技术领域
本发明涉及对柠檬酸杆菌O6和O9血清型特异的核苷酸，尤其涉及对柠檬酸杆菌O6和O9血清型O抗原基因簇中单个基因特异的核苷酸及其应用。
背景技术
柠檬酸杆菌（Citrobacter）是肠杆菌科中一种常见的革兰氏阴性菌，通常能够利用柠檬酸作为唯一的碳源，属于兼性厌氧菌。柠檬酸杆菌与沙门氏菌和大肠杆菌亲缘关系最近，是一种条件致病菌。
柠檬酸杆菌通过DNA杂交的方法可分为11个基因种，分别为弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)，科氏柠檬酸杆菌(C.koseri)，无丙二酸盐柠檬酸杆菌(C.amalonatIzcus)，法氏柠檬酸杆菌(C.farmeri)，杨氏柠檬酸杆菌(C.youngae)，布氏柠檬酸杆菌(C.braakii)，沃克曼氏柠檬酸杆菌(C.werkmanii)，塞拉克氏柠檬酸杆菌(C.sedlakif)，啮齿类柠檬酸杆菌(C.rodentium)，吉伦氏柠檬酸杆菌(C.gillenii)，鼠类柠檬酸杆菌(C.murliniae)，其中对人类具有明显致病性的是弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)和科氏柠檬酸杆菌(C.koseri)。
弗氏柠檬酸杆菌能引起人的腹膜炎；科氏柠檬酸杆菌能在婴儿和免疫功能不全者中引起脑膜炎、中枢神经系统脓肿和败血症，能引起老年人的呼吸道和尿道感染，还能引起皮肤的感染等；其它一些柠檬酸杆菌可以在免疫抑制患者的腹腔内进行感染。此外，啮齿类柠檬酸杆菌对人体无明显致病性，但是是小鼠的重要黏膜致病菌，其多个致病机制与肠道致病性大肠杆菌（EPEC）和肠出血性大肠杆菌（EHEC）对人的致病机制相同，所以，啮齿类柠檬酸杆菌对小鼠的致病常被用作研究EPEC和EHEC对人体致病的模型。
柠檬酸杆菌主要定植于人类和动物肠道中，也存在于土壤、水、污水、食物等环境中，也能从消化道、尿液、血液和伤口中分离得到，也能从带有人类和动物粪便的环境中分离得到。
细菌分型与鉴定方法主要有传统表型方法、血清学方法以及分子鉴定方法。然而，传统的血清分型和鉴定方法存在着一定的局限性，如血清分型这种分型方法需要制备一系列特异性抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，要得到特异性的抗血清比较麻烦，其制备和储存都存在一些困难；另一方面血清分型方法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，不同的O抗原产生的抗血清之间经常存在交叉反应。因此，建立基于分子生物学技术的血清鉴定方法成为发展方向。
柠檬酸杆菌的分子鉴定越来越受到人们的重视，成为柠檬酸杆菌菌种与株型鉴定的重要依据，也因此产生了许多新的血清型。分子生物学检测技术具有速度快且易于大规模使用的优点，是目前国际上公认的致病菌检测的发展方向，但当前的难点在于DNA靶标分子特异性较低。细菌表面多糖抗原的多样性是由负责其合成的基因簇的遗传多样性导致的。长期以来，人们一直试图探索柠檬酸杆菌的表面多糖抗原这一重要致病因子的多样性情况及相应的遗传进化基础。但该研究方向上总体进展非常缓慢，针对其多糖抗原多样性和变异规律方面的认识基本还是空白，例如：人们尚不了解柠檬酸杆菌中存在多少种表面多糖抗原以及哪些表面多糖抗原对于该菌的致病性和流行性具有重要意义，负责其表面多糖抗原合成的基因簇尚未被定位等。造成上述现象的主要原因是：多糖抗原合成基因簇组成复杂、基因功能较难预、糖合成基因鉴定困难等。此外，已进行部分相关研究的单位大多缺乏前期研究基础。
在本项目中，我们将在获得柠檬酸杆菌全部表面多糖抗原基因簇序列信息的基础上，建立柠檬酸杆菌分子血清学分型系统和快速检测方法，具有重要的科学意义和较强的应用价值。
近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的分型、鉴定、检测及病害诊断，包括转录间隔区(ITS)序列分析、随机扩增长度多态性(RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析等。分子生物学方法不仅可用于柠檬酸杆菌的快速血清分型筛查，稳定的鉴定结果可以弥补表型特征鉴定方法的不足。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式反应(PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵敏、特异性强等优点。
