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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410261683.6 (22)申请日 2014.06.11 C07K 5/117(2006.01) C07K 1/06(2006.01) C07K 1/02(2006.01) A61K 38/07(2006.01) A61P 35/00(2006.01) B82Y 30/00(2011.01) (71)申请人 首都医科大学 地址 100069 北京市丰台区右安门外西头条 10 号 (72)发明人 赵明 彭师奇 王玉记 吴建辉 王松伟 (54) 发明名称 LDV 修饰的 5- 氟尿嘧啶， 其制备， 纳米结构， 活性及应用 (57) 。
2、摘要 本发明公开了化合物 5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙 酰-Leu-Asp-Val， Leu-Asp-Val， 简称是LDV。 公开 了它的制备方法， 公开了它的纳米结构， 公开了它 的抗肿瘤作用， 公开了它抗肿瘤细胞粘附侵袭和 迁移的作用， 阐明了它在医学中的应用。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 附图1页 CN 105294835 A 2016.02.03 CN 105294835 A 1/1 页 2 1. 下面结构的化合物 5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酰 -Leu-Asp-Val。 2. 权利要求 1 的 5。
3、- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酰 -Leu-Asp-Val 的制备方法， 该方法由以下步 骤构成 ： (1)60 5- 氟尿嘧啶在溴乙酸乙酯溶液， 30 NaOH 水溶液中反应 10h， 然后在冰水浴， 浓盐酸存在下形成 5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酸 ； (2) 采用液相合成制备Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl ； (3) 将 Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl 与 5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酸偶联， 制备 5- 氟尿嘧 啶 -1- 基乙酰 -Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl ； (4) 将 5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酰 -Leu-Asp(OBzl)-Val。
4、-OBzl 脱保护， 制备 5- 氟尿嘧 啶 -1- 基乙酰 -Leu-Asp-Val。 3. 权利要求 1 的 5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酰 -Leu-Asp-Val 的纳米结构。 4. 权利要求 1 的 5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酰 -Leu-Asp-Val 在制备抗肿瘤药物中的应用。 5.权利要求1的5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Leu-Asp-Val在制备抗肿瘤细胞粘附迁移和 侵袭药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 105294835 A 2 1/8 页 3 LDV 修饰的 5- 氟尿嘧啶， 其制备， 纳米结构， 活性及应用 技术领域 0001 本发明涉及 5- 氟尿嘧啶 -1-。
5、 基乙酰 -Leu-Asp-Val。简称是 LDV。涉及它的制备 方法， 涉及它的纳米结构， 涉及它的体内外抗肿瘤作用， 涉及它抗肿瘤细胞粘附侵袭和迁移 的作用。因而本发明涉及它在制备抗肿瘤药物， 制备抗肿瘤细胞迁移粘附和侵袭药物中的 应用。本发明属于生物医药领域。 背景技术 0002 5- 氟尿嘧啶是一临床常用的抗肿瘤药物， 它可用于多种癌症的治疗， 胃癌， 肝癌， 结肠等。虽然 5- 氟尿嘧啶对于肿瘤的治疗有不错的疗效， 但其也存在一些不容忽视的问 题。例如体内半衰期短， 口服生物利用度低， 给药剂量与中毒剂量相近， 毒副作用大。为了 能更好地发挥 5- 氟尿嘧啶的抗肿瘤作用， 提高其抑瘤。
