳米抗体的纯化
选择代表性的纳米抗体并在大肠杆菌TG1中表达为三联FLAG，HIS6-标记的蛋白。通过加入1mM IPTG诱导表达并且让其在37℃继续4小时。在离心细胞培养物后，通过冻融和在D-PBS中重悬沉淀来制备周质提取物。过滤(0.20μm)周质提取物，并且添加咪唑至终浓度为20mM。经由IMAC来纯化这些周质提取物中的纳米抗体，并且经由Zebaspin(Fisher Scientific)将其脱盐。
实施例6：单价抗-GITR纳米抗体的动力学分析
在Proteon XPR36上确定亲和力。简言之，将人GITR-Fc(Enzo Life Sciences,ALX-522-061-C050)经由胺偶联固定于GLC芯片之后，注射一系列6个浓度的不同单价纳米抗体(代表每个家族)。通过使用计算的结合速率和解离速率常数来确定KD值(表1)(ProteOn Manager 3.1.0,Version 3.1.0.6(2011))。
表1：单价抗-GITR纳米抗体的KD值
实施例7：抗-GITR纳米抗体与Flp-InTM-293细胞和活化T细胞上表达的GITR的结合
在流式细胞术中评价纯化的单价抗-GITR纳米抗体与活化T细胞上表达的人GITR的结合。为此，将来自健康供体的PBMC与人T-激活剂CD3/CD28(Gibco-Life Technologies#11131D)以1/2的珠/细胞比培养7天。激活后，获得由>98％T细胞组成的细胞群。这些T细胞是高度激活的(CD25高、CD45RO+T细胞)，并且表现出GITR的良好表达(图1D)。
将开始于1μM的纳米抗体的稀释物系列应用于细胞。使纳米抗体在FACS缓冲液(补充有10％FBS和0.05％叠氮化物的PBS)中在4℃缔合30分钟。通过离心洗涤细胞并且用抗-FLAG抗体(Sigma F1804)在4℃探测30分钟，以检测结合的纳米抗体。用山羊抗-小鼠IgG-PE(Jackson ImmunoResearch#115-116-071)在4℃进行检测30分钟。洗涤细胞并且用TOPRO3温育以将死细胞染色，随后在门控程序中将该死细胞移除。然后经由BD FACSArray分析细胞。结果显示在图2A-2B中。
从剂量反应曲线获得的EC50值在表2中呈现。
表2：如在流式细胞术中确定的，抗-GITR单价纳米抗体与活化T细胞的EC50(M)值
实施例8：多价构建体的产生和结合
8.1多价纳米抗体构建体的构建
为了增加效力和/或功效，通过基因工程改造构建多价分子。利用3A、9GS或35GS接头将多个纳米抗体在基因上连接在一起。所有多价GITR纳米抗体构建体都携带C-端白蛋白结合纳米抗体，并且随后在巴斯德毕赤酵母中根据标准条件表达。使用IMAC纯化具有FLAG3-HIS6标签的构建体，而无标签的构建体经由蛋白A结合进行纯化。如表A-11中所列出的，制备不同的多价GITR构建体。
8.2如通过FACS确定的，多价抗-GITR纳米抗体与NFkB-Nluc2P HEK293细胞上表达的人GITR的结合。
通过FACS确定多价构建体与人GITR的结合。简言之，使纳米抗体在FACS缓冲液(补充有10％FBS和0.05％叠氮化物的PBS)中在4℃缔合30分钟。通过离心洗涤细胞并且用内部制备的抗-ALB11抗体在4℃探测30分钟，以检测结合的纳米抗体。用山羊抗-小鼠IgG-PE(Jackson ImmunoResearch#115-116-071)在4℃进行检测30分钟。洗涤细胞并且用TOPRO3温育以将死细胞染色，随后在门控程序中将该死细胞移除。然后经由BD FACSArray分析细胞。结合曲线显示在图3中。从剂量反应曲线获得的EC50值在表3中描述。
表3：抗-GITR多价纳米抗体、纳米抗体-人IgG1嵌合体A-0231-00_TP008和参比化合物对结合HEK293_NFkB-Nluc2P人GITR细胞的EC50(M)值，如流式细胞术中确定的
实施例9：NF-κB荧光素酶报告分子测定中评价的抗-GITR纳米抗体对GITR的激活
