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1、(10)申请公布号 CN 103864791 A (43)申请公布日 2014.06.18 CN 103864791 A (21)申请号 201410099713.8 (22)申请日 2014.03.18 C07D 473/18(2006.01) A61K 31/522(2006.01) A61P 31/12(2006.01) (71)申请人 福建天泉药业股份有限公司 地址 364000 福建省龙岩市新罗区莲庄路 28 号 (72)发明人 邓志明 朱靖华 邓志清 邓志平 徐广鑫 卢仲森 陈维林 罗炳华 (74)专利代理机构 厦门市首创君合专利事务所 有限公司 35204 代理人 钟善招 (54。
2、) 发明名称 一种恩替卡韦衍生物及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种恩替卡韦衍生物及其制 备方法， 该恩替卡韦衍生物的化学名称是 ： 2- 氨 基 -9-(1S， 3R， 4S)-4- 羟 基 -2- 亚 甲 基 环 戊 基 -1， 9- 二 氢 -6H- 嘌 呤 -6- 酮 -3- 甲 基 羟 基 -L- 缬氨酸酯， 简称缬恩替卡韦 ； 制备方法 是将 0.5-5 当量的 (S)-2-( 叔丁氧基羰基 - 氨 基 )-3- 甲基丁酸、 0.5-5 当量的二环己基碳化二 亚胺、 0.01-0.5当量的4-二甲氨基吡啶在二甲基 甲酰胺中与 0.5-5 当量的恩替卡韦反应 0.5-240。
3、 小时， 反应后通过硅胶柱层析分离纯化， 然后脱保 护得到目标产物。该方法制备的缬恩替卡韦具有 水溶性好、 靶向性好可实现高肝脏分布、 对其他器 官低毒性的优点， 是恩替卡韦的稳定前药。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103864791 A CN 103864791 A 1/1 页 2 1. 一种恩替卡韦衍生物， 其特征是 ： 该恩替卡韦衍生物的化学名称是 ： 2- 氨 基 -9-(1S， 3R， 4S)-4- 羟基 -2-。
4、 亚甲基环戊基 -1， 9- 二氢 -6H- 嘌呤 -6- 酮 -3- 甲基羟 基 -L- 缬氨酸酯， 简称缬恩替卡韦， 其化合物结构式为 ： 。 2. 根据权利要求 1 所述恩替卡韦衍生物， 其特征是 ： 以缬恩替卡韦作为有效药物成分， 优选一种或多种赋形剂或载体的缬恩替卡韦混合物， 用于治疗病毒性和相关疾病的药物组 合物。 3. 一种权利要求 1 所述恩替卡韦衍生物的制备方法， 其特征是 ： 按以下步骤操作 ： （1） 先制成 Boc 保护的缬氨酸恩替卡韦 将 0.5-5 当量的 (S)-2-( 叔丁氧基羰基 - 氨基 )-3- 甲基丁酸、 0.5-5 当量的二环己基 碳化二亚胺、 0.0。
5、1-0.5当量的4-二甲氨基吡啶在二甲基甲酰胺中与0.5-5当量的恩替卡韦 搅拌反应 0.5-240 小时 ； 反应完成后抽滤， 通过硅胶柱层析分离纯化， 得到 (S)-2-( 叔丁氧基羰基 - 氨 基 )-3- 甲基丁酸 - 恩替卡韦 ； （2） 脱保护得到缬氨酸恩替卡韦目标产物 将 (S)-2-( 叔丁氧基羰基 - 氨基 )-3- 甲基丁酸 - 恩替卡韦在乙酸乙酯溶剂中与盐酸 搅拌反应 ； 反应完成后， 用水分层， 用乙酸乙酯洗涤， 取水相， 用氨水调节pH至911， 析出大量絮 状沉淀， 固液分离后得到沉淀物并减压干燥， 获得 2- 氨基 -9-(1S， 3R， 4S)-4- 羟基 -2。