6、效果、 减少毒副作用。多年来人们对 5-氟尿嘧啶进行了大量的修饰工作， 合成了多种5-氟尿嘧啶衍生物， 如在5-氟尿嘧啶上引 入葡萄糖、 卟啉类化合物， 金属配合物， 氨基酸和短肽等。遗憾的是这些努力并没有获得期 待的结果。在 5- 氟尿嘧啶的结构修饰中， 还有将 RGD 三肽引入的合成研究。因为在一些重 要的研究中， RGD 三肽已确认对整合素受体没有识别作用， 所以这种修饰是一种目标含糊的 化学工作， 对 5- 氟尿嘧啶没有任何生物学意义。 0003 RGD 四肽， 即 RGDS， RGDF 和 RGDV 是整合素 V3的阻断剂， 具有抗血栓和抗细胞 粘附活性。层粘连蛋白 -111(lam。
7、inin-111) 参与到肿瘤的生长、 浸润、 转移、 粘附和血管生 成等多个生理过程。申请人也曾经用氨基酸修饰四氢 - 咔啉 -3- 羧酸、 - 咔啉 -3- 羧 酸及 1- 位取代的 - 咔啉 -3- 羧酸， 包括 1- 位取代的四氢 - 咔啉 -3- 羧酸或 1- 位取 代的 - 咔啉 -3- 羧酸制备高效的抗血栓剂或抗肿瘤剂。图 1 是发明人创造的结构类型的 代表。 尽管发明人付出了大量研究精力， 筛选了数百种化合物， 一直没有得到同时具有抗肿 瘤和抗肿瘤粘附浸润和迁移作用的化合物。 0004 发明人在分析数百种化合物的结构及活性变化的基础上， 认识到将LDV与5-氟尿 嘧啶偶联， 形。
8、成的 5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酰 -Leu-Asp-Val 会同时具有抗肿瘤和抗肿瘤细胞 粘附浸润和迁移作用。基于这个认识， 发明人提出了本发明。 发明内容 0005 本发明的第一个内容是提供下面结构的 5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酰 -Leu-Asp-Val。 0006 0007 本发明的第二个内容是提供 5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酰 -Leu-Asp-Val 的制备方法， 该方法由以下步骤构成 ： 说 明 书 CN 105294835 A 3 2/8 页 4 0008 (1)605-氟尿嘧啶在溴乙酸乙酯溶液， 30NaOH的水溶液中反应10h， 然后在冰 水浴， 浓盐酸存在下形成 5。
9、- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酸 ； 0009 (2) 采用液相合成制备 Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl ； 0010 (3) 将 Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl 与 5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酸偶联， 制备 5- 氟尿嘧 啶 -1- 基乙酰 -Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl ； 0011 (4) 将 5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酰 -Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl 脱保护， 制备 55- 氟尿 嘧啶 -1- 基乙酰 -Leu-Asp-Val。 0012 本发明的第三个内容是评价 5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酰 -Leu-Asp-Val 的。
10、抗细胞增殖 活性。 0013 本发明的第四个内容是评价 5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酰 -Leu-Asp-Val 对荷 S180 小 鼠肿瘤增长的抑制作用。 0014 本发明的第五个内容是评价 5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酰 -Leu-Asp-Val 抗肿瘤细胞粘 附， 侵袭和迁移作用。 附图说明 0015 图 1. 发明人创造的抗肿瘤活性化合物的结构类型代表， 式中 AA 为 L- 氨基酸或甘 氨酸。 0016 图 2.5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酰 -Leu-Asp-Val 的合成路线 .i)DCC， HOBt， NMM， THF ； ii) 氯化氢 / 乙酸乙酯溶液 (4N) ； iii。
