一种提取蚯蚓的多种酶及蛋白的方法.pdf

一种提取蚯蚓的多种酶及蛋白的方法，将处理干净的鲜蚯蚓搅碎得浆料，再将浆料离心取上清液；将上清液进行膜过柱后的截留液冷冻干燥得蚓激酶和超氧化物歧化酶；将滤过液再进行膜过柱，截留液冷冻干燥得蚯蚓蛋白；再将滤过液进行膜过柱，截留液进行喷雾干燥，得蚯蚓多肽。本发明提取方法一次性顺次操作，即可分别得到蚓激酶、超氧化物歧化酶、蚯蚓蛋白和蚯蚓多肽，提取方法简单，易操作。提取过程不采用有机溶剂，节省大量成本投入，而且提取的有机化合物质量好，适用于工业化生产。蚓激酶可用来制作溶栓及厂家制药；蚯蚓SOD可应用于各种生化试剂、美容保健；蚯蚓蛋白应用于各种食品，化妆品，以及饲料；蚯蚓多肽应用于人体保健及各种饮料制品。

1.  一种提取蚯蚓的多种酶及蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、将鲜蚯蚓处理干净后，加入水中，搅碎得浆料，再将浆料离心取上清液；
步骤二、将步骤一得到的上清液进行膜过柱操作，采用截留分子量为1万至5万道尔顿的超滤膜进行超滤，得截留液Ⅰ和滤过液Ⅰ，将截留液Ⅰ分为两份，分别提纯后冷冻干燥，得蚓激酶和超氧化物歧化酶；
步骤三、将滤过液Ⅰ再进行膜过柱操作，采用截留分子量大于5万道尔顿的超滤膜进行超滤，得截留液Ⅱ和滤过液Ⅱ，将截留液Ⅱ冷冻干燥，得蚯蚓蛋白；
步骤四、将滤过液Ⅱ进行膜过柱操作，采用截留分子量小于5万道尔顿的超滤膜进行超滤，得截留液Ⅲ，将截留液Ⅲ进行喷雾干燥，得蚯蚓多肽；
完成蚯蚓的提取。

2.  根据权利要求1所述的一种提取蚯蚓的多种酶及蛋白的方法，其特征在于：步骤一中，将鲜蚯蚓处理干净的具体操作如下：将鲜蚯蚓清洗后，置于水中浸泡24小时，待鲜蚯蚓吐泥完全后，再清洗干净即可。