在NF-κB荧光素酶报告分子测定中评价纯化的单价纳米抗体的功能性。为此，用人GITR稳定转染GloResponseTMNF-κB-Nluc2P HEK293(Promega CS188801)细胞系。为了评价抗-GITR纳米抗体的激活能力，将表达GITR的细胞以10,000个细胞/孔接种于白色、组织培养处理的96孔板(Costar#3917)。添加抗-GITR纳米抗体的连续稀释物，并且使其在5％CO2下在37℃保温箱中相互作用5小时。通过在添加Nano-GloTM试剂(Promega#N1120)后测量发光来评价NF-kB活性。表4A所示的结果表明抗-GITR纳米抗体和HuQ6C8-Agly对具有不均匀GITR表达的细胞池的影响。表4B-C所示的结果表明抗-GITR纳米抗体、HuQ6C8-Agly和36E5对单个细胞克隆的影响。说明性激活曲线显示在图4A-D中。
表4A：抗-GITR多价纳米抗体和参比化合物的EC50(M)值和功效值(人GITR配体＝100％)
表4B：抗-GITR多价纳米抗体、纳米抗体-人IgG1嵌合体A-0231-00_TP008和参比化合物的EC50(M)值和功效值(人GITR配体＝100％)
表4C：抗-GITR多价纳米抗体的EC50(M)值和功效值(人GITR配体＝100％)
实施例10：抗-GITR纳米抗体的人T细胞激活能力
在人T细胞激活测定中评价纯化的多价、单特异性抗-GITR纳米抗体的功能性。使用CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec#130-096-533)，从来自健康供体的血沉棕黄层分离人CD4+T细胞，并且在补充有10％FBS和1％P/S的RPMI-1640(Life Technologies-Gibco#72400)中培养。随后用人T-激活剂CD3/CD28(Life Technologies-Gibco#11131D)将分离的CD4+T细胞激活10天(珠/细胞比为1/5)和额外4天(比率为1/1)。通过测量CD25表达(抗-CD25-PE–BD Bioscience#557138)、CD45RA表达(抗-CD45RA-APC–BD Bioscience#550855)和CD45RO表达(抗-CD45RO-PE–BD Bioscience#555493)，经由流式细胞术来评价激活状态。通过使用小鼠抗-人GITR克隆110416(R&D Systems#MAB689)进行检测，确认GITR表达。
为了评价抗-GITR纳米抗体的激活能力，在补充有10％人AB血清和1％P/S的RPMI-1640中培养活化CD4+T细胞。在存在或不存在抗-GITR纳米抗体的情况下，以125ng/ml(IFN-γ生产)或8ng/ml(增殖)将细胞添加至包被有抗-CD3克隆OKT3(eBioscience#16-0037-85)的平板。在5％CO2下在37℃保温箱中温育3天后，通过ELISA测量IFN-γ生产。对于增殖测量，将细胞温育3天，并且在收获和计数细胞之前18小时用3H-胸苷脉冲激活。
多价抗-GITR纳米抗体对IFN-γ生产的影响显示于图5A-D。纳米抗体A023100035，即在各个结构单元之间具有9GS接头的四价纳米抗体(家族7)，起到完全激动剂的作用，在整个测试浓度范围中展现了与天然配体实质上相同的功效(限定为Emax)。图5E和5F显示了分别对于参比化合物36E5和HuQ6C8-Agly获得的数据。这些抗体起到部分激动剂的作用，其展现了较低的最大功效，甚至随着浓度增加而进一步减小。
表5显示了与天然配体相比，多价抗-GITR纳米抗体和抗-GITR抗体对IFN-γ生产的影响。EC50值反映了纳米抗体的效力。还呈现了作为Emax(＝由天然配体诱导的最大响应)百分比的最大功效。纳米抗体A023100035清楚地显示出与天然配体(设定为100％)相当的功效。
表5：抗-GITR多价纳米抗体构建体和参比化合物的EC50值(M)和最大功效值(人GITR配体＝100％)(IFN-γ读出)
实施例11：接头长度多价纳米抗体构建体
在人GITR NF-κB荧光素酶报告分子测定中评价接头长度的影响，如实施例9中所描述的。与具有35GS接头的纳米抗体构建体相比，具有9GS接头的纳米抗体构建体显示出更高的功效(参见表6A)。这通过使用不同的纳米抗体构建体得以验证(参见6B)。另外，具有3A接头的纳米抗体构建体显示出具有与9GS连接的构建体相当的功效。
