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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810612779.0 (22)申请日 2018.06.14 (71)申请人 浙江农林大学 地址 311300 浙江省杭州市临安区武肃街 666号 申请人 杭州野生动物世界有限公司 (72)发明人 杨仙玉贾宇坤张先福马敬华 施伟斌刘建勋 (74)专利代理机构 绍兴市知衡专利代理事务所 (普通合伙) 33277 代理人 施春宜 (51)Int.Cl. C12N 15/10(2006.01) (54)发明名称 动物线粒体DNA的纯化方法 (57)摘要 本申请涉及一种动物线粒体D。
2、NA的纯化方 法， 属于包含酶或微生物的测定或检测方法技术 领域。 将待检测动物组织中加入裂解液， 研磨成 浆后常温离心， 取上清液加入到DNA结合柱进行 纯化， 所述DNA结合柱表面偶联有带正电荷的二 乙胺乙醇亲水性树脂， 裂解处理后的浆液中的 DNA结合到DNA结合柱上并完成纯化， 纯化完毕的 DNA结合柱加入灭菌水中， 静置并常温离心， 即可 得到待检测动物的线粒体DNA； 所述裂解液中蛋 白酶K和RNaseA的浓度分别为20g/mL、 10g/ mL， 裂解温度为37， 裂解时间为5min-3h。 将本 申请应用于肉源的鉴定， 具有操作简便、 获取率 高、 成本低廉等优点。 权利要求书。
3、1页 说明书5页 CN 108728433 A 2018.11.02 CN 108728433 A 1.动物线粒体DNA的纯化方法， 其特征在于： 将待检测动物组织中加入裂解液， 常温下 研磨匀浆后离心， 取上清液加入到DNA结合柱进行纯化， 所述DNA结合柱表面偶联有带正电 荷的二乙胺乙醇亲水性树脂， 裂解处理后的浆液中的DNA结合到DNA结合柱上并完成纯化， 纯化完毕的DNA结合柱中加入灭菌水， 静置并常温离心， 即可得到待检测动物的线粒体DNA； 所述裂解液中蛋白酶K和RNase A的浓度分别为20 g/mL、 10 g/mL， 裂解温度为37， 裂解时 间为5min-3h。 2.如权利。
4、要求1所述的动物线粒体DNA的纯化方法， 其特征在于： 所述裂解液的处理时 间为5-20min。 3.如权利要求1所述的动物线粒体DNA的纯化方法， 其特征在于： 所述DNA结合柱的结合 时长为1-40min。 4.如权利要求1所述的动物线粒体DNA的纯化方法， 其特征在于， 所述裂解液的构成为： 150 mM NaCl； 10 mM Tris-HCl， pH8.0； 10 mM EDTA； 0.1% SDS； 20 g/mL蛋白酶K； 10 g/mL RNase A。 5.如权利要求4所述的动物线粒体DNA的纯化方法， 其特征在于： 所述NaCl预热至55， 加入对应比例的蛋白酶K和RNas。
5、e A现配形成裂解液。 6.如权利要求1所述的动物线粒体DNA的纯化方法， 其特征在于： 所述研磨匀浆时， 先将 待检测动物组织剪成块， 加入裂解液， 研磨完毕后， 再进行上下匀浆10-15次。 7.如权利要求1-6任一项所述的动物线粒体DNA的纯化方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： 在待检测动物组织中加入裂解液， 研磨匀浆后， 于37裂解， 然后常温离心； 取离心 上清液置于离心管中， 加入凝胶回收试剂盒的Buffer G； 取质粒回收试剂盒的DNA结合 柱置于收集管中， 并加入步骤中制备的溶液， 常温离心， 弃掉收集管中的液体； 此步骤再 重复一次； 加入凝胶回收试剂盒中的WS， 常温。
6、离心， 弃掉收集管中的液体； 加入凝胶回 收试剂盒的WG， 常温离心， 弃掉收集管中的液体； 此步骤再重复一次； 将DNA结合柱放回 收集管中， 常温离心； 迅速将DNA结合柱移至离心管中， 加入灭菌水， 静置后常温离心， 即 获得动物组织的线粒体DNA。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108728433 A 2 动物线粒体DNA的纯化方法 技术领域 0001 本申请涉及一种动物线粒体DNA的纯化方法， 属于包含酶或微生物的测定或检测 方法技术领域。 背景技术 0002 动物细胞中的DNA分布于两种细胞器， 一种是细胞核， 另一种是线粒体。 通常所说 的基因组DNA是指核DNA， 线粒体D。
