技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种快速提取全血基因组DNA的装 置及其方法。
背景技术
核酸是以核苷酸为基本单位的重要生物分子，广泛存在于所有动物、植物细 胞、微生物及生物体内。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根 据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。核酸 是一切生物细胞的基本成分，也对生物体的生长、发育、繁殖、遗传及变异等重 大生命现象起主宰作用。核酸在实践应用方面有极重要的作用，现已发现许多遗 传性疾病、肿瘤的发生、病毒的感染、射线对机体的作用等都与核酸有关。因此， 对核酸结构、功能与调控的认识是人类在分子水平研究遗传、进化和疾病诊断的 基础。目前，核酸研究已成为生命科学中的与多学科广泛交叉、渗透的研究热点 及发展前沿。核酸抽提是许多临床、法医学应用及遗传学分析的前提，通过DNA 或RNA的提取及纯化过程，消除或减小其他杂质(蛋白质、多糖及脂肪等)对核 酸扩增反应的影响。传统的DNA提取方法是自1950年后相继发展起来的固相 萃取法(Solid-PhaseExtraction，SPE)和液-液萃取法(酚氯仿法)。这些方法 操作步骤繁琐，所使用的提取试剂具有毒害性，限制了其在临床上的推广应用。 目前普遍使用的硅胶膜离心柱法，虽简化了操作步骤，但大片段DNA强力结合 于膜上，难洗脱，导致离心过柱时DNA易断裂，影响下游实验包括测序、克隆、 PCR、转化、微注射、转染和微阵列分析。静脉血为目前普遍用于全血基因组 DNA提取的样本，静脉采血可能发生皮下出血或局部红肿、局部皮肤过敏反应、 误穿刺入动脉及采血失败等并发症。此外，婴幼儿静脉采血难度比较大，因此， 亟需开发一种快速、高效、适合于临床床旁检测的微量全血基因组的提取装置和 方法。微流控芯片技术是指操作微小网络通道中流体的科学技术。与常规的实验 技术相比，此技术极大降低了试剂的消耗量、降低成本同时产生极少的废液，而 且在微流体通道中，传热、传质速度比常规体系快，反应时间或分析时间都大大 缩短。目前，许多研究利用微流控技术实现了微量全血基因组DNA的提取，但 都需特殊辅助设备，仍采用静脉血作为检测样本，不能实现末梢全血基因组DNA 提取的POCT。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种集末梢血采集，全血基因组 核酸提取及纯化的装置和相应方法，实现微量全血基因组DNA的快速、高效提 取。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种快速提取全血基因组DNA的装置，包括有一体化成型的毛细采集管、 全血细胞裂解区、流体控制管，还包括有与所述流体控制管相配合的抽吸装置， 所述全血细胞裂解区由聚丙烯丝束填充。
为了进一步完善和优化上述的装置，本发明采取的技术措施还包括：
优选地，上述毛细采集管、全血细胞裂解区以及流体控制管均为玻璃材料制 作。
优选地，上述抽吸装置为橡胶滴头，即胶头滴管的滴头。
优选地，还包括能够密封毛细采集管的采集管封管器，以及能够密封流体控 制管的控制管封管器。
优选地，上述毛细采集管长2-6cm，管壁厚度为0.1-0.4mm，内径为 0.5-0.7mm；更优选地，上述毛细采集管长度为4cm，内径为0.5mm，外径为 0.7mm，管壁厚度为0.1mm。
优选地，上述流体控制管长1-3cm，管壁厚度为0.1-0.4mm，内径为 1-1.2mm；更优选地，上述流体控制管长2cm，内径为1mm，外径为1.2mm， 管壁厚度为0.1mm。
优选地，上述全血细胞裂解区管壁厚度为0.1-0.4mmm，容积为100-130μ l；更优选地，全血细胞裂解区为直径6mm的圆球形(以外壁计算)，管壁厚度 为0.2mm。
另一方面，本发明还提供一种快速提取全血基因组DNA的方法，使用上述 装置进行，包括以下步骤：