11、)CH3OH， 2N NaOH ； iv)NaOH(30 )， 60， 溴乙酸乙酯， 浓 HCl。 0017 图 3.5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酰 -Leu-Asp-Val 在纯水溶液中 110-5M 浓度下的透射 电镜照片。 具体实施方式 0018 为了进一步阐述本发明， 下面给出一系列实施例。 这些实施例完全是例证性的， 它 们仅用来对本发明进行具体描述， 不应当理解为对本发明的限制。 0019 实施例 1 制备 5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酸 0020 1.30g(10mmol)5- 氟尿嘧啶置于 100mL 茄瓶中， 加入 10mL NaOH(30 ) 的水溶液 溶解， 将反应加热升。
12、温至 60， 待完全溶解， 缓慢滴加 1.75mL 溴乙酸乙酯溶液， 恒温 60 反应 12h， TLC( 乙酸乙酯冰醋酸水 5 2 0.5) 显示反应完成。将反应液冷却至 室温， 冰浴下缓慢滴加浓盐酸， 调节 pH 至 2， 搅拌 0.5h， 有无色固体析出， 过滤， 将滤饼分别 用冰水和乙醚洗三次， 阴凉处晾干， 得 0.56g(30 ) 标题化合物， 为无色粉末。ESI-MS(m/ e) ： 189M+H+.1H NMR(500MHz， DMSO-d6) ： /ppm 13.21(s， 1H)， 11.89(d， J 4.5Hz1H)， 8.07(d， J 6.5Hz1H)， 4.37(。
13、s， 2H)。 0021 实施例 2 制备 Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl 0022 22.10g(68.30mmol)Boc-Asp(OBzl) 用 200mL 无水 THF 溶解于 500mL 反应瓶中， 冰 浴下加入 10.10g(75.13mmol)N- 羟基苯骈三氮唑 (HOBt) 及 16.90g(81.90mmol) 二环己基 碳二亚胺(DCC)， 搅拌30min得到反应物A。 另将27.12g(68.30mmol)Tos Val-OBzl用150mL 无水 THF 溶解于 250mL 反应瓶， 冰浴下缓慢滴加 N- 甲基吗啉 (NMM) 调节 pH 至 9， 得到。
14、反应 说 明 书 CN 105294835 A 4 3/8 页 5 物 B。冰浴下， 将反应物 B 加入反应物 A 中， 缓慢滴加 N- 甲基吗啉 (NMM) 调节 pH 至 9， 室温 下搅拌反应 12h， 薄层层析 TLC( 石油醚丙酮冰醋酸 4 1 0.1) 显示反应完成。反 应液过滤， 减压除去溶剂， 残留物柱层析分离 ( 石油醚 - 丙酮系统 )， 制得 18.28g(52.3 ) Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl。ESI-MS(m/e) ： 513M+H+。 0023 实施例 3 制备 HClAsp(OBzl)-Val-OBzl 0024 冰水浴下， 18.28g(35。
15、.7mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl 与 36mL 氯化氢的乙酸乙 酯溶液 (4N)， 室温搅拌反应 2h， 薄层层析 TLC( 二氯甲烷甲醇冰醋酸 20 1 0.1) 显示反应完成。减压浓缩除去乙酸乙酯， 残留物反复用少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化 氢， 制得 14.61g(91.23 )HClAsp(OBzl)-Val-OBzl。ESI-MS(m/e) ： 411M-H-。 0025 实施例 4 制备 Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl 0026 按 照 实 施 例 2 的 操 作 由 7.53g(32.6mmol)Boc-Leu 与 14.60g(。