3.  根据权利要求1或2所述的一种提取蚯蚓的多种酶及蛋白的方法，其特征在于：步骤一中，所述的离心的条件为：采用管式分离机，以12000rpm的转速离心。

4.  根据权利要求3所述的一种提取蚯蚓的多种酶及蛋白的方法，其特征在于：所述管式分离机采用中空纤维分离膜芯。

5.  根据权利要求3所述的一种提取蚯蚓的多种酶及蛋白的方法，其特征在于：所述管式分离机采用分离型管式分离机。

一种提取蚯蚓的多种酶及蛋白的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种蚯蚓的提取方法。
背景技术
蚯蚓又名地龙，蚯蚓干蛋白质含量达到70％，是制备药品、化妆品、保健食品等的原料，具有很大的经济价值。蚯蚓的化学成分种类繁多，结构复杂，大多为高分子有机化合物，目前被人们研究最多的是蚯蚓多肽，然而其他的有机化合物就被忽略而浪费了，蚯蚓的经济价值没有被最大化的挖掘出来。因此，亟需提供一种提取方法，能将蚯蚓的多种有用的有机化合物提取出来，使蚯蚓的经济价值最大化。
发明内容
针对现有技术的上述缺陷和问题，本发明的目的是提供一种蚯蚓的提取方法，提取方法简单，易操作，能同时分别将蚓激酶、超氧化物歧化酶、蚯蚓蛋白和蚯蚓多肽提取出来，充分利用了蚯蚓，使蚯蚓的经济价值最大化。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种提取蚯蚓的多种酶及蛋白的方法，包括以下步骤：
步骤一、将鲜蚯蚓处理干净后，加入水中，搅碎得浆料，再将浆料离心取上清液；
步骤二、将步骤一得到的上清液进行膜过柱操作，采用截留分子量为1万至5万道尔顿的超滤膜进行超滤，得截留液Ⅰ和滤过液Ⅰ，将截留液Ⅰ分为两份，分别提纯后冷冻干燥，得蚓激酶和超氧化物歧化酶；
步骤三、将滤过液Ⅰ再进行膜过柱操作，采用截留分子量大于5万道尔顿的超滤膜进行超滤，得截留液Ⅱ和滤过液Ⅱ，将截留液Ⅱ冷冻干燥，得蚯蚓蛋白；
步骤四、将滤过液Ⅱ进行膜过柱操作，采用截留分子量小于5万道尔顿的超滤膜进行超滤，得截留液Ⅲ，将截留液Ⅲ进行喷雾干燥，得蚯蚓多肽；
完成蚯蚓的提取。
进一步地，步骤一中，将鲜蚯蚓处理干净的具体操作如下：将鲜蚯蚓清洗后，置于水中浸泡24小时，待鲜蚯蚓吐泥完全后，再清洗干净即可。
进一步地，步骤一中，所述的离心的条件为：采用管式分离机，以12000rpm(转/分钟)的转速，离心。
进一步地，所述管式分离机采用中空纤维分离膜芯。
具体地，所述管式分离机采用分离型管式离心机。具体如型号为GF105的管式分离机。
本发明的一种提取蚯蚓的多种酶及蛋白的方法，一次性顺次操作，即可分别得到蚓激酶、超氧化物歧化酶、蚯蚓蛋白和蚯蚓多肽，提取方法简单，易操作。而且，本发明的提取方法中不采用有机溶剂，节省大量成本投入，而且提取的有机化合物质量好，适用于工业化生产。
本发明提取得到蚓激酶具有溶解血凝块的功效，且其比活力可达到30000单位，可以用来制作溶栓及厂家制药。蚯蚓SOD的酶活力可以达到26.0U/mL，因此可以应用于各种生化试剂、美容保健。蚯蚓蛋白提取物中蛋白含量达到6％，可以补充人体蛋白的缺乏，应用于各种食品，化妆品，以及饲料等。蚯蚓多肽提取物中多肽的含量达到38mg/mL，用于应用于人体保健及各种饮料制品。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的具体实施方式的一种蚯蚓的提取方法，包括以下步骤：
步骤一、将鲜蚯蚓清洗后，置于水中浸泡24小时，待鲜蚯蚓吐泥完全后，再清洗2-4遍，将鲜蚯蚓处理干净；然后将处理干净的鲜蚯蚓加入水中，搅碎得浆料；再将浆料采用分离型中空纤维分离膜芯的管式分离机(例如，型号为GF105的管式分离机)，以12000rpm(转/分钟)的转速，进行离心，取上清液。
步骤二、将步骤一得到的上清液进行膜过柱操作，采用截留分子量为1万至5万道尔顿的超滤膜进行超滤，得截留液Ⅰ和滤过液Ⅰ，将截留液Ⅰ分为两份，分别提纯后冷冻干燥，得蚓激酶和超氧化物歧化酶。
步骤三、将滤过液Ⅰ再进行膜过柱操作，采用截留分子量大于5万道尔顿的超滤膜进行超滤，得截留液Ⅱ和滤过液Ⅱ，将截留液Ⅱ冷冻干燥，得蚯蚓蛋白。
步骤四、将滤过液Ⅱ进行膜过柱操作，采用截留分子量小于5万道尔顿的超滤膜进行超滤，得截留液Ⅲ，将截留液Ⅲ进行喷雾干燥，得蚯蚓多肽。
完成蚯蚓的提取方法。
本发明的具体实施方式中，对提取得到的蚓激酶、超氧化物歧化酶、蚯蚓蛋白和蚯蚓多肽分别进行鉴定测试，以及相关性能测试。具体如下：
1、蚓激酶
(1)鉴定：取步骤二中所提取得到的蚓激酶适量，加水制成每1mL中含0.5mg的溶液，按分光光度法(中国药典2000年版附录IV A)测定，在278nm的波长 处有最大吸收。证明提取物中含有蚓激酶。
(2)取本品适量，加0.9％氯化钠溶液制成每1mL中含10mg的溶液，作为供试品溶液；用6号针头取动物血1滴于试管底部，30分钟后，加供试品溶液1mL置试管中，轻轻摇动，血凝块在60分钟内溶解。以0.9％氯化钠溶液1mL为空白，同法操作，血凝块不溶解。具有溶栓功效。提取得到蚓激酶可以用来溶栓及厂家制药。
(3)比活力测定
A、效价测定
①试剂
0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.8)：取磷酸氢二钠3.58g，加水使溶解并稀释至1000mL为A液；取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)0.78g，加水使溶解并稀释至500mL为B液；将A、B两液混合至pH值为7.8。
工作溶液：取0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.8)与0.9％氯化钠溶液以体积比为1:17混合
1.5％琼脂糖溶液：取琼脂糖1.5g，加工作溶液100mL加热溶解。
纤维蛋白原溶液：取纤维蛋白原适量，加工作溶液制成每1mL中含1.5mg的可凝蛋白溶液。
凝血酶溶液：取凝血酶，加0.9％氯化钠溶液制成每1mL中含1BP单位的溶液。
标准品溶液的制备：取蚓激酶标准品，用0.9％氯化钠溶液制成浓度分别为每1ml中含10000，8000，6000，4000，2000蚓激酶单位的溶液。
供试品溶液的制备：取本品适量，加0.9％氯化钠溶液使溶解并稀释成标 准曲线范围内的浓度。
②测定法 取纤维蛋白原溶液39mL，置烧杯中，边搅拌边加入55℃琼脂糖溶液39ml、凝血酶溶液3.0ml，立即混匀，快速倒入直径14cm塑料培养皿中，室温水平放置1小时，打孔。精密量取不同浓度的蚓激酶标准品溶液及供试品溶液各10μL，分别点在同一平皿中，加盖，置37℃恒温箱中反应18小时。取出后用卡尺测量溶圈垂直两直径，以蚓激酶标准品单位数的对数为横坐标，垂直两直径乘积的对数为纵坐标，计算回归方程，将供试品垂直两直径乘积的对数代入回归方程，计算供试品效价单位数。
计算得到，本发明具体实施方式的步骤二中提取得到的蚓激酶的效价达到18000单位。
B、蛋白含量测定
取本品约20mg，精密称定，照氮测定法(中国药典2000年版二部附录VIID第二法)测定，将结果乘以6.25，即为供试品中蛋白含量，并计算每1mg供试品中的蛋白毫克数。得到步骤二中提取得到的每1mg蚓激酶的蛋白含量为0.6mg。
比活力按下式计算比活力：
计算得到蚓激酶的比活力为30000单位。
2、超氧化物歧化酶(SOD)的化学测试
(1)邻苯三酚自氧化率测定：取50mmol/L Tris-HCl缓冲液3mL，25℃水浴预温15分钟，取出后立即加入在25℃预热过的50mmol/L邻苯三酚7微升，以50mmol/L Tris-HCl缓冲液为空白。在25℃恒记录4分钟内325mm吸光度读 数的变化。计算线性范围内每分钟吸光度的增值，此即为邻苯三酚的自氧化速率。(一般控制邻苯三酚自氧化速率在0.007A/min)
(2)酶活力测定：加入邻苯三酚前，先加入超氧化物歧化酶SOD提取液(步骤二中未冷冻干燥前的)10微升，其它均同上述工序一样，记录加酶液后，4分钟内325mm吸光度读数的变化。(控制SOD抑制邻苯三酚自氧化速率在50％左右。)
(3)计算