具有不同接头长度的多价抗-GITR纳米抗体构建体对NF-κB活性的影响也显示于图6A-D。出乎意料地，本发明发明人另外表明，缩短接头长度甚至能够进一步改善GITR纳米抗体构建体的功能性质。
表6A：抗-GITR多价纳米抗体的EC50(M)值和最大功效值(人GITR配体＝100％)
表6B：抗-GITR多价纳米抗体的EC50(M)值和最大功效值(人GITR配体＝100％)
实施例12：OVA免疫模型中的体内概念验证
在OVA免疫模型中，在第0天(D0)通过皮下(s.c.)施用盐水或辅剂中的100μg卵白蛋白对BALB/c小鼠进行免疫，随后是在D14使用盐水或辅剂中的相同s.c.剂量进行加强。向接受辅剂中的OVA的小鼠施用与明矾(alum)或不完全弗氏佐剂(IFA)的1:1混合物中的OVA。
评价了抗-GITR纳米抗体和抗-GITR纳米抗体-大鼠IgG2b嵌合体对针对OVA的体液免疫应答的佐剂效应，其反映了抗-GITR纳米抗体和抗-GITR纳米抗体-大鼠IgG2b嵌合体的免疫增强作用。
为了评价抗-GITR和抗-GITR纳米抗体-大鼠IgG2b嵌合体对针对OVA的体液应答的影响，在初始免疫(D0)或加强免疫(D14)时连续3天腹膜内施用抗-GITR纳米抗体或不相关的对照纳米抗体，其中第一给药日的负荷剂量为1x 15mg/kg并且下两个给药日的维持剂量为2x 10mg/kg。在D0或D14连续3天以25mg/kg腹膜内施用抗-GITR纳米抗体-大鼠IgG2b嵌合体。在D-7、D13和D21，通过ELISA确定抗-OVA血清滴度。包括与明矾或IFA混合的OVA用于比较。与未处理的动物和不相关的对照动物相比，预期抗-GITR纳米抗体和抗-GITR纳米抗体-大鼠IgG2b嵌合体处理的动物中的总抗-OVA IgG水平显著增加。
实施例13：同基因CT-26结肠癌模型中的体内概念验证
在同基因CT-26结肠癌模型中证明了抗-GITR纳米抗体和抗-GITR纳米抗体-大鼠IgG2嵌合体的肿瘤功效。
在该模型中，用来源于BALB/c的结肠直肠癌细胞(CT26细胞)接种BALB/c小鼠。在第0天(D0)，通过将200μL的RPMI 1640中的1x106个CT26细胞皮下注射到BALB/c小鼠的右侧中来诱导肿瘤。当肿瘤达到50-100mm3的平均体积时，根据表7所示的治疗方案处理动物。
评价了抗-GITR纳米抗体和抗-GITR纳米抗体-大鼠IgG2b嵌合体对肿瘤生长的体内功效，并且与不相关的对照纳米抗体进行比较。使用单一疗法中的或与抗-PD-1抗体(Ab)或抗-PD-1Ab+5-氟-尿嘧啶(5FU)的组合疗法中的抗-GITR纳米抗体或抗-GITR纳米抗体-大鼠IgG2b嵌合体处理小鼠。包括用抗-CTLA-4Ab处理的小鼠作为阳性对照组。抗-GITR纳米抗体和抗-GITR纳米抗体-大鼠IgG2b嵌合体的功效进一步与作为单一疗法或与抗-PD-1抗体的组合疗法中的DTA-1进行比较。
表7：治疗方案
*TWx2：总计4次注射，每周2次注射：在星期一/星期四或在星期二/星期五。Q5Dx3：3次注射，每5天进行1次注射；Q7Dx3：3次注射，每7天进行1次注射；Q2Dx10：10次注射，每2天进行1次注射。在组合的情况下：在抗-PD-1之后注射DTA-1、抗-GITR NB、抗-GITR NB-大鼠IgG2b嵌合体或不相关的NB。在5-FU之后注射抗-PD-1。
记录生存力、行为和体重。每周两次用卡尺测量肿瘤的长度和宽度，并且通过下式估算肿瘤体积：
靶向GITR的纳米抗体或纳米抗体-大鼠IgG2b嵌合体的显著抗肿瘤活性反映了肿瘤发展发作的显著延迟或完全的肿瘤排斥。
用CT26细胞再次攻击来评价已经排斥皮下CT26肿瘤的BALB/c小鼠中抗肿瘤记忆的建立。
在第49天(D49，即第一次SC注射CT26细胞后49天)，将200μL的RPMI 1640中的1x106个CT26细胞皮下注射到来自第2、3、4、5、7和9组的动物的左侧。只有已经通过治疗作用消除第一CT26肿瘤的小鼠才注射第二CT26肿瘤细胞。
另外，为了证明不存在免疫记忆的情况下的CT26肿瘤生长，将200μL的RPMI 1640中的1x106个CT26细胞皮下注射到九(9)只首次用于实验的(naive)小鼠的左侧。
如以上所描述的来监测动物。
预期使用靶向GITR的纳米抗体或纳米抗体-大鼠IgG2b嵌合体实现了肿瘤发展发作的显著延迟或完全的肿瘤排斥。
