技术领域
当前发明涉及一种用于纯化通过固相肽合成(SPPS)制得的肽的方法，并且涉及用在该方法中的对应的接头分子。
背景技术
固相肽合成是一种已知的用于制备肽的方法。除了肽的合成，其纯化也是一个至关重要的方法步骤。
广泛使用的用于纯化肽的方法是制备型高效液相色谱(HPLC)。该方法的缺点是在期望的生产量方面的可扩展性差，因此不能使用同一设备来生产不同的量；这导致对应的复杂设施的相对高的购置成本。另一缺点在于，对单个级分的正确分析评估需要相对广泛的知识；还要补充的是，在操作过程中溶剂和色谱柱材料(固相)的消耗。
因此，为了降低肽制备的成本，成本更加低廉且更不易受干扰的方法是有利的。
EP 0 552 368 A1描述了一种用于纯化肽的方法，其中所谓的接头一方面与合成的全长肽的N端末端共价键合，另一方面通过硫醇基与官能化的硅藻土反应共价键合至硫醚。全长肽由此被固定化并且可以被纯化。随后，在碱性条件下释放全长肽。然而，该方法不适合于含硫醇的肽，例如含有氨基酸半胱氨酸或青霉胺的肽。另外，存在的缺点是，用于纯化的固相(在这种情况下是硅藻土)不是预设用于再利用的或不适合于再利用。
EP 2 501 711 B1提出了一种类似的方法，其中接头一方面通过合成的全长肽的N端末端，另一方面通过叠氮化物(-N3)和炔烃之间的1,3-偶极环加成(Huisgen反应)，与固相(合成的亲水聚合物，诸如PEGA)结合。该方法的缺点是，在此必须加入铜或含铜化合物，以进行1,3-偶极环加成反应。许多肽络合铜，特别是具有硫的那些，即含有甲硫氨酸和/或半胱氨酸的那些；精氨酸和赖氨酸同样可以结合铜。因此，难以再次移除铜，并且由于剩余铜的毒性，该方法并不能应用至所有情况，特别地不适用于肽治疗剂的纯化。而且，在此也有这个缺点，即用于纯化的固相不是预设用于再利用的或不适合于再利用。
发明内容
因此，本发明的目的在于，提供一种用于纯化肽的方法，该方法不需要完整的HPLC设备，也适合于含硫或结合铜的肽。此外，本发明的目的在于，提供一种适合于纯化肽的方法，该方法使得用于纯化的固相的再生和再利用成为可能。另外，本发明的目的在于，提供一种化合物，其使得全长肽的N端氨基和固相之间的连接成为可能。
在当前发明的第一方面中，该目的通过一种具有通式
X1-L-X2 (1)的化合物得以实现，其中
X1选自
-其中每个R1和R2都彼此独立地选自H或B，其中至少R1或R2是B，其中
-R3选自H或B，
-其中B是对酸不稳定的氨基保护基团，其中
-R4选自H、C1-C12-烷基或芳基，其中醛基或酮基可以由对酸不稳定的保护基团保护，
L选自在碱性条件下可从X2上亲核裂解的官能接头化合物，特别地L具有-T-U-的形式，其中
-T是X1和U之间的间隔基，其中T特别地选自取代或未取代的-C1-C12-烷基，特别是C1-C6-烷基，特别是C1-C3-烷基，-R5-C(＝O)-NH-R6-，-R5-C(＝O)-O-R6-，-C(＝O)-O-R6-，-C(＝O)-NH-R6-，-C(＝O)，-R5-苯基-R6-，-R5-苯基-，-苯基-R6-，-苯基-，
-其中R5和R6独立地选自取代或未取代的C1-C12-烷基，尤其是C1-C6-烷基，尤其是C1-C3-烷基，并且其中
-U是官能性接头化合物的裂解活化部分，其中活化部分被设计用于稳定在从X2上碱性裂解时产生的阴离子，
X2具有-Y-Z的形式，其中
-Y选自-O-C(＝O)-或-S(＝O)2-，并且
-Z是吸电子的离去基团。
在当前发明的上下文中，术语分子的“裂解活化部分”是指反应性官能团的结构要素。
“反应性官能团”是指可以被激化(活化)以产生反应性物质的化合物。这可以通过例如催化剂或pH值变化来完成。反应性物质能够在短时间内与合适的反应物形成共价键，例如氨基甲酸酯键。因此，反应性官能团包括在其活化后与其他官能基团(例如氨基或酰胺基)特异性反应的基团。
术语“间隔基”是指分子内的多个原子的化合物，其本身不含反应性官能团并在空间上分离分子的两个官能基团。间隔基是共价连接的链或环结构，其由碳、磷、硫、硅、氮和/或氧原子组成。间隔基可含有对待分离的官能基团之间的距离没有贡献的取代基。
术语“分组”是指分子内的多个原子的化合物。通常，这些原子形成例如间隔基等官能单元、反应性官能团或施加中介或诱导效应的分子结构。
术语“官能性接头化合物”或“接头化合物”是指连接分子内的两个官能单元的官能基团。接头化合物与官能基团共价连接。
术语“接头”、“接头分子”、“接头系统”和“捕获化合物”是指通过与相应的另一分子形成共价键而连接两个其他分子的分子。与其它两种分子的官能基团的共价键合仅在特定反应条件下发生。特别地，术语“接头”、“接头分子”、“接头系统”和“捕获化合物”是指属于式(1)并且可以在肽的N端和固体载体之间建立连接的化合物。