步骤一，利用毛细采集管采集末梢血5-20μl，使用抽吸装置将采集的末梢 血吸入全血细胞裂解区中；
步骤二，利用抽吸装置将10-40μl裂解液吸入全血细胞裂解区中进行细胞 裂解，裂解温度为56℃，持续10分钟；
步骤三，利用抽吸装置将15-60μl无水乙醇吸入全血细胞裂解区中。
步骤四，利用抽吸装置将100-130μl的75％乙醇吸入全血细胞裂解区进行 漂洗，漂洗过程反复进行2-5次；
步骤五，利用抽吸装置将25-100μl去离子水吸入全血细胞裂解区将DNA 洗脱，获得全血基因组DNA；
其中，所述步骤二中裂解液中的组分和浓度为：10mMTris-Cl，15mMNaCl， 10mMEDTA，0.4％SDS，200μg/ml蛋白酶K。
为了进一步优化上述的方法，本发明所采取的技术措施还包括：
优选地，上述步骤一中采集末梢血为10μl，上述步骤二中利用抽吸装置将 20μl裂解液吸入全血细胞裂解区中进行细胞裂解。
优选地，上述步骤三中利用抽吸装置将30μl无水乙醇吸入全血细胞裂解区 中，上述步骤五中利用抽吸装置将50μl去离子水吸入全血细胞裂解区将DNA 洗脱，获得全血基因组DNA。
聚丙烯丝束具有无毒、无味，耐热、化学性能好，不吸水，常见的酸、碱等 有机溶剂对它几乎不起作用等特点。聚丙烯丝束具有多孔隙结构可作为滤材，广 泛作为香烟中滤嘴，对烟气中焦油、烟碱(俗称尼古丁)、一氧化碳等物质进行吸 附过滤。
一方面，本发明采用无水乙醇沉淀DNA，DNA溶液是DNA以水合状态稳 定存在，当加入乙醇时，乙醇夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚 合。另一方面，在pH为8的裂解液中，DNA分子带负电荷，一定浓度的NaCl 使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易 于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。因此，乙醇沉淀DNA时，一定浓度NaCl 进一步促进了DNA聚合沉淀。DNA吸附在若干疏水性的聚丙烯丝束大孔隙里之 后再用75％乙醇漂洗，将盐、多糖、蛋白等杂质被去除，DNA仍然吸附在聚丙 烯丝束上。最后，用去离子水进行洗脱，溶于水的DNA从聚丙烯丝束上解离， 从而得到纯化的基因组DNA。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明首次使用聚丙烯丝束/毛细管实现了末梢血基因组DNA提取，本发明 的装置和方法操作简单、效率高，无需特殊仪器，实现了基于微流控芯片的全血 基因组DNA“样品进-结果出”的目的，所提取的基因组DNA适合于分子诊断 的测序、杂交、等温扩增等一系列实验。
附图说明
图1为本发明的一种快速提取全血基因组DNA的装置的结构示意图；
图2为本发明装置中全血细胞裂解区填充的聚丙烯丝束的单根丝束10微米 刻度下的扫描电镜结果；
图3为本发明装置中全血细胞裂解区填充的聚丙烯丝束的单根丝束0.2微米 刻度下的扫描电镜结果；
图4为琼脂糖凝胶电泳分析提取的基因组DNA结果图。
具体实施方式
图1为本发明的一种快速提取全血基因组DNA的装置的结构示意图，其中 的附图标记为毛细采集管1、全血细胞裂解区2、流体控制管3、抽吸装置4、 采集管封管器5、控制管封管器6。
本发明提供了一种快速提取全血基因组DNA的装置，包括有一体化成型的 毛细采集管1、全血细胞裂解区2、流体控制管3，还包括有与所述流体控制管 3相配合的抽吸装置4，所述全血细胞裂解区2由聚丙烯丝束填充。
本发明的装置主体毛细管采用玻璃材质，经毛细管拉针器制作而成。
聚丙烯丝束具有无毒、无味，耐热、化学性能好，不吸水，常见的酸、碱等 有机溶剂对它几乎不起作用等特点。聚丙烯丝束具有多孔隙结构可作为滤材，广 泛作为香烟中滤嘴，对烟气中焦油、烟碱(俗称尼古丁)、一氧化碳等物质进行吸 附过滤。本发明采用聚丙烯丝束结合毛细管提取末梢血基因组DNA。聚丙烯丝 束的扫描电镜结果见图2和图3(单根丝束表面的电镜结果)，可见聚丙烯丝束 表面具有多孔隙结构，其极高的孔密度和孔隙率的特点，在一定的条件下可高效 吸附DNA。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发 明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例一