6、- 亚 甲基环戊基 -1， 9- 二氢 -6H- 嘌呤 -6- 酮 -3- 甲基羟基 -L- 缬氨酸酯白色固体目标产物。 4. 根据权利要求 2 所述恩替卡韦衍生物的制备方法， 其特征是 ： 所述制备 Boc 保护的 缬氨酸恩替卡韦的搅拌反应是在 90 100下进行的。 5. 根据权利要求 2 所述恩替卡韦衍生物的制备方法， 其特征是 ： 所述脱保护的搅拌反 应是在 50 70下进行的。 6. 根据权利要求 2 所述恩替卡韦衍生物的制备方法， 其特征是 ： 所述用氨水调节 pH 至 10。 权 利 要 求 书 CN 103864791 A 2 1/10 页 3 一种恩替卡韦衍生物及其制备方法 。
7、技术领域 0001 本发明涉及抗乙肝病毒药， 特别是嘌呤衍生物的氨基酸酯， 具体为恩替卡韦和 L- 缬氨酸合成的酯 ； 本发明还涉及该恩替卡韦衍生物的制备方法。 背景技术 0002 恩替卡韦为环氧羟碳脱氧鸟苷， 是一种能有效抑制乙肝病毒复制的脱氧鸟苷类似 物， 具有较强的抗 HBV 作用。体外试验中， 恩替卡韦极低浓度即可抑制 HBV 的复制， 而其细 胞毒性则很低， 有着十分优良的选择性治疗指数。 0003 然而由于乙肝需要长期治疗， 恩替卡韦 0.5-1.0mg/d 治疗 62-63 周后不良反应发 生率为 85% 左右， 严重不良反应发生率为 7%， 主要不良反应有 ： 头痛、 上呼吸道。
8、感染、 鼻咽 炎、 上腹痛、 疲劳、 发热、 恶心、 ALT 升高。不良反应涉及全身的多个器官组织， 这与恩替卡韦 给药后在体内的广泛的分布有关。 恩替卡韦的不良反应在一定程度上影响病人的给药顺应 性。 0004 本申请的发明人之一的在前申请并在公开号为 CN 101096370A 中公开了将恩替 卡韦与缬氨酸合成的酯及其合成方法， 但是未对其进行分离和结构鉴定， 仅提供了两个单 酯和双酯的混合物 （以下简称 “混合物” ） ， 且三者的比例未进行明确地测定。 0005 Beauchamp 等， Antiviral Chemistry & Chemotherapy 3, 157-164(199。
9、2) 公开 了抗疱疹药 acyclovir 的 18 种氨基酸酯和它们作为 acyclovir 前药的效力， 这是通过大 鼠中测定尿中 acyclovir 的回收来评价的。十种前药比 acyclovir 本身在尿中产生更多 的药 ： 甘氨酸酯、 D,L- 丙氨酸酯， L- 丙氨酸酯， L-2- 氨基丁酸酯， D,L- 缬氨酸酯， L- 缬氨 酸酯， D,L- 异亮氨酸酯， L- 异亮氨酸酯， L- 甲硫氨酸酯和 L- 脯氨酸酯。L- 氨基酸酯是比 相应的 D- 或 D,L- 异构体更好的前药， 这说明涉及立体选择性载体。该出版物的表 1 给出 了 18 种氨基酸酯的化学数据和口服生物利用度， 。
10、从中可以看出 D- 氨基酸酯的生物利用 度低于 acyclovir 本身。这样， 因为 D- 氨基酸酯对 acyclovir 没有好处， 它们无法作为 acyclovir 的前药。但 acyclovir 的非手性甘氨酸酯的生物利用度高于 acyclovir （在尿中 回收率检测中， 给予甘氨酸酯时回收到 30% 的 acyclovir， 而给予 acyclovir 时回收到 19% 的 acyclovir） 。在所研究的酯中， acyclovir 的 L- 缬氨酸酯是最好的前药。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种水溶性好、 靶向性好以实现高肝脏分布、 对其他器官低 毒性的恩替卡韦的稳。