聚合酶链式反应技术(Polymerasechainreaction,简称PCR技术)作为微生物检测技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需1个半小时。这对检验检疫部门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。不论从国内和国际的角度来看，快速、准确地鉴定出血清类型，为柠檬酸杆菌的防控提供有效技术支持是十分重要的。
发明内容
本发明的目的在于提供了本发明涉及对柠檬酸杆菌O6和O9血清型特异的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸具有：
1）SEQIDNO:1-4所示的核苷酸中的至少一种；
2）与SEQIDNO:1-4所示的核苷酸互补的核苷酸，即SEQIDNO:5-8所示的核苷酸中的至少一种；
所述的SEQIDNO:1-4如下：
所述的SEQIDNO:5-8如下：
本发明还提供了一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物为如SEQIDNO:1-4所示的核苷酸中的至少一对引物。所述的试剂盒，还包括如下试剂：10mMdNTP30μl；10×酶特异性反应缓冲液50μl；5U/μl耐热DNA聚合酶5μl；引物混合物10μl；阳性对照品10μl；阴性对照品10μl；ddH2O5ml。其中所述的PCR引物优选为所述如SEQIDNO:1-4所示的核苷酸中的至少一种。
本发明进一步公开了对柠檬酸杆菌O6和O9血清型特异的SEQIDNO:1-4核苷酸在制备用于检测柠檬酸杆菌O6和O9血清型的PCR试剂盒方面的应用。本发明所述柠檬酸杆菌可以取样于消化道、尿液、血液和伤口培养物的粗提液，或者是人类和动物粪便环境培养物得到的粗提液等。收集柠檬酸杆菌提取基因组是采用常规方法制备获得。
针对柠檬酸杆菌的PCR试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理—扩增—电泳检测结果。引物和PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需将预处理后的样本加入扩增管启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工作。
本发明公开的对柠檬酸杆菌O6和O9血清型特异的核苷酸与现有技术相比，本发明具有如下优点：
（1）实用性强
本发明建立的一种PCR反应体系，可检测柠檬酸杆菌，提供血清分型检测所用到的特异引物，利用该PCR方法可以对临床标本进行检测。
（2）准确性高
本发明通过对柠檬酸杆菌的各血清型特异的基因的PCR反应，每个样品得到一条目的条带，将得到目的片段与已知长度相比较，就可以得到柠檬酸杆菌所属的血清型。
（3）检测成本相对较低
可以推广应用于食品卫生监督、环境监测、尚品监测检验检疫等领域，并为其他不同致病菌检测组合提供技术模式。
附图说明：
图1表示本发明O6血清型wzm基因P1和P2引物检测柠檬酸杆菌和其他血清型标准菌株电泳结果图，wzm基因P1和P2引物的筛选，目的条带为261bp，其余的血清型没有任何条带,具体菌株信息见表3；
图2表示本发明O6血清型wzm基因P1和P2引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中检测了4株弧菌以及1株沙门菌、1株大肠杆菌，均无任何条带，具体菌株信息见表3；
图3表示本发明O9血清型wzm基因P3和P4引物检测柠檬酸杆菌其他血清型标准菌株电泳结果图，wzm基因P3和P4引物的筛选，目的条带为273bp，其余的血清型没有任何条带，具体菌株信息见表3；
图4表示本发明O9血清型wzm基因P3和P4引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中检测了4株弧菌以及1株沙门菌、1株大肠杆菌，均无任何条带，具体菌株信息见表3；
图5表示分别用O6和O9特异引物扩增对应血清型的电泳结果图，具体菌株信息见表3。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989）中所述的条件。其中柠檬酸杆菌来源于PolishAcademyofSciences。
实施例1：基因组的提取
37℃脑心浸液肉汤培养基培养柠檬酸杆菌，收集细菌，用细菌基因组提取试剂盒（康为世纪CW0552）提取基因组，具体步骤如下：
1.取细菌培养物1-5ml（106-108个细胞，最多不超过2×109个细胞），10000rpm，离心1分钟，弃净上清。
2.向沉淀中加入180μlBufferGTL，震荡使菌体重悬。