术语“取代”是指向母体化合物中加入原子或分子基团或化合物。可以受保护地或不受保护地在母体分子中的一个或多个可用位点上添加取代基或化合物。取代基或化合物本身可以是取代的或未取代的，并且可以直接或通过诸如如烷基、酰胺基或烃基等连接基团或化合物与母体分子连接。取代基或化合物包括例如卤素、氧、氮、硫、羟基、烷基、烯基、炔基、羧基(-C(O)ORa)、酰基-(-C(O)Ra)-基团、脂族基、脂环基、烷氧基、氨基((-N(Rb)(Rc))、亚氨基-(＝NRb)、酰氨基-(-C(O)N(Rb)(Rc)或-N(Rb)C(O)Ra)基团、肼类衍生物(-C(NH)NRaRb)、三唑、四唑(CN4H2)、叠氮基(-N3)、硝基(-NO2)、氰基(-CN)、异氰基(-NC)、氰酰基(-OCN)、异氰酸基(-NCO)、氰硫基(-SCN)；异硫氰酸基(-NCS)、脲基(-OC(O)N(Rb)(Rc)或-(Rb)C(O)ORa)基团、硫醇(-SRb)、亚硫酰基(-S(O)Rb)、磺酰基(-S(O)2Rb)、磺酰胺基(-S(O)2N(Rb)(Rc)或-N(Rb)S(O)2Rb)基团以及氟化化合物，诸如-CF3、-OCF3、-SCF3、-SOCF3或-SO2CF3。Ra，Rb和Rc独立地为H或另一取代基。
术语“烷基”是指最多12个碳原子的饱和直链或支链烃链。优选的烷基的实例是甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、正己基、辛基、癸基。
术语“芳基”是指在碳原子之间具有交替的双键和单键的形成了环结构的烃化合物。
术语“离去基团”是指分子内的官能基团，其施加-M和/或-I效应，并且由此可以轻松地裂解，其中在裂解后，在离去基团上保留有结合电子对。
术语“表面修饰的固体载体”是指诸如琼脂糖凝胶单元、琼脂糖单元或纤维素单元、硅胶或多葡聚糖等固体结构，其由诸如多糖、聚赖氨酸、聚芳基酰胺、聚乙二醇(PEG)或丙烯酰胺-PEG-共聚物等合成或天然聚合物修饰。固体载体的表面由醛基、酮基、羟胺基或肼基表征。
在一些实施方式中，Z是吸电子的离去基团，其施加-M和/或-I效应，并且在异裂键断裂时携带结合的电子对。
在一些实施方式中，Z是吸电子的离去基团，其中对应于离去基团的阴离子的酸由小于五的pks值表征。
在一些实施方式中，Z是吸电子的离去基团，其中对应于离去基团的阴离子的酸由小于五的pks值表征，并且其中离去基团特别地施加-M和/或-I效应，并且在异裂键断裂时携带结合的电子对。
在一些实施方式中，U是官能性接头化合物的裂解活化部分，其中活化部分表示一种分组，所述分组允许通过-M和-I效应形成阴离子，并且通过电子对移位稳定所产生的阴离子化合物，其中该稳定化引起U和X2之间的异裂键断裂。
在一些实施方式中，B选自Boc(-C＝OOtBu)、三苯甲基(-C(Ph)3)、Mmt(-C(Ph)2C6H4OMe)、DMT(-C(Ph)(C6H4OMe)2)、Cbz(-C＝OOCH2Ph)、亚苄基胺(＝CPh)、邻苯二甲酰亚胺(＝(CO)2C6H4)、对甲苯磺酰胺(-SO2C6H4Me)、苯甲胺(-CH2Ph)、乙酰胺(-COMe)、三氟乙酰胺(-COCF3),Dde(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-乙基)以及1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-甲基丁基(ivDde)，其中B特别地是Boc。
在一些实施方式中，缩醛或缩酮保护基团选自
其中r处于0至12之间，特别地是0、1或2。
本领域技术人员已知，也可以用其它对酸不稳定的保护基团形成根据本发明的化合物。
在一些实施方式中，T选自取代或未取代的C1-C12-烷基-，特别是C1-C6-烷基，特别是C1-C3-烷基，-R5-C(＝O)-NH-R6-，-R5-C(＝O)-O-R6-，-R5-C(＝O)-O-，-C(＝O)-O-R6-，-C(＝O)-NH-R6-，-C(＝O)-，-C(＝O)-O-，其中R5和R6独立地选自取代或未取代的C1-C12-烷基，特别是C1-C6-烷基，特别是C1-C3-烷基。
当T是取代的烷基时，取代基特别是那些提高水溶性的取代基，例如-SO3H、-CO2H或-NO2。
在一些实施方式中，T选自-CH2-、-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-、-(CH2)-C(＝O)-O-(CH2)2-、-CH2-C(＝O)-O-、-C(＝O)-O-、-C(＝O)-O-(CH2)2-和-C(＝O)-。
在一些实施方式中，T选自-CH2-、-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-、-C(＝O)-O-(CH2)2-、-CH2-C(＝O)-O-和-C(＝O)-。
在一些实施方式中，化合物T-U-Y的U选自根据式(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)和(11)的化合物，特别地选自(5)、(6)、(8)、(9)和(10)，
其中R8选自C1-C6-烷基、CF3、CH2CF3、
特别地选自Boc-Lys(Boc)-，