11、定前药及其制备方法。 0007 为实现以上目的， 本发明一种恩替卡韦衍生物及其制备方法， 该恩替卡韦衍生物 的化学名称是 ： 2- 氨基 -9-(1S， 3R， 4S)-4- 羟基 -2- 亚甲基环戊基 -1， 9- 二氢 -6H- 嘌 呤 -6- 酮 -3- 甲基羟基 -L- 缬氨酸酯， 简称缬恩替卡韦， 该缬恩替卡韦化合物结构式为 ： 说 明 书 CN 103864791 A 3 2/10 页 4 以缬恩替卡韦作为有效药物成分， 优选一种或多种赋形剂或载体的缬恩替卡韦混合 物， 用于治疗病毒性和相关疾病的药物组合物。 0008 上述缬恩替卡韦的制备方法是 ： （1） 先制成 Boc 保护的。
12、缬氨酸恩替卡韦 将 0.5-5 当量的 (S)-2-( 叔丁氧基羰基 - 氨基 )-3- 甲基丁酸、 0.5-5 当量的二环己基 碳化二亚胺、 0.01-0.5当量的4-二甲氨基吡啶在二甲基甲酰胺中与0.5-5当量的恩替卡韦 搅拌反应 0.5-240 小时 ； 反应完成后抽滤， 通过硅胶柱层析分离纯化， 得到 (S)-2-( 叔丁氧基羰基 - 氨 基 )-3- 甲基丁酸 - 恩替卡韦， 即 Boc 保护的缬氨酸恩替卡韦 ； （2） 脱保护得到缬氨酸恩替卡韦目标产物 将 (S)-2-( 叔丁氧基羰基 - 氨基 )-3- 甲基丁酸 - 恩替卡韦在乙酸乙酯溶剂中与盐酸 搅拌反应 ； 反应完成后， 用。
13、水分层， 用乙酸乙酯洗涤， 取水相， 用氨水调节pH至911， 析出大量絮 状沉淀， 固液分离后得到沉淀物并减压干燥， 获得 2- 氨基 -9-(1S， 3R， 4S)-4- 羟基 -2- 亚 甲基环戊基 -1， 9- 二氢 -6H- 嘌呤 -6- 酮 -3- 甲基羟基 -L- 缬氨酸酯白色固体目标产物。 0009 合成路线如下 ： 说 明 书 CN 103864791 A 4 3/10 页 5 所述制备 Boc 保护的缬氨酸恩替卡韦的搅拌反应是在 90 100下进行的。 0010 所述脱保护的搅拌反应是在 50 70下进行的。 0011 所述用氨水调节 pH 至 10。 0012 经核磁共振。
14、氢谱、 核磁共振碳谱、 二维核磁共振谱和高分辨质谱分析， 确证合成出 的产物为上述目标结构的化合物。 0013 本发明的缬恩替卡韦与恩替卡韦和 CN 101096370A 中公开的 “混合物” 相比具有 以下显著优势 ： 说 明 书 CN 103864791 A 5 4/10 页 6 （1） 缬恩替卡韦在目标靶器官肝脏中比恩替卡韦具有明显较高的肝脏分布， 这与缬氨 酸酯在肝脏中相对缓慢酶解释放有关， 这提高了靶器官肝脏中母体药物的浓度， 同时降低 了恩替卡韦的其他器官分布， 从而取到一定的靶向作用， 降低其对其他器官的毒副作用 ； （2） 缬恩替卡韦比 “混合物” 在尿中回收的活性成分 （恩替。
15、卡韦） 明显较多， 研究表明， CN 101096370A 中公开的另一个单酯 （环戊烯上羟基成酯） 大部分以原型药物在尿中回收， 这可能与该位点较难水解有关， 因此该单酯降低了肝脏中活性成分的浓度， 对发明不利 ； （3） 对恩替卡韦进行结构修饰后， 降低了恩替卡韦的胃肠道刺激作用 ； （4） 缬恩替卡韦在体内酶解释放相对平缓， 这降低了肾脏的一过性代谢负担， 降低了恩 替卡韦原有的肾脏毒性。 0014 本发明提供的缬恩替卡韦是一种改进了水溶性的低毒性、 高肝脏分布的恩替卡韦 的稳定前药， 这些特征对乙型肝炎病人特别有利， 降低了长期服药的毒副作用， 有效剂量更 低 ； 另外， 活性成分显示。