实施例14：单独的或与抗-PD-1抗体组合的激动性抗-GITR纳米抗体在同基因CT-26结肠癌模型中引起肿瘤消退并增加存活时间
在同基因CT-26结肠癌模型中证明激动性抗-GITR纳米抗体(Nb)的抗肿瘤功效，其中用来源于BALB/c的结肠直肠癌细胞(CT-26细胞)接种BALB/c小鼠。在补充有10％热灭活的胎牛血清和2mM左旋谷酰胺的RPMI 1640培养基中培养CT-26细胞。将200μL体积的RPMI 1640中的1x106个CT-26细胞皮下注射到BALB/c小鼠(注射到右侧)。使用卡尺测量肿瘤长度和宽度，并且使用下式确定肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝0.5x长度x宽度2，其中长度为较长的维度。在肿瘤攻击后的第8天，将小鼠根据它们各自的肿瘤体积随机分为14个治疗组，其中等效平均肿瘤大小为89mm3，并且根据表8中给出的治疗方案开始给药。每周两次记录肿瘤体积。每天记录存活。当肿瘤超过正常体重的10％时，使小鼠安乐死。
将小鼠用抗-GITR纳米抗体或用大鼠IgG2b或人IgG1同种型的抗-GITR纳米抗体-IgG嵌合体处理，其作为单一疗法或与抗-PD-1单克隆抗体(mAb；BioXCell克隆RPM1-14)组合。包括单独的或与抗-PD-1 mAb组合的DTA-1(BioXCell)(一种抗-GITR mAb)处理的小鼠作为阳性参比对照组。一组对照小鼠(载体组14)是未经处理的。在肿瘤攻击后第8天开始通过腹膜内注射(IP)施用所有治疗。用25mg/kg的单次剂量处理接受DTA-1的小鼠组(组1和组2)。接受抗-GITR纳米抗体的小鼠组以每两天一次IP注射反复治疗18天，剂量水平为15mg/kg单次负荷剂量和10mg/kg维持剂量(剂量水平1；第3和7组)或者30mg/kg单次负荷剂量和20mg/kg维持剂量(剂量水平2；第5和8组)。以各自的剂量水平1(第4和9组)和剂量水平2(第6和10组)多次给药方案给药不相关的对照纳米抗体。大鼠IgG2b和人IgG1同种型的抗-GITR NB-IgG嵌合体分别作为5mg/kg(第11组)和25mg/kg(第12和13组)的单次剂量施用。向接受组合疗法的小鼠组施用总计三次抗-PD-1 mAb的IP注射，其中以10mg/kg的剂量水平每五天注射一次(第2、7、8、9、10和13组)。
评价抗-GITR纳米抗体和抗-GITR纳米抗体-IgG嵌合体的抗肿瘤功效，并且与各自的对照组进行比较。肿瘤生长抑制、肿瘤生长的延迟和肿瘤消退连同动物的存活作为抗肿瘤功效的读出。
如图8所示，当与载体组14(图8N)相比时，抗-GITR纳米抗体与抗-PD-1 mAb的组合(第7和8组；图8G和8H)导致协同功效，其中对于纳米抗体剂量水平1和2分别有7/10和8/10的动物显示出延迟的肿瘤发展，而各自的对照组中仅为1/10和2/10的动物(第9和10组；图8I和8J)。
当与各自的对照组5和6相比时，使用抗-GITR纳米抗体的单一疗法导致分别在剂量水平1和2下，在3/10和4/10的动物中延迟了肿瘤发展。人IgG1同种型的抗-GITR纳米抗体-IgG嵌合体与抗-PD-1 mAb的组合导致强大的协同效应，其显示为8/10的动物中的肿瘤发展延迟和50％的完全消退(CR)(第13组)。使用人IgG1同种型嵌合体的单一疗法导致6/10的动物中的肿瘤生长延迟，其中1/10的动物显示出完全的肿瘤消退(第12组)。与载体组相比，使用大鼠IgG2b同种型嵌合体的单一疗法导致6/10的动物中的肿瘤生长延迟(第11组)。与其各自的对照组相比，对于单一疗法(第1组)和与抗-PD-1 mAb的组合(第2组)，使用参比抗-GITR mAb，DTA-1的治疗分别导致8/10和6/10的动物中的肿瘤发展延迟。单一疗法和组合疗法两者都导致20％的完全消退。