7、NA则是线粒体中含有的DNA。 传统的细胞核DNA提取方法是 使用裂解液将切碎的动物组织进行研磨匀浆后进行长时间的蛋白酶K消化 （55/3 h或者 37/12 h） ， 以释放细胞核染色质中的DNA， 然后再通过酚/氯仿抽提法收集含有DNA的水 相， 最后通过加入乙醇或异丙醇使DNA发生沉淀， 获得细胞中含有的全部DNA。 线粒体DNA则 是将动物组织进行研磨匀浆， 释放细胞中的线粒体， 先是粗提线粒体， 再通过超速离心机纯 化线粒体， 然后再进行酚/氯仿抽提和乙醇或异丙醇沉淀法获得线粒体DNA。 0003 上述方法操作周期大约为8h， 同时操作过程对技术要求较高， 否则就会存在大量 的损耗，。
8、 因而， 并不适用于日常纯化提取。 0004 基于此， 做出本申请。 发明内容 0005 针对现有DNA获取纯化中所存在的上述缺陷， 本申请提供一种操作便捷、 获取率 高、 成本低廉的动物线粒体DNA的纯化方法。 0006 为实现上述目的， 本申请采取的技术方案如下： 动物线粒体DNA的纯化方法， 将待检测动物组织中加入裂解液， 常温研磨成浆后离心， 取上清液加入到DNA结合柱进行纯化， 所述DNA结合柱表面偶联有带正电荷的二乙胺乙醇 （DEAE） 亲水性树脂， 裂解处理后的浆液中的DNA结合到DNA结合柱上并完成纯化， 纯化完毕 的DNA结合柱中加入灭菌水， 静置并常温离心， 即可得到待检测。
9、动物的线粒体DNA； 所述裂解 液中蛋白酶K和RNase A的浓度分别为20 g/mL、 10 g/mL， 裂解温度为37， 裂解时间为 5min-3h。 0007 进一步的， 作为优选： 所述裂解液的处理时间为5-20min。 0008 所述DNA结合柱的结合时长为1-40min。 0009 所述裂解液的构成为： 150 mM NaCl； 10 mM Tris-HCl， pH8.0； 10 mM EDTA； 0.1% SDS； 20 g/mL蛋白酶K； 10 g/mL RNase A。 更优选的， 所述NaCl预热至55， 加入对应比例的 蛋白酶K和RNase A现配形成裂解液。 0010 。
10、所述研磨匀浆时， 先将待检测动物组织剪成块， 加入裂解液， 研磨完毕后， 再进行 上下匀浆10-15次。 0011 所述纯化方法包括以下步骤： 在待检测动物组织中加入裂解液， 研磨匀浆后， 于 37裂解， 然后常温离心； 取离心上清液置于离心管中， 加入凝胶回收试剂盒的Buffer 说明书 1/5 页 3 CN 108728433 A 3 G； 取质粒回收试剂盒的DNA结合柱置于收集管中， 并加入步骤中制备的溶液， 常温离 心， 弃掉收集管中的液体； 此步骤再重复一次； 加入凝胶回收试剂盒中的WS， 常温离心， 弃 掉收集管中的液体； 加入凝胶回收试剂盒的WG， 常温离心， 弃掉收集管中的液体。
11、； 此步骤 再重复一次； 将DNA结合柱放回收集管中， 常温离心； 迅速将DNA结合柱移至离心管中， 加入灭菌水， 静置后常温离心， 即获得动物组织的线粒体DNA。 0012 本申请的工作原理和有益效果分析如下： （1） 本申请借助于裂解液与DNA纯化柱的配合， 不仅实现了DNA的快速纯化， 还实现了经 济又快速获得动物大量基因片段的方法。 在此过程中， 团队成功克隆多个华南虎的基因片 段， 并根据与DNA数据库中的数据比对结果， 设计多对引物， 发现其中部分引物只能在华南 虎的模板中获得清晰的PCR产物， 通过严密的实验设计和实施， 确定了有两组引物可用于虎 肉、 虎毛等虎源组织的鉴定。 该。
12、检测方法从收到检测样品开始， 只需要2.5个小时2h即可完 成鉴定， 是至今为止最为快速的检测方法。 该方法可实现快速有效检测平台的搭建， 并可立 即用于虎源组织鉴定的实际和生产， 为海关执法、 鉴别野生动物来源、 对野生动物进行更好 的保护等提供了有利的技术支撑。 0013 （2） 本申请对不同处理温度和时间进行实验， DNA浓度检测和qPCR检测结果表明， 获得的总DNA的总量没有显著差异， 线粒体DNA的浓度也无统计学上的差异。 该实验重复多 次， 在所测试的样品中均十分成功， 再现性良好。 这个实验表明将动物组织研磨匀浆并进行 37进行较短时间处理即可进行抽提DNA， 完成该实验的时间。