16、使其药物加工特征得以改善的药典性能。 0015 本申请人研究发现， 恩替卡韦缬氨酸单酯主要分布于目标靶器官肝脏， 提高了针 对肝炎病毒的靶向性， 同时降低了恩替卡韦对全身的不良反应 ； 此外， 本发明提供的缬恩 替卡韦合成方法对于合成目标产物具有高度的选择性， 所采用 Boc 保护的缬氨酸易于脱保 护， 用盐酸水溶液搅拌即可脱保护， 脱保护条件温和。 0016 本发明提供了缬恩替卡韦的高度选择性的合成方法， 生成的中间体易于分离纯 化， 且选择的保护基在温和条件下即可脱保护， 这对于提高终产品的纯度， 制备出达到药用 质量的原料药特别有利。 0017 本发明提供的缬恩替卡韦合成方法比 CN 1。
17、01096370A 公开的方法具有下述显著 优势 ： （1） 本发明提供的合成方法选择性明显较高， 主要生成了目标产物， 另一个单酯 （ “异构 体” ） 和双酯含量少。 0018 （2） 本发明提供的氨基酸保护基更易于去除， 避免了催化氢化， 催化氢化在工业上 较难放大， 且危险性大， 易爆炸， 使用的钯碳催化剂亦较贵。 0019 四、 附图说明 图 1 是本发明一种恩替卡韦衍生物及其制备方法的缬恩替卡韦高分辨质谱图。 0020 图 2 是本发明之缬恩替卡韦的 1H-NMR 谱。 0021 图 3 是本发明之缬恩替卡韦的 13C-NMR 谱。 0022 图 4 是本发明之缬恩替卡韦的氢氢相关。
18、 （1H-1HCOSY） 谱。 0023 图 5 是本发明之缬恩替卡韦的 HMBC 谱。 0024 图 6 是本发明之缬恩替卡韦的 HSQC 谱。 0025 图 7 是 CN 101096370A 公开的混合物高效液相色谱图， 图中对应的有关参数如下 表 ： 峰 保留时间物质 12.952未知 210.628恩替卡韦 322.169缬恩替卡韦 422.763异构体 （另一个单酯， 环戊烯环上羟基成酯） 527.748双酯 图 8 是本发明之缬恩替卡韦的高效液相色谱图 ： 说 明 书 CN 103864791 A 6 5/10 页 7 峰 保留时间物质 122.505缬恩替卡韦 223.075异。
19、构体 （另一个单酯， 环戊烯环上羟基成酯） 图 8 中对应的有关参数如上表。 0026 五、 具体实施方式 一下通过附图和具体实施方式对本发明一种恩替卡韦衍生物及其制备方法作进一步 详细说明。 0027 本发明一种恩替卡韦衍生物及其制备方法， 该恩替卡韦衍生物的化学名称是 ： 2- 氨基 -9-(1S， 3R， 4S)-4- 羟基 -2- 亚甲基环戊基 -1， 9- 二氢 -6H- 嘌呤 -6- 酮 -3- 甲基 羟基 -L- 缬氨酸酯， 简称缬恩替卡韦， 该缬恩替卡韦化合物结构式为 ： 以下通过三个实施例来说明缬恩替卡韦的制备方法。 0028 实施例 1 1、 (S)-2-( 叔丁氧基羰基 。
20、- 氨基 )-3- 甲基丁酸 - 恩替卡韦的制备 取恩替卡韦 ： 60.9g， 加二甲基甲酰胺 1250mL， 振摇使溶解。 0029 取 (S)-2-( 叔丁氧基羰基 - 氨基 )-3- 甲基丁酸 ： 104.2g、 二环己基碳化二亚胺 ： 69.6g、 4- 二甲氨基吡啶 ： 8.2g， 加二甲基甲酰胺 1250mL， 搅拌 60min， 加入上述恩替卡韦溶 液， 100搅拌反应 24h。 0030 反应完成后， 抽滤， 滤液加硅胶 650g， 至 90水浴上炒干。 0031 取硅胶2900g， 装柱， 将炒干硅胶装于柱上， 用甲醇-乙酸乙酯 （10:90） 洗过， 每12L 为一份收集。。