其中R7n、R9m、R10p、R11q、R13r和R14s选自C1-C6-烷基或者产生-I和/或-M效应的取代基，特别是C1-C3-烷基、-F、-Cl、-Br、-I、-CN-NO2、-N3、-CF3、-SO3H和-CO2H，
-其中n等于0、1、2、3或4，特别地，n是0或1，特别是0
-其中m等于0、1、2或3，特别地，m是0或1，特别是0
-其中p等于0、1、2、3或4，特别地，p是0或1，特别是0
-其中q等于0、1、2或3，特别地，q是0或1，特别是0
-其中r等于0、1、2或3，特别地，r是0或1，特别是0
-其中s等于0、1、2或3，特别地，s是0或1，特别是0。
在一些实施方式中，R7n、R9m、R10p、R11q、R13r和R14s选自C1-C6-烷基或者产生-I和/或-M效应的取代基，特别是C1-C3-烷基、-F、-Cl、-Br、-I、-CN-NO2、-N3、-CF3、-SO3H和-CO2H，特别是-F、-Cl、-Br、-I、-NO2和-N3
-其中n等于0、1、2、3或4，特别地，n是0或1，特别是0
-其中m等于0、1、2或3，特别地，m是0或1，特别是0
-其中p等于0、1、2、3或4，特别地，p是0或1，特别是0
-其中q等于0、1、2或3，特别地，q是0或1，特别是0
-其中r等于0、1、2或3，特别地，r是0或1，特别是0
-其中s等于0、1、2或3，特别地，s是0或1，特别是0。
在一些实施方式中，R7n、R9m、R10p、R11q、R13r和R14s选自提高水溶性的取代基，特别地选自-NO2、-SO3H和-CO2H。
在一些实施方式中，Z选自组-F、-Cl、-Br、-I、-N3、-SR12、-OCF3、-OCH2CF3、-OSO2CF3、-SO2C6H4CH3、-SO2CF3、-SO2CH3，
其中R12是C1-C6-烷基残基、芳基残基或苯甲基残基。
在一些实施方式中，Z选自-Cl、
特别地选自
在一些实施方式中，X1是根据式(2)或(3)的化合物，其中R3是H，R1和R2具有Boc保护基团，或者R1是H且R2是Boc保护基团。
在一些实施方式中，X1是根据式(3)的化合物，其中R1和R3是H且R2是Boc保护基团。
在一些实施方式中，Y具有-O-C(＝O)-的形式。
在一些实施方式中，T具有-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-、-CH2-C(＝O)-O-(CH2)2-、-C(＝O)-O-(CH2)2-的形式，并且U是根据式(5)或(6)的化合物，
在一些实施方式中，T具有-C(＝O)-O-(CH2)2-或者-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-的形式，并且U是根据式(6)的化合物。
在一些实施方式中，T具有-C(＝O)-O-(CH2)2-或者-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-的形式，并且U是根据式(6)的化合物。
在一些实施方式中，T具有-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-的形式，并且U是根据式(6)的化合物。
在一些实施方式中，T具有-CH2-C(＝O)-O-或者-C(＝O)-O-的形式，并且U是根据式(7)的化合物，
其中R7选自C1-C6-烷基或产生-I和/或-M效应的取代基，特别是C1-C3-烷基、-F、-Cl、-Br、-I、-CN-NO2、-N3、-CF3、-SO3H和-CO2H，其中n等于0、1、2、3或4，特别是0或1，特别是0。
在一些实施方式中，T具有-CH2-C(＝O)-O-的形式，并且U是根据式(7)的化合物，其中n等于0。
在一些实施方式中，T具有-CH2-的形式，并且U是根据式(8)的化合物，
其中R8是Boc-Lys(Boc)-，并且r等于0。
在一些实施方式中，T具有-CH2-或者-(C＝O)-的形式，并且U是根据式(9)的化合物，
其中s等于0。
在一些实施方式中，T具有-CH2-的形式，并且U是根据式(9)的化合物。
在一些实施方式中，T具有-C(＝O)-的形式，并且U是根据式(10)的化合物，
其中m等于0，Y具有-SO2-的形式，并且Z是Cl。
在一些实施方式中，根据式(1)的化合物选自2,2-二甲基丙酰氧基-[2-[2-[2-(4-硝基苯氧基)羰基氧基丙基磺酰基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]氨基]2,2-二甲基丙酸酯(式(14))，[[2-[2-[2-(4-硝基苯氧基)羰基氧基丙基磺酰基]乙基氨基]-2-氧代乙氧基]氨基]2,2-二甲基丙酸酯(式(15))，[2-(4-氯磺酰基-3-硝基苯甲酰基)肼基]2,2-二甲基丙酸酯(式(16)，[2,2-二甲基丙酰氧基-[2-[4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氧基甲基]苯氧基]-2-氧代-乙氧基]氨基]2,2-二甲基丙酸酯(式(17))，[