13、较短， 再加上PCR的80 min， 动 物肉源性鉴定可在2 h内完成。 0014 （3） 通过酚/氯仿抽提法， 纯化动物组织DNA在2 h内完成。 而本申请在进行纯化DNA 时， 纯化柱表面偶联有带正电荷的二乙胺乙醇 （DEAE） 亲水性树脂， DNA磷酸基带负电荷， 因 此DNA可以结合到纯化柱上。 我们在进行对比实验时， 使用酚/氯仿抽提法和DNA纯化柱对动 物组织线粒体DNA分别进行纯化， DNA浓度检测表明两种方法获得的DNA浓度差别很大， 但是 qPCR检测结果表明， 两种方法获得的DNA中线粒体DNA的浓度无统计学上的差异。 这个实验 表明， 将组织研磨匀浆并进行37/10 mi。
14、n处理后， 通过DNA凝胶回收试剂盒中的Buffer G、 WS和WG以及该公司质粒回收试剂盒中的DNA结合柱， 可实现快速高效地获得动物动物组织 线粒体DNA， 全过程仅需35 min， 加上PCR 80 min， 动物肉源性鉴定在约2 h内完成。 因此， 将 动物组织前处理的样品使用DNA纯化柱进行纯化， 并去除大部分核DNA， 一方面可以缩短DNA 纯化的时间， 另一方面， 也可以避免使用具有强烈腐蚀性和致癌性的化学试剂苯酚和 氯仿， 减少了此类废液的产生。 具体实施方式 0015 我们前期对牛、 羊肉鉴定进行了实验， 此方法主要由两部分构成： DNA纯化 （需 要4-5 h） ， PC。
15、R （DNA聚合酶链式反应） 或qPCR （实时荧光定量PCR或称real-time PCR） ， 利 用自行设计的识别线粒体DNA片段的引物需80min。 简而言之， 由于DNA纯化需要长， 使该鉴 定方法的效率大打折扣。 鉴于此， 团队尝试了多种缩短纯化动物DNA的方法， 并以传统DNA纯 化方法为对照， 对不同方法纯化的DNA的质量通过qPCR进行了分析比较。 0016 一、 酚/氯仿纯化DNA方法 该方法是实验室最常用的动物组织DNA的纯化方法， 具体步骤如下： 说明书 2/5 页 4 CN 108728433 A 4 在50mg动物组织中加入1 mL裂解液 （150 mM NaCl，。
16、 10 mM pH8.0的Tris-HCl， 10 mM EDTA， 0.1% SDS， 20 g/mL 蛋白酶K， 10 g/mL RNase A） 进行研磨和匀浆， 然后进行55/3 h 或37过夜处理。 0017 16 000 g常温离心3 min， 取上清， 加入等体积的Tris-饱和酚； 取上层水相， 加入等体积1:1的酚氯仿混合液， 混匀后16 000 g常温离心3 min； 取上层水相， 加入等体积的氯仿， 混匀后16 000 g常温离心3 min； 取上层水相， 加入等体积预冷的异丙醇， 混匀后4 16 000 g离心20 min； 去上清， 在白色沉淀 （DNA） 中加入1 。
17、mL预冷的70%乙醇， 4 16 000 g离心5 min； 重复步骤； 去上清， 并尽可能将DNA沉淀周围的70%乙醇吸除； 将离心管置于50干式恒温器中， 待白色DNA周围开始变透明时加入120 L纯水使 DNA溶解， 即获得动物组织的全部DNA， 包括细胞核DNA和线粒体DNA。 0018 此法的优点在于省略了纯化线粒体的过程， 大大缩短和简化了获得DNA的时间； 不 足在于需要非常熟练的人员进行操作， 尽管并不影响肉源性的鉴定， 但很容易引入基因组 的DNA污染， 损耗较大。 0019 如前所述， 我们确立的动物源性的鉴定方法是识别线粒体DNA， 而不是核DNA。 而线 粒体位于细胞质。
18、中， 线粒体DNA与原核细胞的DNA一样是裸露于线粒体基质中， 因此， 理论上 通过上述裂解液处理细胞， 可以同时破坏细胞膜和线粒体膜。 换句话说， 纯化动物组织的线 粒体DNA不需要长时间蛋白酶K处理。 鉴于此， 团队尝试了缩短蛋白酶K处理时间， 并与高温 长时间处理的DNA纯化方式进行比较， 目的在于缩短操作时间， 同时获得没有核DNA污染的 线粒体DNA。 0020 本方法在传统的组织细胞裂解比对了三种裂解液对DNA回收量的影响， 仅加入 20 g/mL蛋白酶K， 仅加入10 g/mL RNase A， 同时加入20 g/mL蛋白酶K和10 g/mL RNase A。 结果表明效果最佳。。