21、 TLC监测流分， 合并含有目标产物的流分， 减压蒸干， 即得到(S)-2-(叔丁氧基 羰基 - 氨基 )-3- 甲基丁酸 - 恩替卡韦， 即 Boc 保护的缬氨酸恩替卡韦。 0032 、 2- 氨 基 -9-(1S， 3R， 4S)-4- 羟 基 -2- 亚 甲 基 环 戊 基 -1， 9- 二 氢 -6H- 嘌 呤 -6- 酮 -3- 甲基羟基 -L- 缬氨酸酯的制备 取 (S)-2-( 叔丁氧基羰基 - 氨基 )-3- 甲基丁酸 - 恩替卡韦 ： 54g， 加乙酸乙酯 1100mL， 加 3M 盐酸 270mL， 60下搅拌反应 24h。 0033 反应完成后， 加入水 500ml， 分。
22、出下层， 用乙酸乙酯洗涤 4 次 （4500ml） ， 取水相， 用氨水调节 pH 至约 10， 析出大量絮状沉淀， 倾出上清液， 离心， 将得到的沉淀 50减压干 燥， 得到白色固体目标产物。 0034 图 1 所示得到的目标产物高分辨质谱 （+ESI， m/z） ： 377.1935M+H+； 说 明 书 CN 103864791 A 7 6/10 页 8 图 2 所示得到的目标产物 1H-NMR (D 2O,600 MHz): 8.82 (s, 1H), 5.58 (t, 1H J = 8.4 Hz), 5.41 (s, 1H), 5.05 (s, 1H), 4.47 (m, 2H, J。
23、 = 6.2, 7.9 Hz), 4.38 (q, 1H, J = 4.1, 4.8 Hz), 4.03 (d, 1H, J = 4.6 Hz), 2.97 (br s, 1H), 2.53 (m, 1H, J = 5.5, 8.6 Hz), 2.32 (m, 1H), 2.30 (m, 1H), 0.97 (s, 3H), 0.94 (s, 3H) ； 图 3 所示得到的目标产物 13C-NMR (D 2O, 150 MHz): 169.9, 155.0, 149.8, 145.1, 136.9, 114.7, 108.2, 71.3, 66.4, 58.4, 58.0, 49.7, 37.。
24、7, 29.3, 17.4, 17.0 ； 图 4 图 6 所示目标产物二维核磁 1H-1HCOSY、 HMBC 和 HMQC 谱。 0035 从图 1 图 6 可以确证该目标产物即为恩替卡韦的环戊烯上的烷基羟基成酯， 从 而确证目标化合物为缬恩替卡韦。 0036 实施例 2 1、 (S)-2-( 叔丁氧基羰基 - 氨基 )-3- 甲基丁酸 - 恩替卡韦的制备 取恩替卡韦 ： 60.9g， 加二甲基甲酰胺 2500mL， 振摇使溶解。 0037 取 (S)-2-( 叔丁氧基羰基 - 氨基 )-3- 甲基丁酸 ： 52.1g、 二环己基碳化二亚胺 ： 34.8g、 4- 二甲氨基吡啶 ： 4.1。
25、g， 加二甲基甲酰胺 2500mL， 搅拌 30min， 加入上述恩替卡韦溶 液， 100搅拌反应 1h。 0038 反应完成后， 抽滤， 滤液加硅胶 650g， 至 90水浴上炒干。 0039 取硅胶2900g， 装柱， 将炒干硅胶装于柱上， 用甲醇-乙酸乙酯 （10:90） 洗过， 每12L 为一份收集。 TLC监测流分， 合并含有目标产物的流分， 减压蒸干， 即得(S)-2-(叔丁氧基羰 基 - 氨基 )-3- 甲基丁酸 - 恩替卡韦。 0040 、 2- 氨 基 -9-(1S， 3R， 4S)-4- 羟 基 -2- 亚 甲 基 环 戊 基 -1， 9- 二 氢 -6H- 嘌 呤 -6-。