2-(2,2-二甲基丙酰氧基)-2-[2-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氧基丙磺酰基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]肼基]2,2-二甲基丙酸酯(式(18))，[2-(2,2-二甲基丙酰氧基)-2-[2-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氧基乙基磺酰基]乙基氨基]-2-氧代-乙基]肼基]2,2-二甲基丙酸酯(式(19))，[2-[5-叠氮基-2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氧基甲基]苯甲酰基]肼基]2,2-二甲基丙酸酯(式(20))，[3-[(2,2-二甲基丙酰氧氨基)氨基甲酰基]-4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氧基甲基]苯基]2,6-双(2,2-二甲基丙酰氧氨基)己酸酯(式(21))，[2-[2-[2-[2-(4-硝基苯氧基)羰基氧基丙磺酰基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]肼基]2,2-二甲基丙酸酯(式(22))，[2-[2-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氧基-丙磺酰基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]肼基]2,2-二甲基丙酸酯(式(23))，[2-[2-[4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氧基甲基]苯氧基]-2-氧代-乙基]肼基]2,2-二甲基-丙酸酯(式(24))，[2-[2-[2-(4-硝基苯氧基)羰基氧基乙磺酰基]乙氧羰基]肼基]2,2-二甲基丙酸酯(式(25))，[3-[[2-(2,2-二甲基丙酰氧基)肼基]甲基]-4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氧基甲基]苯基]2,6-双(2,2-二甲基丙酰氧氨基)己酸酯(式(26))，[2-[[5-叠氮基-2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氧基甲基]苯基]甲基]肼基]2,2-二甲基丙酸酯(式(27))，
在一些实施方式中，根据式(1)的化合物选自根据式(14)、(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)和(21)的化合物。
在一些实施方式中，根据式(1)的化合物选自根据式(16)、(19)、(20)和(21)的化合物。
在另一方面中，本发明的目的通过应用一种根据第一方面的化合物得以实现，该化合物实现全长肽的N端氨基和固相之间的连接。
在另一方面中，本发明的目的通过一种根据式(12)的化合物，X1-L-Y-PEP(12)，得以实现，其中通过第一方面及其实施方式定义X1、L和Y，并且其中PEP包括全长肽，而该全长肽通过其N端与X2’连接。
在另一方面中，本发明的目的通过一种根据式(13)的化合物，D-X1’-L-Y-PEP(13)，得以实现，其中D是表面修饰的固体载体，其特征在于，通过合成或天然聚合物对表面进行修饰，其中X1’具有-NH-O-、-NH-NH-或-C(＝O)-的形式，并且其中L、Y和PEP通过第一方面及其实施方式定义。
在一些实施方式中，表面修饰的固体载体D由修饰的多糖表征。
在一些实施方式中，表面修饰的固体载体D由醛或者肼修饰的琼脂糖凝胶/琼脂糖或纤维素表征。
在另一方面中，本发明的目的通过一种用于纯化肽的方法得以实现，特别是借助于固相肽合成(SPPS)制备的肽，所述方法包括下列步骤：
i.将待纯化的全长肽和至少一种杂质，特别是至少一种乙酰化的终止序列的组合物与通过第一方面及其实施方式定义的捕获化合物接触，随后反应，以产生式(12)的化合物，
ii.通过添加酸，使对酸不稳定的保护基团裂解，
iii.将步骤ii中的组合物与表面修饰的固体载体接触，其中在捕获化合物和固体载体之间形成共价腙或肟键，并提供式(13)的化合物，
iv.使全长肽从固体载体上裂解。
在一些实施方式中，步骤i.包括将还处于固相(合成树脂)上的全长肽和终止序列的混合物与通式X1-L-X2的化合物(捕获分子)接触，其中按上文定义X1、X2和L，并且其中进行接触的步骤引起化合物X1-L-X2在X2上与全长肽的游离N端氨基的反应，以形成共价键。借助于酸，进行肽从固相(合成树脂)上的裂解，由此获得固相肽合成(SPPS)制得的与捕获分子共价连接的全长肽与肽的乙酰化的终止序列的混合物。例如通过过滤，进行固相和液相的分离。在-78℃至0℃的温度下，通过在醚中的沉淀，移除非肽的杂质。优选地，在此将酸混合物加入到所提供的醚中，其中所有肽材料都沉淀下来，而有机杂质保留在醚中。接下来，例如通过离心作用来将醚溶液与肽混合物分离。获得无定形固体形式的肽混合物。