16、32.6mmol) HCl Asp(OBzl)-Val-OBzl制得9.80g(47.31)Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl。 ESI-MS(m/ e) ： 626M+H+。 0027 实施例 5 制备 HClLeu-Asp(OBzl)-Val-OBzl 0028 按照实施例 3 的操作， 由 9.80g(15.4mmol)Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl 制得 7.74g(89.70 )HClLeu-Asp(OBzl)-Val-OBzl。ESI-MS(m/e) ： 524M-H-。 0029 实施例 6 制备 5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酰 -Leu-。
17、Asp(OBzl)-Val-OBzl(2) 0030 2.59g(13.80mmol)5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酸用 15mL 无水 DMF 溶解于 100mL 反应 瓶中， 冰浴下加入 2.13g(15.18mmol)N- 羟基苯骈三氮唑 (HOBt) 及 3.41g(16.56mmol) 二 环 己 基 碳 二 亚 胺 (DCC)，搅 拌 30min 得 到 反 应 物 A。 另 将 7.74g(13.8mmol) HClLeu-Asp(OBzl)-Val-OBzl 用 20mL 无水 DMF 溶解于 100mL 反应瓶， 冰浴下缓慢滴 加 N- 甲基吗啉 (NMM) 调节 pH 至 9。
18、， 得到反应物 B。冰浴下， 将反应物 B 加入反应物 A 中， 缓慢滴加 N- 甲基吗啉 (NMM) 调节 pH 至 9， 室温下搅拌反应 12h， 薄层层析 TLC( 二氯 甲烷甲醇冰醋酸 15 1 0.1) 显示反应完成。反应液过滤， 减压除去溶剂， 残 留物柱层析分离 ( 二氯甲烷 - 甲醇系统 )， 制得 1.45g(15.21 )5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙 酰 -Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl， ESI-MS(m/e) ： 696M+H+.1H-NMR(300MHz， DMSO-d6) ： /ppm 11.84(s， 1H)， 8.43(m， 2H)， 8.00-7。
19、.93(m， 2H)， 7.35(m， 10H)， 5.16-5.04(m， 4H)， 4.70(m， 1H)， 4.36(m， 3H)， 4.23-4.35(m， 1H)， 2.89-2.61(m， 2H)， 2.50(s， 1H)， 2.08-2.01(m， 1H)， 1.64-1.58(m， 1H)， 1.47-1.44(m， 2H)， 0.88-0.82(m， 12H)。 0031 实施例 7 制备 5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酰 -Leu-Asp-Val(3) 0032 冰浴下， 在 NaOH 甲醇水溶液 (2N) 中， 搅拌反应 2.5h， 薄层层析 TLC( 二氯甲烷 甲醇冰醋酸。
20、 15 1 0.1) 及 ( 乙酸乙酯冰醋酸水 5 2 1) 显示反应完 成。制得 0.37g(36 )5- 氟尿嘧啶 -1- 基乙酰 -Leu-Asp-Val， 为无色固体粉末， ESI-MS(m/ e) ： 516M+H+.mp ： 192.2-193.2 ； D25 -30.70(c 0.3， CH3OH).IR(KBr) ： 3282， 3267， 3068， 2972， 1699， 1683， 1564， 1417， 1373， 1276， 1230， 1174， 1033cm-1.1H-NMR(500MHz， DMSO-d6) ： /ppm 8.46(s， 2H)， 8.04-8.。
21、03(m， 1H)， 7.49-7.47(m， 1H)， 4.51-4.25(m， 5H)， 2.58-2.53(m， 1H)， 2.38-2.34(m， 1H)， 1.98-1.97(m， 1H)， 1.60-1.57(m， 1H)， 1.45-1.44(m， 2H)， 0.85-0.77(m， 12H). 纯度 ： 95.92流动相 ： CH3OH H2O 冰醋酸 95 5 0.1， 保 留时间 ： 7.94min。 说 明 书 CN 105294835 A 5 4/8 页 6 0033 实验例 1 测定化合物 3 的透射电镜照片 0034 将化合物 3 按照 110-5M 的浓度配置化合。