3.加入20μlProteinaseK，涡旋混匀，56℃孵育直至菌体完全裂解，孵育过程中每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样本分散。
4.加入4μl浓度为100mg/ml的RNaseA溶液（货号CW0601），涡旋混匀，室温孵育5分钟，再进行步骤5。
5.加200μlBufferGL，涡旋震荡充分混匀；加200μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。
6.将上一步所得溶液（包括形成的沉淀）全部加入SpinColumnDM中（SpinColumnDM已放入CollectionTube中），10000rpm，离心1分钟，弃废液，将SpinColumnDM放回CollectionTube中。
7.向SpinColumnDM中加入500μlBufferGW1（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），10000rpm，离心1分钟，弃废液，将SpinColumnDM放回CollectionTube中。
8.向SpinColumnDM中加入500μlBufferGW2（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），10,000rpm（～20,000xg），离心1分钟，弃废液，将SpinColumnDM放回CollectionTube中。
9.12,000rpm，离心2分钟，弃废液。将SpinColumnDM置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的BufferGW2。
注意：这一步的目的是将SpinColumnDM中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。
10.将SpinColumnDM转入一个新的离心管中，向膜的中间部位悬空滴加80μlBufferGE或灭菌水，室温放置1-5分钟，10000rpm，离心1分钟，将溶液收集到离心管中。-20℃保存DNA。,
注意：1）如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0时洗脱效率不高。
2）离心之前室温孵育5分钟可以增加产量。
3）用另外的200μlBufferGE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
4）如果要提高DNA的终浓度，可以将步骤9所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤9；若洗脱体积小于200μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1μg，推荐用50μlBufferGE或灭菌水洗脱。
5）因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用BufferGE洗脱并于-20℃保存。
实施例2:序列破译
提取柠檬酸杆菌O6和O9血清型标准菌株的基因组，通过Solexapair-end测序技术对柠檬酸杆菌各个血清型基因组进行全基因组测序获得该血清型的序列，运用Blast及PSI-Blast进行序列比对，采用TMHMM2.0program进行跨膜结构预测，运用ClustalWprogram进行序列对齐及筛选保守和特定基因片段，最终获得柠檬酸杆菌各个血清型的O抗原基因簇序列及破译结果。
实施例3：引物设计
根据基因簇破译情况，我们发现wzm基因确实是血清型特异的基因，所以选取该基因特异区段设计特异引物。
引物设计是该发明的核心部分。设计引物根据文献中叙述的特异基因来设计。wzm基因是柠檬酸杆菌O抗原基因簇中比较特异的基因，可以作为血清型鉴定的靶基因。将上述基因导入PrimerPremier5进行引物设计，引物的长度最好在18～24bp之间，Tm值在55℃左右。每个基因设计一对引物，有单一目的条带。
引物设计之后在Genbank中进行BLAST，设计的引物不能与其它近缘细菌的序列相似性过高，这样就能确保该引物只在自己的预定位置进行扩增，而不与其它的近缘菌或者采集标本的环境中的近缘菌不产生阳性反应，这一点对于避免非特异条带的产生和实验的成败十分重要。所设计的引物的相应互补序列也能用作为PCR引物进行特异性扩增。
设计出的引物如表1所示，其互补序列如表2所示。
表1用于PCR的引物序列表2用于PCR的引物的互补序列
实施例4：特异引物的筛选
收集了柠檬酸杆菌O6和O9血清型的标准菌株及其他10种血清型的标准菌株各一株，4株弧菌属菌株，1株沙门菌属菌株以及1株大肠杆菌菌株验证引物的特异性，菌株编号和来源见表3.