另外，如图9所示，载体组的中位存活时间(从肿瘤注射那天开始计算)为23天(第14组)。单独用参比抗-GITR mAb，DTA-1治疗的组的中位存活时间为44.5天，其中40％的动物在治疗后第40天仍然存活，而使用DTA-1和抗-PD-1 mAb的组合疗法得到34天的中位存活，其中30％的动物在治疗后第40天仍然存活。接受不相关的纳米抗体与抗-PD-1 mAb的组合的对照组在不相关纳米抗体剂量水平1和2下的中位存活分别为21.5和23天。使用抗-GITR纳米抗体的单一疗法对于两个剂量水平都对应于23天的中位存活时间(第3和5组)，而使用不相关的纳米抗体治疗的各自的对照组对于两个剂量水平显示出20天的中位存活(第4和6组)。使用抗-GITR纳米抗体和抗-PD-1 mAb的组合治疗的组的中位存活在纳米抗体剂量水平1下为30天(第7组)，其中20％在治疗后第40天仍然存活，并且在纳米抗体剂量水平2下为28.5天(第8组)。接受大鼠IgG2b同种型的抗-GITR纳米抗体嵌合体的单一疗法的动物(第11组)呈现出27天的中位存活，其中10％在治疗后第40天仍然存活。
使用人IgG1同种型抗-GITR纳米抗体嵌合体的单一疗法治疗的动物(第12组)具有27天的中位存活，其中30％在治疗后第40天存活，而使用人IgG1同种型嵌合体与抗-PD-1 mAb的组合治疗的动物中的60％在治疗后第40天仍然存活(第13组)。总而言之，本发明的激动性抗-GITR纳米抗体在相关肿瘤模型中显示出统计学上显著的效应。这些结果通过所得数据的单独且独立的统计分析得到了进一步验证，其是所谓的tobit回归模型的扩展版本(Dagne&Huang,2012)。
表8：治疗方案
Q1Dx1：治疗开始那天的单次注射；Q5Dx3：3次注射，每5天进行1次注射；Q2Dx10：10次注射，每2天进行1次注射。在组合的情况下：在抗-PD-1之后注射DTA-1、抗-GITR NB、抗-GITR NB-大鼠IgG2b嵌合体、抗-GITR NB-人IgG1嵌合体或不相关的NB。
实施例15：T细胞激活测定中的抗-GITR纳米抗体的体外基准测试。
如实施例10中所描述的进行T细胞实验。结果显示在图10A-10C中。这些实验显示，测试的抗-GITR化合物具有与临床阶段36E5mAb类似的效力(EC50)。然而，纳米抗体构建体A023100035和A-0231-00_TP008清楚地显示出与36E5相比更高的最大功效。这在临床上是非常重要的，因为药物的有效性取决于其最大功效。纳米抗体A023100014显示出与36E5相比同等的最大功效，与36E5相反的是，其在较高浓度下得以维持。
实施例16：A023100035和A-0231-00_TP008在OVA免疫模型中的体内概念验证
证明抗-GITR多价纳米抗体(A023100035)和抗-GITR纳米抗体-huIgG1嵌合体(A-0231-00_TP008)对针对OVA的体液免疫应答的佐剂效应，其反映了抗-GITR激动剂纳米抗体和抗-GITR纳米抗体-huIgG1嵌合体的免疫增强作用。
在OVA免疫模型中，在第0天(第0天)通过皮下(s.c.)施用盐水或与不完全弗氏佐剂(IFA)的1:1混合物中的100μg OVA对BALB/c小鼠进行免疫，随后是在第14天使用盐水或IFA中的相同s.c.剂量进行加强。
为了评价抗-GITR纳米抗体对针对OVA的体液应答的影响，以不同的给药方案腹膜内施用抗-GITR纳米抗体，即在初始免疫(第0天)和加强免疫(第14天)那天以15mg/kg(单次剂量水平1，SDL1)或30mg/kg(SDL2)施用的单次给药方案；在第0天和第14天开始以15mg/kg的负荷剂量水平和两次10mg/kg的维持剂量水平施用的重复给药方案(Q2Dx3；重复给药方案1，RD1)；在第0天以15mg/kg的负荷剂量水平以及十次10mg/kg的维持剂量水平施用的重复给药方案(Q2Dx11；RD2)。以对应于各自的抗-GITR纳米抗体给药方案的给药方案来施用不相关的对照纳米抗体。在第0天和第14天将抗-GITR纳米抗体-huIgG1嵌合体以20mg/kg的剂量水平作为单次剂量施用，并且与相同给药方案和水平下给出的不相关的人IgG1mAb(Synagis)进行比较。包括抗-小鼠GITR激动剂mAb(DTA-1；BioXCell)作为阳性参比对照，并且与其相应的同种型对照(抗-KLH，克隆LTF-2，BioXCell)进行比较，两者都在第0天和第14天以20mg/kg的剂量水平以单次给药方案施用。在OVA免疫之前给予第0天和第14天的治疗。包括与IFA混合的OVA作为参比比较。