在一些实施方式中，步骤ii.包括使步骤i)中的无定形固体溶于在pH值处于2至4之间，优选地处于2.5至3.5之间，尤其优选地为3的至少部分水性的缓冲溶液中。在此通过添加酸或碱，适当地调节pH值。
在一些实施方式中，步骤iii.包括使ii)中的混合物与表面修饰的固体载体(纯化树脂)接触，以通过形成腙或肟键，共价连接通过捕获分子(步骤i)修饰的全长肽。在此尤其有利的是，添加胺和/或乙酸作为催化剂，以改善连接反应的动力学。
通过用有机溶剂和/或用水和水性缓冲溶液洗涤，移除并非通过腙/肟键与固体载体结合的肽终止序列，优选加入离液物质，以溶解可能非共价结合的肽。
在一些实施方式中，步骤iv.包括通过在碱性(亲核)条件下接头L从Y上的裂解，使全长肽从固相上分离，其中以CO2或SO2的形式释放Y。
在从式(13)(D-X1’-L-Y-PEP)开始的全长肽的裂解过程中，产生全长肽(PEP)、CO2或SO2(Y’)以及D-X1’-L或D’和X1’-L’。
在一些实施方式中，固体载体在其表面上具有官能基团醛、酮、羟胺和肼。
在一些实施方式中，固体载体在其表面上具有官能基团-O-CH2-CHO。
在一些实施方式中，固体载体在其表面上具有官能基团-ONH2或-N2H3。
在一些实施方式中，通过过滤将固相与期望的全长肽分离；通过用肼(H4N2)和/或氢氧化铵H4NOH和/或醛和/或酮处理和/或用水洗涤，再生固相(纯化树脂，D)。
使用酸来使肽从合成树脂上裂解(步骤i)，在此优选的是pks值低于4的有机酸和无机酸。尤其适合的是选自含氟酸的组的酸：三氟乙酸(TFA)、氢氟酸(HF)和三氟甲烷磺酸。除此之外，适合的是：氢溴酸(HBr)、盐酸(HCl)、亚硫酸(H2SO3)、硫酸(H2SO4)、磷酸(H3PO4)、硝酸(HNO3)或甲磺酸。
对于步骤i)中的沉淀，使用在沉淀温度下以液体形式存在的有机溶剂，这些溶剂对于本领域技术人员而言通常是已知的。优选来自醚类的有机溶剂，尤其优选二乙醚和/或甲基叔丁醚。也可以使用在沉淀温度下呈液体形式的烷烃，其中尤其优选的是正己烷和/或正戊烷。在步骤ii)中应用的、恰当的至少部分水性的缓冲溶液对于本领域技术人员而言是已知的，即在2-5的pH范围内具有缓冲量的缓冲剂，由此是具有下列阴离子的缓冲剂：柠檬酸盐、苹果酸盐、甲酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐、新戊酸盐和磷酸盐，其与下列阳离子组合：钠、钾、铵(NH4、NMe4、NEt4、NPr4、NBu4、HNC5H5)。
为了调节pH值，可以使用有机或无机酸，优选HCl，并且优选使用碱金属类氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物作为碱，尤其优选NaOH和/或KOH。
为了更好地溶解肽，在步骤ii)中可能有利的是，向系统中加入可与水混溶的有机溶剂，这些溶剂对于本领域技术人员而言通常是已知的，并且可以选自以下组：二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈。四氢呋喃(THF)、二恶烷、吡啶、丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮(NMP)。
为了加速步骤iii)中的固定化，可以将胺和/或乙酸加入水溶液中。胺在此可以选自由以下组成的组：吡啶、哌啶、甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、苯胺和二甲胺。
可以考虑合成及天然聚合物作为步骤iii)中的表面修饰的固体载体(纯化树脂)。表面修饰在此使得其与X1反应，产生腙或肟。如果X是根据式(2)或(3)的化合物，则在醛基或酮基中产生表面修饰，其随后对应地反应，产生腙或肟。如果X1是通式(4)的醛或酮官能团，则表面修饰应具有-ONH2或-N2H3。优选的固体载体是表面修饰的天然或生物聚合物，尤其优选是表面修饰的多糖。更尤其优选的是，使用醛修饰的琼脂糖凝胶/琼脂糖以及纤维素，其中X1是根据式(3)的化合物，其中R1和R3是H。
在步骤iii(洗涤结合在纯化树脂上的全长肽)中可以用水、水性洗涤液或有机溶剂进行洗涤。下列元素适合作为步骤iii中的水性洗涤液的离液物质：钡盐、盐酸胍、硫氰酸胍、硫氰酸盐、高氯酸盐、碘化物、丁醇、苯酚、硫脲、尿素或硫酸铵。溶剂可以选自下列组：二氯甲烷(DCM)、三氯甲烷、四氯化碳、乙酸乙酯、二乙醚、甲基叔丁醚、乙酸、2,2,2-三氟乙醇、六氟异丙醇、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈。四氢呋喃(THF)、二恶烷、吡啶、丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、苯酚、甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮(NMP)。