19、 因此， 此后实验的裂解液中均加入10 g/mL RNase A。 0021 二、 不同处理温度和时间对动物组织DNA回收量的影响 在酚/氯仿抽提DNA方法中， 首先需要对样品进行方法55/3 h或37/过夜处理， 本方 法将样品处理的温度和时间调整为37/3 h或37/10 min。 酚/氯仿抽提DNA方法同上。 0022 本实验以农贸市场上购买的鲜牛肉和超市购买的冷冻羊肉为实验材料， 按55/3 h、 37/3 h以及37/10 min条件处理样品， 然后通过酚/氯仿方法进行DNA纯化。 DNA浓度 检测和qPCR检测结果表明， 三种处理方法获得的总DNA的总量没有显著差异， 线粒体DNA。
20、的 浓度也无统计学上的差异。 该实验重复多次， 在所测试的鲜牛肉和冻羊肉中均十分成功， 再 现性良好。 这个实验表明将动物组织研磨匀浆并进行3710 min处理即可进行酚/氯仿方 法抽提DNA， 完成该实验约需2 h。 0023 该方法的优点在于将动物组织DNA纯化的时间缩短至2 h， 不足在于该方法获得的 仍是动物组织的全部DNA， 包括细胞核DNA和线粒体DNA。 尽管如此， 由于缩短酚氯仿抽提前 的处理时间， DNA纯化的时间缩短至2 h， 再加上PCR的80 min， 动物肉源性鉴定可在3.5 h内 完成。 0024 三、 DNA纯化柱对动物组织线粒体DNA回收量的影响 通过酚/氯仿抽。
21、提法， 纯化动物组织DNA在2 h内完成。 目前， 市场上有多种DNA纯化试剂 说明书 3/5 页 5 CN 108728433 A 5 盒， 如质粒提取试剂盒和PCR产物纯化试剂盒， 还有DNA凝胶回收试剂盒。 这些试剂盒纯化 DNA的原理相同， 即纯化柱表面偶联有带正电荷的二乙胺乙醇(DEAE)亲水性树脂， DNA磷酸 基带负电荷， 因此DNA可以结合到纯化柱上。 如果将动物组织前处理的样品使用DNA纯化柱 进行纯化， 那么一方面可以缩短DNA纯化的时间， 另一方面， 可以避免使用具有强烈腐蚀性 和致癌性的化学试剂苯酚和氯仿， 也减少此类废液的产生。 在50 mg组织中加入1 mL裂解液研。
22、磨匀浆后分成两等分37/10 min， 然后16 000 g常温离心5 min。 0025 取750微升上清放入15 mL离心管中， 加入3倍体积杭州新景生物试剂开发公司 （Cat. No. 2001250） 凝胶回收试剂盒的Buffer G。 0026 取2个杭州新景生物试剂开发公司质粒回收试剂盒 （Cat. No. 1005250） 的DNA 结合柱组装到2 mL收集管中， 在每个结合柱中加入中制备的溶液750微升， 3 000 g常温 离心0.5 min， 弃掉收集管中的液体； 此步骤再重复一次。 0027 加入杭州新景生物试剂开发公司凝胶回收试剂盒 （Cat. No. 2001250）。
23、 中的 WS， 3 000 g常温离心0.5 min， 弃掉收集管中的液体。 0028 加入杭州新景生物试剂开发公司凝胶回收试剂盒 （Cat. No. 2001250） 的WG， 3 000 g常温离心0.5 min， 弃掉收集管中的液体； 此步骤再重复一次。 0029 将DNA结合柱放回2 mL收集管中， 16 000 g常温离心1 min。 0030 迅速将DNA结合柱移至1.5 mL离心管中， 加入60微升灭菌水， 静置1 min， 然后 16 000 g常温离心1 min， 即获得动物组织DNA。 0031 我们以市场上购买的鲜牛肉和超市购买的冷冻羊肉为实验材料， 使用酚/氯仿抽 提法。
24、和DNA纯化柱对动物组织线粒体DNA进行纯化。 DNA浓度检测表明两种方法获得的DNA浓 度差别很大， 但是qPCR检测结果表明， 两种方法获得的DNA中线粒体DNA的浓度无统计学上 的差异。 这个实验表明， 将组织研磨匀浆并进行37/10 min处理后， 通过东新景生物技术 有限公司的DNA凝胶回收试剂盒中的Buffer G、 WS和WG以及该公司质粒回收试剂盒中的DNA 结合柱， 实现快速高效地获得动物动物组织线粒体DNA。 全过程仅需35 min。 0032 该方法的优点在于： 将动物组织DNA纯化的时间缩短至35 min； 去除大部分核 DNA； 避免使用具有强烈腐蚀性和致癌性的苯酚和。