26、 酮 -3- 甲基羟基 -L- 缬氨酸酯的制备 取 (S)-2-( 叔丁氧基羰基 - 氨基 )-3- 甲基丁酸 - 恩替卡韦 ： 54g， 加乙酸乙酯 500mL， 加 3M 盐酸 140mL， 60下搅拌反应 24h。 0041 反应完成后， 加入水 500ml， 分出下层， 用乙酸乙酯洗涤 4 次 （4500ml） ， 取水相， 用氨水调节 pH 至约 10， 析出大量絮状沉淀， 倾出上清液， 离心， 将得到的沉淀 50减压干 燥， 得到缬恩替卡韦白色固体。 0042 实施例 3 1、 (S)-2-( 叔丁氧基羰基 - 氨基 )-3- 甲基丁酸 - 恩替卡韦的制备 取恩替卡韦 ： 60.9。
27、g， 加二甲基甲酰胺 1250mL， 振摇使溶解。 0043 取 (S)-2-( 叔丁氧基羰基 - 氨基 )-3- 甲基丁酸 ： 208.4g、 二环己基碳化二亚胺 ： 139.2g、 4- 二甲氨基吡啶 ： 16.4g， 加二甲基甲酰胺 1250mL， 搅拌 60min， 加入上述恩替卡韦 溶液， 100搅拌反应 72h。 0044 反应完成后， 抽滤， 滤液加硅胶 650g， 至 90水浴上炒干。 0045 取硅胶2900g， 装柱， 将炒干硅胶装于柱上， 用甲醇-乙酸乙酯 （10:90） 洗过， 每12L 为一份收集。 TLC监测流分， 合并含有目标产物的流分， 减压蒸干， 即得(S)-。
28、2-(叔丁氧基羰 基 - 氨基 )-3- 甲基丁酸 - 恩替卡韦。 0046 、 2- 氨 基 -9-(1S， 3R， 4S)-4- 羟 基 -2- 亚 甲 基 环 戊 基 -1， 9- 二 氢 -6H- 嘌 呤 -6- 酮 -3- 甲基羟基 -L- 缬氨酸酯的制备 说 明 书 CN 103864791 A 8 7/10 页 9 取 (S)-2-( 叔丁氧基羰基 - 氨基 )-3- 甲基丁酸 - 恩替卡韦 ： 54g， 加乙酸乙酯 2200mL， 加 3M 盐酸 540mL， 60下搅拌反应 24h。 0047 反应完成后， 加入水 500ml， 分出下层， 用乙酸乙酯洗涤 4 次 （4500。
29、ml） ， 取水相， 用氨水调节 pH 至约 10， 析出大量絮状沉淀， 倾出上清液， 离心， 将得到的沉淀 50减压干 燥， 得到缬恩替卡韦白色固体。 0048 下面通过试验例对本发明提供的缬恩替卡韦的靶向性、 毒性以及本发明提供的合 成方法的选择性作进一步比较说明。 0049 试验例 1 大鼠体内分布 给大鼠口服试验化合物后， 测定肝脏中的代谢物浓度， 测定缬恩替卡韦 + 恩替卡韦 （体 内代谢产物， 活性成分） 的总和。 0050 对大鼠 （雌雄各半， 每组 24 只） 口服给予试验化合物 （10mg/kg） 。在给药后 0.5、 4、 24 和 48h 各收集 6 只大鼠的肝脏， 匀浆。
30、， 取肝脏匀浆 （0.5ml） 中加入作为内标物的 1g/ml 浓度的 2- 羟基苯乙酮 （0.25ml） 以及 10mM 磷酸钾缓冲液 （pH 4.5， 0.25ml） 和甲醇 （0.5ml） ， 在 203搅拌。向其中加入异丙醇 / 氯仿 （1:9） 混合物 （8ml） 后， 振荡， 将缬恩替卡韦、 恩 替卡韦和内标物萃取到溶剂相。通过低速离心 （1500g、 15 分钟） 使水相与溶剂相分离， 用氮 气干燥适当量的下层溶剂相。再将其溶解在 HPLC 流动相 （0.25ml） 中。另外， 将已知量的 缬恩替卡韦和恩替卡韦加到大鼠血对照血浆中， 进行同样的萃取操作。以试样中缬恩替卡 韦、 恩。