步骤iv中的裂解通过水性溶液或者溶解肽的有机溶剂中的碱实现。碱可以选自下列组：LiOH、NaOH、KOH、铵(NH4、NMe4、NEt4、NPr4、NBu4、HNEt(iPr)2、HNMe3、HNEt3、HNPr3、HNBu3、HNC5H5)氢氧化物、哌啶、甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、肼、羟胺、甲基肼和O-甲基羟胺。溶解肽的有机溶剂可选自下列组：二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈。四氢呋喃(THF)、二恶烷、吡啶、丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇和1-丁醇。
步骤iv)中的过滤优选借助于市售的注射器反应器或过滤系统进行。滤孔尺寸应处于10至100μm之间。
在一些实施方式中，在全长肽从固体载体上裂解后或过程中，固体载体D从捕获化合物的残基X1-L上裂解，并且使固体载体再生。
根据本发明的方法的特别的优势在于，腙键以及肟键的可逆性。
可以通过腙/肟键的平衡特性，例如亲和色谱法，利用在此描述的方法。在洗掉或洗去杂质以及对碱不稳定的接头裂解后，并且由此在获得目标肽后，纯化树脂可以再次再生，并且由此可以用于进一步的纯化。如果醛或酮基团最初存在于纯化树脂的表面上，则用溶解在醛或酮中的酸性水性溶液进行的洗涤再次恢复醛或酮的官能。如果肼或羟胺衍生物最初存在于纯化树脂的表面上，则用具有肼或羟胺的酸性水性溶液进行的洗涤再次恢复肼或羟胺官能。使用与借助于亲和色谱法进行的蛋白质净化相同的材料，琼脂糖凝胶/琼脂糖。
另外，该方法可以转用到纤维素上，该纤维素是地球上最常见的生物材料并且由此可以低成本获得。
按照标准，通过亲和色谱法净化蛋白质，并且与HPLC纯化相比，该方法也极其便宜以及高效且可扩展。由于低压和较高的负载密度，亲和色谱法也比HPLC更适合于大量合成。
在当前发明的第一方面的子方面中，该目的通过一种化合物得以实现，该化合物作为接头，在全长肽的N端氨基与固相之间建立连接。根据本发明的化合物具有通式
X1-L-X2，
其中
X1选自其中Y1＝O,N，并且其中R1和R2可以相同或不相同，并且R1和R2是H或B，其中B是用于氨基的非碱不稳定的保护基团，该保护基团在酸性条件下提供胺。
在一种优选的实施方式中，B选自下列组：Boc(-C＝OOtBu)、三苯甲基(-C(Ph)3)、Mmt(-C(Ph)2C6H4OMe)、DMT(-C(Ph)(C6H4OMe)2)、Cbz(-C＝OOCH2Ph)、亚苄基胺(＝CPh)、邻苯二甲酰亚胺(＝(CO)2C6H4)、对甲苯磺酰胺(-SO2C6H4Me)、苯甲胺(-CH2Ph)、乙酰胺(-COMe)、三氟乙酰胺(-COCF3)、Dde(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-乙基)以及1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-甲基丁基(ivDde)。
对于本领域技术人员而言，根据P.G.M.Wuts，T.W.Greene，Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis，第四版，Wiley，2007，第696页到第926页，已知进一步的保护基团。
X1可以替代地是其中R3＝H，或者长度最长达12个碳原子的饱和或不饱和的、分支的或未分支的、取代或未取代的脂族或芳香族链，并且其中醛或酮基团能够以对于本领域技术人员而言已知的方式方法受保护地存在。
其中n可以处于0到12之间，尤其优选地是0、1或2。
可以在酸性条件下裂解的所有缩醛缩酮保护基团都可以用作受保护的醛或酮。概述特别地可参见文献：P.G.M.Wuts，T.W.Greene，Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis，第四版，Wiley，2007，第435页到第477页。
X2可以是其中Z是吸电子的离去基团，该离去基团在异裂键断裂时携带结合的电子对。在一种特别的实施方式中，Z选自F、Cl、Br、J、N3、SR8(其中如R3一样定义R8)、OCF3、OCH2CF3，
因此，X2代表氨基甲酸酯前体，其应与全长肽的氨基形成氨基甲酸酯。
L是隔开X1和X2并且在碱性条件可(亲核)裂解的官能性接头。关于可亲核裂解的接头的选择可参见F.Guillier，D.Drain，M.Bradley，Linkers and Cleavage Strategies in Solid-Phase Organic Synthesis and Combinatorial Chemistry，Chem.Rev.2000，100，2091-2157。