在初始免疫之后，在第13天和第21天通过ELISA确定抗-OVA总IgG血清滴度。如图11所描述的，在第13天，在经受连续的重复给药方案RD2的动物中的OVA滴度显著增加，其平均log10滴度为4.273(±0.284)(相对于其相应对照(3.325±0.104；p<0.0001))。在第21天，OVA滴度进一步增加至6.071(±0.277)，其相对于对照(4.962±0.225；p<0.0001)是显著不同的。在以SDL1、SDL2和RD1接受抗-GITR纳米抗体的动物中，第21天的最高滴度由以下诱导：RD1(6.744±0.151)(相对于其相应对照(5.090±0.206；p<0.0001))，和SDL1(6.628±0.125)(相对于其相应对照(5.156±0.368；p<0.0001))。与SDL1类似，SDL2下的抗-GITR纳米抗体导致OVA滴度增加(6.225±0.473)，其相比于相应对照(4.799±0.081；p<0.0001)是显著不同的。在第21天，抗-GITR纳米抗体-huIgG1嵌合体导致5.903(±0.249)的OVA滴度增加，其相比于同种型对照(5.326±0.237)是显著不同的。类似地，经治疗的动物相对于对照动物的滴度差异在使用DTA-1治疗方面也是显著的(分别为，5.530±0.343比上4.971±0.281；p＝0.0002)。
实施例17：抗-GITR纳米抗体的序列优化
17.1序列优化：序列分析
使亲本野生型纳米抗体序列突变以产生与人VH3-JH种系共有序列更加一致的纳米抗体序列。将纳米抗体和人VH3-JH种系共有序列之间不同的框架区中的特定氨基酸以这样的方式改变为人类对应物，使得蛋白质结构、活性和稳定性保持完整。对于纳米抗体A0231004B01，产生包括5个突变(L11V、A74S、K83R、V89L、K105Q)的变体(A023100061，SEQ ID NO:269)(根据Kabat编号)。对于A0231005A03，产生具有相同的5个突变(L11V、A74S、K83R、V89L、K105Q)的变体(A023100078，SEQ ID NO:271)。另外，位置100e处的甲硫氨酸进一步被亮氨酸(A023100090，SEQ ID NO:272)、赖氨酸(A023100091，SEQ ID NO:282)、精氨酸(A023100092，SEQ ID NO:283)或谷氨酰胺(A023100093，SEQ ID NO:284)置换。对于A0231034A08，产生具有5个突变(D10G、L11V、A74S、K83R、V89L)的变体(A023100063，SEQ ID NO:270)。最后，对于纳米抗体A0231052E08，产生带有以下9个突变的变体(A023100050，SEQ ID NO:268)：L11V、A14P、S60A、A74S、M78L、K83R、A87T、G88A、V89L。
17.2序列优化的多价抗-GITR纳米抗体构建体的构建、表达和纯化
对于变体A023100061和A023100090，如表A-11中列出的制备不同的构建体(SEQ ID NO:285-290)。所有多价纳米抗体构建体都具有C-端白蛋白结合Nb(Alb92)，并且随后在巴斯德毕赤酵母中根据标准条件表达。经由蛋白A结合来纯化构建体。
实施例18：NF-κB荧光素酶报告分子测定中评价的序列优化的抗-GITR多价纳米抗体对GITR的激活
在NF-κB荧光素酶报告分子测定中确定序列优化格式的纳米抗体的功能性，如实施例9中所描述的。
EC50值和功效在表9中显示。说明性激活曲线显示在图12A-D中。
表9：序列优化的抗-GITR多价纳米抗体和参比化合物的EC50(M)值和功效值(人GITR配体＝100％)
实施例19：序列优化的抗-GITR纳米抗体的人T细胞激活能力
还在人T细胞激活测定中评价序列优化格式的纳米抗体的功能性。如实施例10中所描述的进行实验。
表10显示了与天然配体相比，多价抗-GITR纳米抗体和抗-GITR抗体对IFN-γ生产的影响。EC50值反映了纳米抗体的效力。还呈现了作为Emax(＝由天然配体诱导的最大响应)百分比的最大功效。所有纳米抗体构建体都清楚地显示出与天然配体(设定为100％)相当的功效。说明性激活曲线显示在图13A-G中。