22、物的纯水溶液， 均匀的铺在铜网上， 在 透射电镜 (TEM， JEM-1230， JEOL) 下观察化合物的自组装性质。得到的照片如图 3。结果表 明， 化合物 3 在水中均可形成纳米颗粒， 直径在 40-400nm。 0035 实验例 2 测定化合物 3 对细胞的细胞毒作用 0036 1) 本发明的化合物 3 用含 0.1 DMSO 的培养基配制成所需浓度。 0037 2) 实验用的肿瘤细胞为 HepG2( 人肝细胞癌细胞 )， HL60( 人早幼粒细胞白血病细 胞 )， BEL-7402( 人肝癌细胞 )， MCF-7( 人乳腺癌细胞 )， HeLa( 人宫颈癌细胞 )， U-2OS( 人。
23、 骨肉瘤细胞 )， S180( 小鼠腹水瘤细胞 )， L02( 人正常肝细胞 ) 和 Haca-T( 人表皮正常细胞 株 )。 0038 3) 实验方法 HL-60， BEL-7402， MCF-7 和 S180 细胞选用 RPMI-1640 培养基 ； HeLa， HepG2， U-2OS， L02 和 Haca-T 细胞选用 DMEM 培养基。培养基中均含 10经灭活的胎牛血清 和 1105U/L 青霉素和 100mg/L 链霉素。 0039 贴壁细胞 HepG2， MCF-7， BEL-7402， HeLa， Haca-T， U-2OS 和半贴壁细胞 S180 的培 养 ： 分别将生长状。
24、态良好， 处于对数生长期的细胞以 3104个 /mL 的密度接种于 96 孔板， 每孔 100L， 置于 37和 5 CO2的细胞孵育箱中培养 4 小时， 然后按预设的浓度梯度加 入经灭菌处理的化合物 3 与含 0.1 DMSO 的培养基配制成的溶液， 每孔 25L， 对照组加入 等体积的溶解样品的溶媒。继续培养 48 小时后， 每孔加 25L 浓度为 5mg/mL 的 MTT 溶液， 置于 37和 5 CO2的细胞孵育箱中培养 4 小时。小心除去上清液后每孔加入 100L 的 DMSO， 振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒)， 立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值， 波长 为 570nm。
25、。 0040 悬浮细胞 HL60 的培养 ： 分别将生长状态良好， 处于对数生长期的细胞以 5104个 /mL 的密度接种于 96 孔板， 每孔 100L， 然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物 3 与含 0.1 DMSO 的培养基配制成的溶液， 每孔 25L， 对照组加入等体积的溶解样品的溶 媒， 置于 37和 5 CO2的细胞孵育箱中培养 48 小时。每孔加入 25L 浓度为 5mg/mL 的 MTT溶液， 继续置于条件为37和5CO2的细胞孵育箱中培养4小时。 2500rpm离心10min， 小心吸出上清液， 每孔加入 100L DMSO， 振荡约 10min 溶解紫色残留物 ( 。
26、甲瓒 )， 立即于酶 标仪上检测 O.D.( 吸光度 ) 值， 波长为 570nm。 0041 按下式求出各个浓度下化合物 3 抑制肿瘤细胞增殖的活性 ： 0042 细胞增殖 ( ) ( 化合物 3 组平均 O.D. 值 / 对照组平均 O.D. 值 )100， 实 验重复 3 次， 以细胞增殖对药物浓度作图， 按作图法求出 IC50( 半数有效抑制浓度 ) 值。 0043 4) 结果见表 1 和表 2。结果表明， 在体外细胞毒试验中， 评价了化合物 3 在 34.61+5.36 的浓度对 MCF-7 显示了弱的细胞毒作用。仅在 100 和 200M 的高浓度对 Bel-7402， HepG2。
27、， HL60， U-2OS， HeLa， S180， L02 和 Haca-T 等 9 株肿瘤细胞显示弱的细胞毒 作用。 0044 表 1 化合物 3 体外细胞毒活性 (IC50， 均值 SDM) 0045 说 明 书 CN 105294835 A 6 5/8 页 7 0046 0047 表 2 化合物 3 体外细胞毒活性 (IC50， 均值 SDM) 0048 0049 实验例 3 评价化合物 3 的体内抗肿瘤活性 0050 1) 本发明的化合物 3 用生理盐水溶解， 5- 氟尿嘧啶用生理盐水溶解作为阳性对 照， 用生理盐水作为阴性对照 ； 0051 2) 化合物 3 和生理盐水均灌胃给药，。