在一些实施方式中，根据通式X1-L-X2的化合物是其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，根据通式X1-L-X2的化合物被用作接头，其在全长肽的N端氨基和固相之间形成连接。
在一种优选的实施方式中，接头L选自通用结构a、b或c，
A：C0-C12，芳香族，脂族，不饱和，饱和的
R4：H.烷基或吸电子的基团
R5，R6：相同或不同的H或者烷基C1-C12
R7：相同或不同的H，吸电子的基团或者烷基C1-C12
其中A是长度处于O到12个碳原子之间的、饱和或不饱和的、分支的或未分支的、取代或未取代的脂族或芳香族链，并且其中R4＝H，是O至12个碳原子的烷基链或能够通过诱导或中介效应吸引电子的基团。
其中R5和R6可以相同或不同，并且R5、R6＝H，是长度为1至12个碳原子的烷基链或能够通过诱导或中介效应吸引电子的基团。R7是H，是长度为1至12个碳原子的烷基链或能够通过诱导或中介效应吸引电子的基团。
R8和R3一样。
在另一方面中，本发明的目的通过一种方法得以实现，该方法包括下列步骤。
i)将还处于固相(合成树脂)上的全长肽和终止序列的混合物与通式X1-L-X2的化合物(捕获分子)接触，其中按上文定义X1、X2和L，并且其中进行接触的步骤引起化合物X1-L-X2在X2上与全长肽的游离N端氨基的反应，以形成共价键。
ii)借助于酸，使肽从固相(合成树脂)上裂解，并且获得固相肽合成(SPPS)制得的与捕获分子共价连接的全长肽与肽的乙酰化的终止序列的混合物；
iii)例如通过过滤，分离固相和液相；
iv)在-78℃至0℃的温度下，通过在醚中的沉淀，移除非肽的杂质。优选地，在此将酸混合物加入所提供的醚中，其中所有肽材料都沉淀下来，而有机杂质保留在醚中。接下来，例如通过离心作用来将醚溶液与肽混合物分离。获得无定形固体形式的肽混合物；
v)将步骤iv)中的无定形固体溶于在pH值处于2至4之间，优选地处于2.5至3.5之间，尤其优选地为3的至少部分水性的缓冲溶液中。在此通过添加酸或碱，适当地调节pH值；
vi)使v)中的混合物与表面修饰的固体载体(纯化树脂)接触，以通过形成腙或肟键，共价连接通过捕获分子(步骤i)修饰的全长肽。在此尤其有利的是，添加胺和/或乙酸作为催化剂，以改善连接反应的动力学；
vii)通过用有机溶剂和/或用水和水性缓冲溶液洗涤，移除并非通过腙/肟键与固体载体结合的肽终止序列，优选加入离液物质，以溶解可能非共价结合的肽。
viii)通过在碱性(亲核)条件下接头L的裂解，将全长肽与固相分离；
ix)过滤，以使固相与期望的全长肽分离；并且
x)通过用肼(H4N2)和/或氢氧化铵H4NOH和/或醛和/或酮处理和/或用水洗涤，再生固相(纯化树脂)。
使用酸来使肽从合成树脂上裂解(步骤ii)，在此优选的是pks值低于4的有机酸和无机酸。尤其适合的是选自含氟酸的组的酸：三氟乙酸(TFA)、氢氟酸(HF)和三氟甲磺酸。除此之外，适合的是：氢溴酸(HBr)、盐酸(HCl)、亚硫酸(H2SO3)、硫酸(H2SO4)、磷酸(H3PO4)、硝酸(HNO3)、甲磺酸。
对于步骤iii)中的沉淀，使用在沉淀温度下以液体形式存在的有机溶剂，这些溶剂对于本领域技术人员而言通常是已知的。优选来自醚类的有机溶剂，尤其优选二乙醚和/或甲基叔丁醚。也可以使用在沉淀温度下呈液体形式的烷烃，尤其优选的是正己烷和/或正戊烷。
在步骤v)中应用的、恰当的至少部分水性的缓冲溶液对于本领域技术人员而言是已知的，即在2-5的pH范围内具有缓冲量的缓冲剂，由此是具有下列阴离子的缓冲剂：柠檬酸盐、苹果酸盐、甲酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐、新戊酸盐和磷酸盐，其与下列阳离子组合：钠、钾、铵(NH4、NMe4、NEt4、NPr4、NBu4、HNC5H5)。
为了调节pH值，可以使用有机或无机酸，优选HCl，并且优选使用碱金属类氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物作为碱，尤其优选NaOH和/或KOH。
为了更好地溶解肽，在步骤v)中可能有利的是，向系统中加入可与水混溶的有机溶剂，这些溶剂对于本领域技术人员而言通常是已知的，并且可以选自以下组：二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈。四氢呋喃(THF)、二恶烷、吡啶、丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮(NMP)。
为了加速步骤vi)中的固定化，可以将胺和/或乙酸加入水溶液中。胺在此可以选自由以下组成的组：吡啶、哌啶、甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、苯胺和二甲胺。
可以考虑合成及天然聚合物作为步骤vi)中的表面修饰的固体载体(纯化树脂)。表面修饰在此使得其与X1反应，产生腙或肟。如果(Y1＝NH、O)，则在醛基或酮基中产生表面修饰，其随后对应地反应，产生腙或肟。如果X1是通式-R3C＝O的醛官能团或酮官能团，则表面修饰应具有NH2-Y1-R7(R7＝固体载体)基团。优选的固体载体是表面修饰的天然或生物聚合物，尤其优选是表面修饰的多糖。更尤其优选的是使用醛修饰的琼脂糖凝胶/琼脂糖以及纤维素，并且X1＝NH2-NH-C＝OO-。