25、氯仿， 同时减少此类废液的产生。 0033 在建立该方法的过程中， 尝试使用杭州新景生物试剂开发公司的凝胶回收试剂盒 （Cat. No.： 2001250， 适用于回收70bp-10kb的DNA片段） 、 凝胶DNA回收试剂盒 （Cat. No. 2003050， 适用于回收1k0p-50kb的DNA片段） 和快速质粒DNA回收试剂盒 （Cat . No . 1005250） ， 以及碧云天生物技术研究所的PCR纯化试剂盒/DNA纯化试剂盒 （Cat. No. D0033） 和凝胶回收试剂盒 （Cat. No. D0056） 。 但是将杭州新景生物试剂开发公司的质粒回 收试剂盒 （Cat. N。
26、o. 1005250） 的DNA结合柱与该公司凝胶回收试剂盒 （Cat. No. 2001250， 适用于回收70bp-10kb的DNA片段） 的各种溶液结合使用效果最佳， 回收的线粒体DNA量与同 等组织使用酚/氯仿抽提法获得线粒体DNA的量无统计学上的差异。 业界人士都清楚， 牛羊 线粒体DNA的大小约16.5kb， 表明本杭州新景生物试剂开发公司的凝胶回收试剂盒 （Cat. No. 2001250， 适用于回收70bp-10kb的DNA片段） 可用于动物线粒体DNA的纯化。 0034 通过该方法， DNA纯化时间35 min， 加上PCR 80 min， 动物肉源性鉴定在约2 h内 完成。
27、。 说明书 4/5 页 6 CN 108728433 A 6 0035 综上所述， 截至目前团队尝试的获得动物组织线粒体的最佳方法如下： 在50 mg组织中加入1 mL裂解液研磨匀浆后分成两等分37/10 min， 然后16 000 g常温离心5 min。 0036 取750微升上清放入15 mL离心管中， 加入3倍体积杭州新景生物试剂开发公司 （Cat. No. 2001250） 凝胶回收试剂盒的Buffer G。 0037 取2个杭州新景生物试剂开发公司质粒回收试剂盒 （Cat. No. 1005250） 的DNA 结合柱组装到2 mL收集管中， 在每个结合柱中加入中制备的溶液750微升，。
28、 3 000 g常温 离心0.5 min， 弃掉收集管中的液体； 此步骤再重复一次。 0038 加入杭州新景生物试剂开发公司凝胶回收试剂盒 （Cat. No. 2001250） 中的 WS， 3 000 g常温离心0.5 min， 弃掉收集管中的液体。 0039 加入杭州新景生物试剂开发公司凝胶回收试剂盒 （Cat. No. 2001250） 的WG， 3 000 g常温离心0.5 min， 弃掉收集管中的液体； 此步骤再重复一次。 0040 将DNA结合柱放回2 mL收集管中， 16 000 g常温离心1 min。 0041 迅速将DNA结合柱移至1.5 mL离心管中， 加入60微升灭菌水，。
29、 静置1 min， 然后 16 000 g常温离心1 min， 即获得动物组织DNA。 0042 （1） 裂解液 化学组成： 使用注意事项： 150 mM NaCl， 预热至55， 使用前加入适量的蛋白酶K和RNaseA. 10 mM Tris-HCl （pH8.0） ， 10 mM EDTA， 0.1% SDS， 20 g/mL 蛋白酶K 10 g/mL RNase A （2） 研磨匀浆 称取100 mg动物物组织， 尽可能将其剪成小块， 然后放入研钵中， 加入2 mL 55预热 好的裂解液， 研磨约10 Sec， 然后将研磨液倒入2 mL的手动匀浆器中， 上下匀浆10-15次。 0043 以上内容是结合本发明创造的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详 细说明， 不能认定本发明创造具体实施只局限于上述这些说明， 对于本发明创造所属技术 领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明创造构思的前提下， 还可以做出若干简单推演 或替换， 都应当视为属于本发明创造的保护范围。 说明书 5/5 页 7 CN 108728433 A 7 。