28、 化合物 3 的给药剂量为 10mol/kg， 生理 盐水的给药剂量为 0.2mL/20g， 5- 氟尿嘧啶的给药剂量为 10mol/kg 和的给药剂量为 150mol/kg， 连续给药 7 天， 共给药 7 次。 0052 3) 实验动物为 ICR 雄性小鼠 ( 清洁级 )， 体重 202g， 每组 12 只小鼠。 0053 4) 瘤源为小鼠 S180 肉瘤， 购自北京大学医学部动物实验中心， 自行传代维持。 0054 5) 动物模型与治疗无菌条件下抽取接种生长旺盛的 S180 腹水瘤瘤液， 用生理盐 水稀释成 (1 2) 的液体充分混合， 将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的 0.2台盼蓝染色， 混。
29、匀 后按白细胞计数方法计数， 染蓝色者为死细胞， 不染色者为活细胞， 并按如下公式计算细胞 浓度和细胞存活率。 0055 细胞浓度 4 大方格内活细胞数 /4104 稀释倍数细胞数 /mL 0056 细胞存活率活细胞数 /( 活细胞数 + 死细胞数 )100 0057 将存活率大于90的瘤液用匀浆法制备成2.0107个/mL的细胞悬液， 于鼠腋皮 下接种， 0.2mL/ 只， 制造 S180 荷瘤小鼠。肿瘤接种 24h 后， 治疗组小鼠每日口服化合物 3， 5-氟尿嘧啶或生理盐水， 剂量同上所述， 连续给药7天， 共给药7次。 第8天， 称小鼠体重， 乙 醚麻醉， 脱颈椎处死小鼠， 然后用镊子。
30、固定小鼠右腋肿瘤生长部位， 剪开皮肤， 暴露肿瘤， 钝 性剥离， 称重， 按如下公式计算抑瘤率 ： 抑瘤率 ( 阴性对照组平均瘤重 - 化合物 5 组平 均瘤重 )/ 阴性对照组平均瘤重 100。实验数据采用 t 检验和方差分析， 瘤重以平均值 +SD g 表示。结果见表 3。可以看出， 在 10nmol/kg 的口服剂量下， 10mol/kg， 生理盐水的 给药剂量为 0.2mL/20g， 5- 氟尿嘧啶的给药剂量为 10mol/kg 和的给药剂量为 150mol/ kg， 化合物 3 治疗组小鼠的瘤重与生理盐水组相及 5- 氟尿嘧啶 (10mol/kg) 组比具显著 性差异。5- 氟尿嘧啶。
31、 (150mol/kg) 组相比没有显著性差异。可见， 化合物 3 的有效剂量 比 5- 氟尿嘧啶低 15 倍。 0058 表 3 化合物 3 对 S180 荷瘤小鼠瘤重的影响g 0059 说 明 书 CN 105294835 A 7 6/8 页 8 0060 n 12 ； a) 与生理盐水组及 5- 氟尿嘧啶 (10mol/lg) 组比 P0.05。 0061 实验例 4 评价化合物 3 的体外抗肿瘤细胞粘附活性 0062 1)5- 氟尿嘧啶和化合物 3 用含 0.1 DMSO 的 DMEM 培养基配制成浓度为 100M 的溶液。 0063 2) 细胞为 HepG2。 0064 3)Fn( 。
32、人纤维连接蛋白 )。 0065 4) 实验方法 0066 用 PBS 将 Fn 配制成浓度为 100g/mL 的溶液， 按 100L/ 孔加入 96 孔培养板中， 将培养板置于 4冰箱过夜。次日， 吸除未包被 Fn 溶液， 用 PBS 洗 1 次， 每孔加入含 2 FBS 的 PBS 溶液 30L 封板， 在 37和 5 CO2的培养箱中孵育 3 小时， 弃去各孔溶液。将生长 状态良好、 处于对数生长期的HCCLM3细胞以5104个/mL的密度接种于包被Fn的96孔板 中， 每孔100L， 同时加入25L化合物3的溶液， 使其终浓度为20nM， 在37和5CO2培 养箱中培养 2 小时， 用 。
33、PBS 洗去未粘附的细胞， 弃去 PBS 后每孔加 25L 浓度为 5mg/mL 的 MTT 溶液， 置于 37和 5 CO2培养箱中孵育 4 个小时， 小心除去上清液后每孔加入 100L DMSO， 振荡约 10min 溶解沉淀， 立即于酶标仪 570nm 波长下检测 O.D.( 吸光度 ) 值。粘附抑 制率的计算公式如下 ： 粘附抑制率 ( ) 1-( 化合物 3 组细胞的 OD 值 / 空白组细胞的 OD 值 )100 ； 实验数据统计均采用 t 检验和方差分析， 粘附抑制率以均值 SD 表示。 0067 5) 结果见表 4。从结果中可以看出， 当浓度为 20nM 时， 化合物 3 明显。