31、替卡韦和内标物的面积比为y轴， 以添加的缬恩替卡韦、 恩替卡韦浓度为x轴， 作校准 曲线。由该校准曲线算出试样中缬恩替卡韦 + 恩替卡韦的浓度， 从而定量。 0051 HPLC 条件 色谱柱 ： Waters Symetry C18（4.6250mm） 流动相 ： 乙腈 / 异丙醇 / 水 / 三氟乙酸 （10/12/78/0.01） 流速 ： 1.0ml/min 检测波长 ： UV 240nm 进样量 ： 30l 结果如表 1 所示。表中 “缬恩替卡韦”表示实施例 1 制备的 2- 氨基 -9-(1S， 3R， 4S)-4- 羟基 -2- 亚甲基环戊基 -1， 9- 二氢 -6H- 嘌呤 -。
32、6- 酮 -3- 甲基羟基 -L- 缬氨酸酯 （纯度 99.208%， 如图 8 所示） 。 0052 表 1 大鼠口服给药后的肝脏中缬恩替卡韦 + 恩替卡韦的浓度 上述结果表明通过将恩替卡韦变成恩替卡韦 -L- 缬氨酸酯， 肝脏中的分布明显较大。 说 明 书 CN 103864791 A 9 8/10 页 10 0053 试验例 2 尿中回收的药物 对大鼠 （雌雄各半， 每组 10 只） 口服给予试验化合物 （10mg/kg） 。在给药后 48h 收集大 鼠的尿液， 冻干后， 将其溶解在甲醇 - 水 （1:1） 5ml 中， 通过外标法测定尿液中恩替卡韦的 量。 0054 HPLC 条件 色。
33、谱柱 ： Agilent C18（2504.6mm， 5m） 流动相 A ： 0.02M 磷酸二氢钠， 用磷酸调节 pH 至 4.6 流动相 B ： 甲醇 梯度洗脱， 梯度条件如下 ： 时间 流动相 A 流动相 B 090%10% 1090%10% 2020%80% 3020%80% 3590%10% 4090%10% 流速 ： 1.0ml/min 检测波长 ： 240nm 柱温 ： 40 进样体积 ： 10L 结果如表 2 所示。表中， 回收率是指尿液中测得的药物量与给药量相比的回收率。表 中 “缬恩替卡韦” 表示实施例 1 的 2- 氨基 -9-(1S， 3R， 4S)-4- 羟基 -2-。
34、 亚甲基环戊基 -1， 9- 二氢 -6H- 嘌呤 -6- 酮 -3- 甲基羟基 -L- 缬氨酸酯 （纯度 99.208%， 如附图 8 所示） ，“混合 物” 表示公开号 CN 101096370A 制备的两个单酯和双酯的混合物 （两个单酯和双酯的混合 物， 如附图 7 所示） 。 0055 表 2 大鼠口服给药后尿中回收率 试验化合物n回收率 缬恩替卡韦10 73.5% 混合物10 42.1% 恩替卡韦10 62.6% 上述结果表明混合物中由于含有较多的不易水解的环戊烯环上羟基酯， 尿中活性成分 恩替卡韦的回收率明显较低。 0056 试验例 3 急性毒性试验 取 CD-1 小鼠 （18-2。
35、5g， 雌雄各半， 5 只 / 性别 / 组） ， 单次口服给予剂量水平 200（低剂 量） 、 1000（中剂量） 或 5000mg/kg（高剂量） 的试验化合物， 在给药后 2 周内， 每日观察致死 率和临床体征。 0057 结果如表3所示。 表中， 以a （b+c） 表示， 其中a表示死亡动物总数， b表示死亡的雄 性动物数， c 表示死亡的雌性动物数。表中 “缬恩替卡韦” 表示实施例 1 的 2- 氨基 -9-(1S， 3R， 4S)-4- 羟基 -2- 亚甲基环戊基 -1， 9- 二氢 -6H- 嘌呤 -6- 酮 -3- 甲基羟基 -L- 缬氨酸 酯 （纯度 99.208%， 如附图。