表3用于特异性检测的菌株
基因鉴定引物筛选用到的PCR体系为5μM引物0.4μl、10×酶特异性反应缓冲液2.5μl、10mMdNTP0.25μl、5U/μl耐热DNA聚合酶0.2μl及3μl的待测样品模板到0.2ml的薄壁PCR管中，最后ddH2O补足到25μl。所有引物都在各自所对应的血清型中得到阳性结果，在其他组中没有得到任何PCR产物带。
这个步骤中的PCR仪上的反应循环参数包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数，具体为：
前期为使变性能够达到所需的温度而必需的前期处理过程的一个循环为95℃，5分钟；
变性温度和时间为95℃，30秒；
复性温度和时间为58℃，30秒；
延伸温度和时间为72℃，45秒；
变性、复性、延伸的循环次数为35个循环；
为稳定扩增产物而进行一个循环的温度和时间为72℃，10分钟。
上述步骤在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果的具体步骤为：
取2～5μl扩增产物与6×溴酚蓝上样缓冲液以1：1的体积比混合；
将混合液上样于2.0％的琼脂糖凝胶上；
将琼脂糖凝胶电泳120v稳压电泳约20分钟，用DL2000Marker进行对照；
观察并记录结果。
通过基本PCR反应之后引物筛选的工作基本结束，必要的长度调整对整体反应条件影响不大，本发明中用到的引物序列全部总结在表1中，其互补序列全部总结在表2中。
表1用于PCR的引物序列
表2PCR引物的互补序列
实施例5：PCR检测试剂盒的制备及应用
1、PCR试剂盒的组成：
dNTP(10mM)30μl；
10×Buffer(10×酶特异性反应缓冲液)50μl；
Taq聚合酶（5U/μl耐热DNA聚合酶）5μl；
PCR引物混合物（5μM）10μl；
阳性对照品(KP)10μl；
阴性对照品（KN）10μl；
ddH2O5ml；
每个试剂盒可用于检测10个样品。
其中10×Buffer、dNTP、Taq聚合酶由宝生物工程有限公司提供；引物混合物为自行设计的序列提供给上海英骏生物技术公司合成；阳性对照品、阴性对照品和ddH2O由我们自行制备。
2、仪器设备
其中10×Buffer、dNTP、Taq聚合酶由上海生工提供；引物混合物为自行设计的序列提供给上海英骏生物技术公司合成；阳性对照品、阴性对照品和ddH2O由我们自行制备。实验的设备PCR仪（又名DNA热循环扩增仪）、电泳设备（包括电泳仪及电泳槽）、凝胶成像仪、-20℃冰箱、高速离心机、微量移液器和0.2mlPCR薄壁管。
3、PCR试剂盒的使用具体实例
使用上述的PCR试剂盒检测柠檬酸杆菌的PCR检测方法包括如下步骤：
（1）提取待测环境样品模板；
（2）在PCR薄壁管中加入、dNTP、10×Buffer、Taq聚合酶、引物、待测样品模板和ddH2O混匀；
（3）将薄壁PCR管中混匀的混合物在PCR仪上扩增；
（4）在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果；
（5）分析并进行结果判断。
上述步骤(1)中的环境样品模板为自来水、河流水、海水等的培养物的粗提液，或是柠檬酸杆菌的纯培养物的粗提液或是纯DNA，或是阳性对照品和阴性对照品。优选柠檬酸杆菌的纯培养物的粗提液或是纯DNA。
上述步骤（1）中的环境样品模板的提取方法为：
取1.5ml培养物，在12000rpm条件下离心1分钟，去掉上清液；
取500μl的ddH2O重悬沉淀，在8000rpm条件下离心5分钟，去掉上清液，烘干；
取100μlddH2O重悬沉淀，在100℃沸水中水浴10分钟；
再置于冰上10分钟后，在12000rpm条件下离心2分钟；
⑤取3μl中层上清作为PCR模板