34、抗 HepG2细 胞与 FN 粘附。与发明人公开的 Leu-Asp-Val 抑制 SACC-LM 细胞与 ECM 及血小板粘附的有 效浓度为 1M 相比， 化合物 3 的有效浓度降低了 50 倍。 0068 表 4 化合物 3 的体外抗肿瘤细胞粘附活性 0069 0070 n 3 0071 实验例 5 评价化合物 3 的体外抗肿瘤细胞侵袭活性 0072 1)5- 氟尿嘧啶和化合物 3 用含 0.1 DMSO 的 DMEM 培养基配制成浓度为 100M 说 明 书 CN 105294835 A 8 7/8 页 9 的溶液。 0073 2) 细胞为 HepG2。 0074 3) 基质胶为 matr。
35、igel。 0075 4) 实验方法 0076 将冻存于 -20冰箱的基质胶 matrigel4过夜， 变成液态 ； 取 720L 无血清 DMEM 培养基， 加入 180L Matrigel， 混匀， 加入至 Transwell 小室的聚碳酸酯膜上室， 100L/ 个， 放入 37和 5 CO2培养箱中孵育 5h。吸除小室中残留液体， 每孔加入 50L DMEM 培养基， 37和 5 CO2培养箱中孵育 30min。 0077 HepG2细胞消化之后， 用无血清 DMEM 培养基洗 3 次， 计数， 配成细胞悬液， 密度为 5105个 /mL。每孔加入 100L 细胞悬液， 同时加入 25L。
36、 同时加入 25L5- 氟尿嘧啶和 化合物 3 的溶液， 使其终浓度为 20nM。空白对照加 25L 含 0.1 DMSO 的 DMEM 培养基配 制的溶液。下室加入 600L 无血清 DMEM 培养基， 在 37和 5 CO2培养箱中培养 48 小时。 0078 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞之后， 用 4的多聚甲醛固定细胞 30min。吸除 固定液， 用 PBS 洗 3 次， 用 0.1的结晶紫染液染色 30min。吸除染色液， 用 PBS 洗 3 次。 0079 在每个小室选取 9 个大致相同的视野观察， 拍照， 计数。实验数据统计均采用 t 检 验和方差分析， 侵袭的细胞数以均值 SD。
37、 表示。 0080 5) 结果见表 5。可以看出， 化合物 3 在 20nM 的浓度下与空白对照组相比， 发生侵 袭的细胞数具有显著性差异。与发明人公开的 Leu-Asp-Val 抑制 SACC-LM 细胞侵袭的有效 浓度为 1M 相比， 化合物 3 的有效浓度降低了 50 倍。 0081 表 5 化合物 3 的体外抗肿瘤细胞侵袭活性 0082 0083 n 9 ； a) 与空白对照组和 5- 氟尿嘧啶组比 p0.01. 0084 实验例 6 评价化合物 3 的体外抗肿瘤细胞迁移活性 0085 1)5- 氟尿嘧啶和 3 用含 0.1 DMSO 的 DMEM 培养基配制成浓度为 100M 的溶液。
38、。 0086 2) 细胞为 HepG2。 0087 3) 实验方法 0088 HepG2细胞消化之后， 用无血清 DMEM 培养基洗 3 次， 计数， 配成细胞悬液， 密度为 2106个 /mL。每孔加入 100L 细胞悬液， 同时加入 25L 同时加入 25L5- 氟尿嘧啶和 化合物 3 的溶液， 使其终浓度为 20nM。空白对照加 25L 含 0.1 DMSO 的 DMEM 培养基配 制的溶液。下室加入 600L 无血清 DMEM 培养基， 在 37和 5 CO2培养箱中培养 6 小时。 0089 用棉签擦去上室内的细胞之后， 用 4的多聚甲醛固定细胞 30min。吸除固定液， 用 PBS。
39、 洗 3 次， 用 0.1的结晶紫染液染色 30min。吸除染色液， 用 PBS 洗 3 次。 0090 在每个小室选取 9 个大致相同的视野观察， 拍照， 计数。实验数据统计均采用 t 检 说 明 书 CN 105294835 A 9 8/8 页 10 验和方差分析， 侵袭的细胞数以均值 SD 表示。 0091 4) 结果见表 6。可以看出， 在 20nM 浓度下化合物 3 与空白对照组相比， 发生侵袭 的细胞数均显著减少， 说明化合物 3 具有明显的抗 HepG2细胞侵袭作用。与发明人公开的 Leu-Asp-Val 抑制 SACC-LM 细胞迁移的有效浓度为 1M 相比， 化合物 3 的有效浓度降低了 50 倍。 0092 表 6 化合物 3 的体外抗肿瘤细胞迁移活性 0093 0094 n 9 ； a) 与空白对照组和 5- 氟尿嘧啶组比 p0.01。 说 明 书 CN 105294835 A 10 1/1 页 11 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 105294835 A 11 。