操作人员采血员利用毛细采集管1刺入受试者皮肤采集末梢血5μl，使用抽 吸装置4将采集的末梢血全部吸入全血细胞裂解区2中；利用抽吸装置4将10 μl裂解液吸入全血细胞裂解区2中进行细胞裂解，使用采集管封管器5、控制 管封管器6分别密封毛细采集管1和流体控制管3，56℃持续10分钟；然后去 除封管器5及封管器6，利用抽吸装置4将15μl无水乙醇吸入全血细胞裂解区 2中；利用抽吸装置4将100μl的75％乙醇吸入全血细胞裂解区2进行漂洗， 漂洗过程反复进行2次；最后，利用抽吸装置4将25μl去离子水吸入全血细胞 裂解区2将DNA洗脱，收集洗脱液；利用获得的全血基因组DNA进行下一步 的测定。
裂解液pH为8，其中的组分和浓度为：10mMTris-Cl，15mMNaCl，10mM EDTA，0.4％SDS，200μg/ml蛋白酶K。
实施例二
操作人员采血员利用毛细采集管1刺入受试者皮肤采集末梢血10μl，使用 抽吸装置4将采集的末梢血全部吸入全血细胞裂解区2中；利用抽吸装置4将 20μl裂解液吸入全血细胞裂解区2中进行细胞裂解，使用采集管封管器5、控 制管封管器6分别密封毛细采集管1和流体控制管3，56℃持续10分钟，裂解 液pH为8，其中的组分和浓度为：10mMTris-Cl，15mMNaCl，10mMEDTA， 0.4％SDS，200μg/ml蛋白酶K；然后利用抽吸装置4将30μl无水乙醇吸入 全血细胞裂解区2中；利用抽吸装置4将110μl的75％乙醇吸入全血细胞裂解 区2进行漂洗，漂洗过程反复进行3次；最后，利用抽吸装置4将50μl去离子 水吸入全血细胞裂解区2将DNA洗脱，收集洗脱液；利用获得的全血基因组 DNA进行下一步的测定。
实施例三
操作人员采血员利用毛细采集管1刺入受试者皮肤采集末梢血20μl，使用 抽吸装置4将采集的末梢血全部吸入全血细胞裂解区2中；利用抽吸装置4将 40μl裂解液吸入全血细胞裂解区2中进行细胞裂解，使用采集管封管器5、控 制管封管器6分别密封毛细采集管1和流体控制管3，56℃持续10分钟，裂解 液pH为8，其中的组分和浓度为：10mMTris-Cl，15mMNaCl，10mMEDTA， 0.4％SDS，200μg/ml蛋白酶K；然后去除封管器5及封管器6，利用抽吸装 置4将60μl无水乙醇吸入全血细胞裂解区2中；利用抽吸装置4将110μl的 75％乙醇吸入全血细胞裂解区2进行漂洗，漂洗过程反复进行5次；最后，利用 抽吸装置4将100μl去离子水吸入全血细胞裂解区2将DNA洗脱，收集洗脱液； 利用获得的全血基因组DNA进行下一步的测定。
利用琼脂糖凝胶电泳分析上述实施例提取的基因组DNA结果见图4。M泳 道为λDNA/HindⅢ电泳结果；1泳道为λDNA的电泳结果(50kb)；2，3， 4泳道分别对应于实施例一、实施例二和实施例三末梢血提取的DNA电泳结果。 利用本发明的装置和方法提取的基因组DNA为30-50kb的单一电泳条带，显示 了DNA的完整性。
本发明首次使用聚丙烯丝束/毛细管实现了末梢血基因组DNA提取，本发明 的装置和方法操作简单、效率高，无需特殊仪器，实现了基于微流控芯片的全血 基因组DNA“样品进-结果出”的目的，所提取的基因组DNA适合于分子诊断 的测序、杂交、等温扩增等一系列实验。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并 不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行 的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范 围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。