上述步骤（3）中的PCR仪上的反应循环参数包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数，具体为：
前期为使变性能够达到所需的温度而必需的前期处理过程的一个循环为95℃，5分钟；
变性温度和时间为95℃，30秒；
复性温度和时间为58℃，30秒；
延伸温度和时间为72℃，45秒；
变性、复性、延伸的循环次数为35个循环；
为稳定扩增产物而进行一个循环的温度和时间为72℃，10分钟。
上述步骤（4）在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果的具体步骤为：
取2～5μl扩增产物与6×溴酚蓝上样缓冲液以5：1的体积比混合；
将混合液上样于1.0％的琼脂糖凝胶上；
将琼脂糖凝胶电泳120v稳压电泳约20分钟，用DL2000Marker进行对照；
观察并记录结果：
结果见附图，说明如下：
图1表示本发明O6血清型wzm基因P1和P2引物检测柠檬酸杆菌和其他血清型标准菌株电泳结果图，wzm基因P1和P2引物的筛选，目的条带为261bp，其余的血清型没有任何条带,具体菌株信息见表3；
图2表示本发明O6血清型wzm基因P1和P2引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中检测了4株弧菌以及1株沙门菌、1株大肠杆菌，均无任何条带，具体菌株信息见表3；
图3表示本发明O9血清型wzm基因P3和P4引物检测柠檬酸杆菌其他血清型标准菌株电泳结果图，wzm基因P3和P4引物的筛选，目的条带为273bp，其余的血清型没有任何条带，具体菌株信息见表3；
图4表示本发明O9血清型wzm基因P3和P4引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中检测了4株弧菌以及1株沙门菌、1株大肠杆菌，均无任何条带，具体菌株信息见表3；
图5表示分别用O6和O9特异引物扩增对应血清型的电泳结果图，具体菌株信息见表3。
本发明通过配置一种可检测柠檬酸杆菌的可产业化生产的PCR试剂盒，将PCR检测方法需要使用的组分组合在一起，使用时，提取待测样品，同时经过较为简单的操作层序就可以进行快速、灵敏、简便的检测，试剂盒中各组分的用量和浓度均为试验所得，用该试剂盒检测柠檬酸杆菌所使用的试验设备简单，检测成本低。
使用阳性和阴性对照品的目的是用于质控整个操作过程，以便得出准确的判断。若含有柠檬酸杆菌目的O抗原类型，则从电泳结果中可以观察到与阳性对照品相同位置的条带；若不含有柠檬酸杆菌目的O抗原类型，则与阴性对照品一样不具有这一条带。
本发明一次检测试验所使用的试剂盒中的试剂量见下表4所示，DNA模板量为3μl
表4一次检测试验所使用的试剂盒中的试剂量
本发明中的耐热DNA聚合酶为Taq酶。
上述的阳性对照品为已确定是柠檬酸杆菌各个O抗原类型的样品，阴性对照品则为经实验室确定不是柠檬酸杆菌的样品。
本PCR试剂盒若用柠檬酸杆菌的菌悬液进行PCR扩增，与经提取得到的DNA作为模板所得结果一致。敏感度和特异性无差别，这样，可省去模板DNA的提取步骤，使操作方法得以简化。同时，相比常规生化检测方法而言，本方法所采用的待测样品可以直接是临床样品培养液，或者对检测样品进行简单分离培养就可以进行检测，因而节省了人力物力。
4、待测样品的提供
收集了柠檬酸杆菌O6和O9血清型标准菌株，4株弧菌属其他菌株，1株沙门菌属菌株以及1株大肠杆菌菌株验证引物的特异性，菌株编号和来源见表3。
以上所述，仅是本发明的操作和实施方法而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCELISTING
<110>南开大学
<120>对柠檬酸杆菌O6和O9特异的核苷酸及其应用
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