一个单位(U)是指25℃pH8.2在325mm下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50％时的酶量。
测试得到蚯蚓SOD的酶活力可以达到26.0U/mL。
3、蚯蚓蛋白含量的测定
利用蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比的原理，采用紫外线吸收法测定蚯蚓多肽含量。具体如下：用标准蛋白质溶液配制一系50～500mg/mL已知浓度的5.0mL蛋白质溶液，测定238nm的光吸收A238，以A238为纵座标，蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。称取本发明具体实施方式提取的M克蚯蚓蛋白配制成VmL的样品溶液，测定该样品溶液在238nm的光吸收A_样品，与标准曲线比对得到样品溶液中蛋白质的浓度c，进而得到样品溶液中蛋白质的质量为m＝c·V。进而计算得到提取得到的蚯蚓蛋白提取物中蛋白质的 质量百分含量。
依据上述紫外线吸收法，测试得到的本发明提取得到的蚯蚓多肽中蛋白质多肽的质量百分含量达到3.04％。
4、蚯蚓多肽含量的测定
(1)标准曲线的制作
取十个10mL的容量瓶，用5％三氯乙酸(TCA)依次配制0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6和1.8mg/mL的Gly-Gly-Try-Arg四肽标准溶液，然后分别取6.0ml标准溶液，加4mL双缩脲试剂，混合均匀，静置10min，2000rpm/min离心10min，取上清液于540nm下测定OD值(以第一管做空白对照)。以肽的浓度为横坐标X(mg/ml)，OD值为纵坐标Y，制作标准曲线。
(2)多肽含量的测定
多肽含量的测定程序：取2.5mL样品溶液，加入2.5mL10％(w/v)的TCA水溶液，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，然后在4000r/min下离心15min，将上清液全部转移到50ml容瓶中，并用5％的TCA定容至刻度，摇匀。然后取6.0ml上述溶液置另一试管中，加入双缩脲试剂4.0ml(样液：双缩脲试剂＝3:2，v/v)，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，2,000r/min离心10min，取上清液于540nm下测定OD值，对照标准曲线求得样品溶液中的多肽浓度C(mg/ml)，进而可求得样品中多肽含量。
测定得到本发明具体实施方式的提取方法提取得到的蚯蚓多肽提取物中多肽含量为38mg/mL。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到 变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。