表10：序列优化的抗-GITR多价纳米抗体构建体和参比化合物的EC50值(M)和最大功效值(人GITR配体＝100％)(IFN-γ读出)
实施例20：序列优化的抗-GITR多价纳米抗体在OVA免疫模型中的体内概念验证
评价了抗-GITR多价纳米抗体(A023100101、A023100107、A023100118)对针对OVA的体液免疫应答的佐剂效应，其反映了抗-GITR激动剂纳米抗体的免疫增强作用。
在OVA免疫模型中，在第0天(第0天)通过皮下(s.c.)施用盐水或与不完全弗氏佐剂(IFA)的1:1混合物中的100μg OVA对BALB/c小鼠进行免疫，随后是在第14天使用盐水或IFA中的相同s.c.剂量进行加强。
为了评价抗-GITR多价纳米抗体对针对OVA的体液应答的影响，在初始(第0天)和加强(第14天)OVA免疫那天以剂量水平范围为0.5至20mg/kg的单次给药方案并且在OVA免疫之前，腹膜内施用抗-GITR纳米抗体。在15mg/kg的剂量水平下以类似的单次给药方案施用不相关的对照纳米抗体。包括抗-小鼠GITR激动剂mAb(DTA-1；BioXCell)作为阳性参比对照，并且与其相应的同种型对照(抗-KLH，克隆LTF-2，BioXCell)进行比较，两者都在第0天和第14天以20mg/kg的剂量水平以单次给药方案施用。包括与IFA混合的OVA作为参比比较。
在初始免疫之后，在第13天和第21天通过ELISA确定抗-OVA总IgG血清滴度。与未处理的动物和对照动物相比，预期抗-GITR纳米抗体处理的动物中的总抗-OVA IgG水平显著增加。
实施例21：单独的或与抗-PD-1抗体组合的序列优化的激动性抗-GITR多价纳米抗体在同基因CT-26结肠癌小鼠模型中的抗肿瘤功效
在同基因CT-26结肠癌模型中证明抗-GITR激动性多价纳米抗体(Nb)和抗-GITR纳米抗体-huIgG1嵌合体的抗肿瘤功效，其中用来源于BALB/c的结肠直肠癌细胞(CT-26细胞)接种BALB/c小鼠。在补充有10％热灭活的胎牛血清和2mM左旋谷酰胺的RPMI 1640培养基中培养CT-26细胞。将200μL体积的RPMI 1640中的1x106个CT-26细胞皮下注射到BALB/c小鼠(注射到右侧)。使用卡尺测量肿瘤长度和宽度，并且使用下式确定肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝0.5x长度x宽度2，其中长度为较长的维度。在肿瘤攻击后第7天，将小鼠根据它们各自的肿瘤体积随机分为15个治疗组，每组10只动物，平均肿瘤体积为55±19mm3。根据表11中呈现的治疗方案开始给药。每周两次记录肿瘤体积。每天记录生存力、行为和体重。监测动物直至治疗开始后第42天。
使用抗-GITR多价纳米抗体(A023100101、A023100107、A023100118)或使用抗-GITR纳米抗体-huIgG1嵌合体(A-0231-00_TP011)来治疗动物，其作为单一疗法或者与抗-PD-1单克隆抗体(mAb)的组合疗法。包括单独的或与抗-PD-1 mAb组合的抗-GITR mAb(DTA-1)处理的小鼠作为阳性对照组。一组对照小鼠(第1组)是未经处理的。在肿瘤攻击后第7天开始通过腹膜内注射(IP)施用所有治疗。用25mg/kg的单次剂量处理接受DTA-1的小鼠组(组2和组3)。接受抗-GITR纳米抗体的小鼠组经由每两天一次IP注射的多次给药方案治疗18天，其由一次负荷剂量和九次维持剂量组成。使用抗-GITR纳米抗体A023100101治疗的组接受15mg/kg的负荷剂量和10mg/kg的维持剂量(第8和9组)。将抗-GITR纳米抗体A023100107以18.7mg/kg的负荷剂量和12.5mg/kg的维持剂量给药(第10和11组)。将抗-GITR纳米抗体A023100118以22.5mg/kg的负荷剂量和14mg/kg的维持剂量给药(第12和13组)。将后两个抗-GITR纳米抗体A023100107和A023100118的剂量水平设定为是与抗-GITR纳米抗体A023100101等摩尔的。类似于抗-GITR纳米抗体A023100101，将不相关的对照纳米抗体给药。抗-GITR纳米抗体-huIgG1嵌合体分别作为25mg/kg的单次剂量施用(第14和15组)。向接受组合疗法的小鼠组施用总计三次抗-PD-1 mAb的IP注射，其中以10mg/kg的剂量水平每五天注射一次(第3、5、7、9、11、13、15组)。