36、 8 所示） ，“混合物” 表示按照公开号 CN 101096370A 制备的两个单 说 明 书 CN 103864791 A 10 9/10 页 11 酯和双酯的混合物 （两个单酯和双酯的混合物， 如附图 7 所示） 。 0058 表 3 急性毒性试验结果 试验化合物n低剂量中剂量高剂量 缬恩替卡韦10（5+5）0（0+0）1（1+0）6（3+3） 混合物10（5+5）0（0+0）2（2+0）7（3+4） 恩替卡韦10（5+5）0（0+0）4（2+2）9（4+5） 上述结果表明缬恩替卡韦的毒性明显低于恩替卡韦。 0059 试验例 4 合成方法的选择性比较 试验 （1） ： 取恩替卡韦 ： 6。
37、0.9g， 加二甲基甲酰胺 1250mL， 振摇使溶解。 0060 取 (S)-2-( 叔丁氧基羰基 - 氨基 )-3- 甲基丁酸 ： 104.2g、 二环己基碳化二亚胺 ： 69.6g、 4- 二甲氨基吡啶 ： 8.2g， 加二甲基甲酰胺 1250mL， 搅拌 60min， 加入上述恩替卡韦溶 液， 100搅拌反应 24h， 取反应液， 进样 HPLC 进行分析。 0061 试验 （2） ： 此外， 按照公开号 CN 101096370A 的制备方法， 将 N- 苄氧羰基 - 缬氨酸与恩替卡韦反 应， 反应后取反应液， 进样 HPLC 进行分析。 0062 结果如表 4 所示。表中 “恩替卡。
38、韦” 表示未反应的恩替卡韦，“目标产物” 表示目标 羟基 （环戊烯上的烷基羟基） 取代的单酯，“异构体” 表示非目标羟基 （环戊烯上的羟基） 取代 的单酯，“双酯” 表示两个羟基均取代的双酯。 0063 表 4 反应选择性试验结果 （面积归一化） 试验恩替卡韦目标产物异构体 双酯 试验 （1）0.4%87.3%3.2%9.1% 试验 （2）3.1%40.2%36.1%20.6% 上述结果表明本发明的合成方法具有明显好的选择性。 0064 本发明可制成各种制剂， 如制剂例 1 4 ： 制剂例 1 硬胶囊剂 混合0.5mg 缬恩替卡韦、 179.2mg乳糖、 70mg微晶纤维素和1.3mg硬脂酸镁。
39、， 通过60目 筛后， 将这些粉末装入 250mg 的 3 号明胶胶囊制成胶囊剂。 0065 制剂例 2 片剂 混合 0.5mg 缬恩替卡韦、 174mg 乳糖、 25mg 微晶纤维素和 1mg 硬脂酸镁， 通过压片机压 片， 制成 1 片 200mg 的片剂。 0066 根据需要可以对该片剂进行包衣。 0067 制剂例 3 溶液剂 取 0.5mg 缬恩替卡韦、 蔗糖 12mg、 苯甲酸钠 0.2mg， 加入注射用水 2ml， 用 0.1N 盐酸调 节 pH 至约 6， 经 0.22m 滤膜过滤， 装入玻璃瓶， 121高压灭菌 10min， 即得。 0068 制剂例 4 注射液 说 明 书 CN 103864791 A 11 10/10 页 12 取 0.5mg 缬恩替卡韦， 加入生理盐水 2ml， 用 0.1N 盐酸调节 pH 至约 6， 经 0.22m 滤膜 过滤， 装入安瓿瓶， 121高压灭菌 15min， 即得。 说 明 书 CN 103864791 A 12 1/4 页 13 说 明 书 附 图 CN 103864791 A 13 2/4 页 14 说 明 书 附 图 CN 103864791 A 14 3/4 页 15 说 明 书 附 图 CN 103864791 A 15 4/4 页 16 说 明 书 附 图 CN 103864791 A 16 。