评价抗-GITR多价纳米抗体和抗-GITR纳米抗体-huIgG1嵌合体的抗肿瘤功效，并且与各自的对照组进行比较。对于抗肿瘤功效，将肿瘤生长和存活作为读出。监测动物直至肿瘤攻击后第49天，相当于治疗开始后第42天。
如图14所示，相比于其各自的对照组(不相关的纳米抗体，第6组)，抗-GITR纳米抗体A023100101(第8组)和A023100118(第12组)有1/10的动物显示出肿瘤生长方面的延迟趋势，而相比于不相关的纳米抗体，抗-GITR纳米抗体A023100107(第10组)显著抑制肿瘤生长发展(p＝0.323)。与其各自的对照(huIgG1同种型，第4组)相比，抗-GITR纳米抗体-huIgG1嵌合体(第14组)显著抑制肿瘤生长(p<0.0001)，其中分别有5/10和3/10的动物显示出延迟的肿瘤生长发展和完全的肿瘤消退。类似地，确认DTA-1 mAb的抗肿瘤功效，其显示出肿瘤生长发展的显著抑制(p<0.0001)，其中3/10的动物具有完全消退。与对应的抗-PD-1 mAb对照组(第7组)相比，与抗-PD-1 mAb组合的抗-GITR纳米抗体A023100101(第9组；p<0.0022)和A023100107(第11组；p<0.0007)中观察到协同的肿瘤生长抑制。在第9组中，具有延迟的肿瘤生长的6只动物中有1只观察到完全消退，而在第11组中5只具有延迟的肿瘤生长的动物中有两只显示出完全消退。与huIgG1同种型对照(第5组)相比，抗-GITR纳米抗体-huIgG1嵌合体与抗-PD-1 mAb的组合(第15组)导致显著的肿瘤生长抑制(p<0.0001)。类似地，与第7组相比，与抗-PD-1 mAb组合的DTA-1 mAb显示出显著的抗肿瘤效应，5只动物显示出完全消退(p<0.0001)。
如图15所示，载体组1的中位生存时间(从治疗开始的)为15天，自第21天达到100％死亡。单独使用DTA-1治疗后的中位存活时间为34.5天，其中在治疗后第42天有40％存活(p<0.0001)，而使用DTA-1和抗-PD-1mAb的组合疗法得到34天的中位存活，其中60％的动物在治疗后第42天仍然存活(p＝0.0003)。抗-PD-1 mAb对照组5和7的中位生存为19.5天。抗-GITR纳米抗体单一疗法的存活分析对于A023100107具有显著性(p<0.0391)，其中中位存活为19.5天并且在第42天实现20％存活。在与抗-PD-1mAb组合的情况下，对于抗-GITR纳米抗体A023100101(第9组；p＝0.0026)和A023100107(第10组；p＝0.0056)的存活分析具有显著性，在第42天分别显示出50％和30％存活。与抗-PD-1 mAb组合的抗-GITR纳米抗体A023100118(第13组)导致28天的中位存活。使用抗-GITR纳米抗体-huIgG1嵌合体的单一疗法(第14组)显示出34.5天的中位存活时间和在第42天的40％存活(p<0.0001)，而使用抗-PD-1 mAb的组合疗法(第15组)导致中位存活时间为29.5天以及治疗后第42天30％的存活。
表11：治疗方案
Q1Dx1：治疗开始那天的单次注射；Q5Dx3：3次注射，每5天进行1次注射；Q2Dx10：10次注射，每2天进行1次注射。在组合的情况下：在抗-PD-1 mAb之后注射DTA-1、抗-GITR NB、抗-GITR NB-huIgG1嵌合体、不相关的NB或同种型对照mAb。
表A-9：单价抗-GITR纳米抗体的氨基酸序列(“ID”是指本文所用的SEQ ID NO)
表A-14：结合血清白蛋白的ISVD序列(“ID”是指本文所用的SEQ ID NO)
表A-15：接头序列(“ID”是指本文所用的SEQ ID NO)
等同物
上述书面说明书被认为足以使得本领域技术人员能够实施本发明。本发明不限于提供的实施例的范围内，因为实施例意在说明本发明的某些方面和实施方案。其它功能性等同实施方案在本发明的范围内。根据以上描述，除本文中显示和描述的那些修改之外的本发明的各种修改对本领域技术人员将是明显的，并且落入所附权利要求书的范围内。本发明的优点和目的不一定被本发明的每个实施方案所涵盖。