在步骤vi(洗涤结合在纯化树脂上的全长肽)中可以用水、水性洗涤液或有机溶剂进行洗涤。下列元素适合作为步骤vi中的水性洗涤液的离液物质：钡盐、盐酸胍、硫氰酸胍、硫氰酸盐、高氯酸盐、碘化物、丁醇、苯酚、硫脲、尿素、硫酸铵。溶剂可以选自下列组：二氯甲烷(DCM)、三氯甲烷、四氯化碳、乙酸乙酯、二乙醚、甲基叔丁醚、乙酸、2,2,2-三氟乙醇、六氟异丙醇、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈。四氢呋喃(THF)、二恶烷、吡啶、丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、苯酚、甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮(NMP)。
步骤ii中的裂解通过水性溶液或者溶解肽的有机溶剂中的碱实现。碱可以选自下列组：LiOH、NaOH、KOH、铵(NH4、NMe4、NEt4、NPr4、NBu4、HNEt(iPr)2、HNMe3、HNEt3、HNPr3、HNBu3、HNC5H5)氢氧化物、哌啶、甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、肼、羟胺、甲基肼和O-甲基羟胺。溶解肽的有机溶剂可以选自下列组：二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈。四氢呋喃(THF)、二恶烷、吡啶、丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇和1-丁醇。步骤viii中的过滤优选地借助于市售的注射器式反应器或过滤系统进行。滤孔尺寸应处于10至100μm之间。
在一些实施方式中，根据本发明的方法的特征在于，通过过滤进行固相和液相的分离。
在一些实施方式中，根据本发明的方法的特征在于，在步骤vi中添加胺和/或乙酸作为催化剂。
在一些实施方式中，根据本发明的方法的特征在于，步骤v中的缓冲溶液具有处于2.5至3.5之间，优选地为3的pH值。
在一些实施方式中，根据本发明的方法的特征在于，通过用有机溶剂和/或用水和水性缓冲溶液洗涤，在步骤vii中进行移除，优选加入离液物质，以溶解可能非共价结合的肽。
在一些实施方式中，根据本发明的方法的特征在于，在步骤viii中通过在碱性(亲核)条件下接头L的裂解，进行全长肽从固相上的分离。
在一些实施方式中，根据本发明的方法的特征在于，为了使肽从合成树脂上分离，在步骤ii中使用pks值小于4的酸。
在一些实施方式中，根据本发明的方法的特征在于，为了进行沉淀，在步骤iii中使用有机溶剂，该有机溶剂选自醚类，尤其优选二乙醚和/或甲基叔丁醚，或正己烷或正戊烷。
在一些实施方式中，根据本发明的方法的特征在于，在步骤vi中使用合成和天然聚合物作为表面修饰的固体载体(纯化树脂)，例如表面修饰的多糖，尤其优选醛修饰的琼脂糖凝胶/琼脂糖或纤维素，并且X1＝NH2-NH-C＝OO-。
根据本发明的方法的特别的优势在于，腙键以及肟键的可逆性。
可以通过腙/肟键的平衡特性，例如亲和色谱法，利用在此描述的方法。在洗掉或洗去杂质以及对碱不稳定的接头裂解后，并且由此在获得目标肽后，纯化树脂可以再次再生，并且由此可以用于进一步的纯化。如果醛或酮基团最初存在于纯化树脂的表面上，则用溶解在醛或酮中的酸性水性溶液进行的洗涤再次恢复醛或酮的官能团。如果肼或羟胺衍生物最初存在于纯化树脂的表面上，则用具有肼或羟胺的酸性水性溶液进行的洗涤再次恢复肼或羟胺官能团。使用与借助于亲和色谱法进行的蛋白质净化相同的材料，琼脂糖凝胶/琼脂糖。
另外，该方法可以转用到纤维素上，该纤维素是地球上最常见的生物材料并且由此可以低成本获得。
按照标准，通过亲和色谱法净化蛋白质，并且与HPLC纯化相比，该方法也极其便宜以及高效且可扩展。由于低压和较高的负载密度，其比HPLC更适合于大量合成。
在下文中，应参考附图，根据一些实施例，阐述本发明，但其中不限制教导的一般性地。
一般合成方案
能够按照一般合成方案(1)，制备根据本发明的捕获分子。按照该方案，可以改变羟胺和肼之间的接头分子的左侧亲核部分。同样可以改变接头L的可裂解部分。可以区分砜接头和苯酚酯接头系统。此外，接头系统的右侧碳酸盐部分可以具有不同的离去基团。由此，这导致了大量可能的组合。组块L1和L3是市面上有售的，可以根据方案2制备L2。
其中，Dioxan是二噁烷。
方案1：用于符合标准模块原理的接头合成的一般合成方案。a)i)CH2Cl2，ii)对于硫醚组块L1和L2而言，其在CH2Cl2中被mCPBA氧化成砜。DCC：二环己基碳二亚胺，DIEA：二异丙基乙胺，Boc：叔丁氧羰基。
方案2：接头组块L1和L2的合成。
附图说明
为了对根据本发明的方法进行阐述，图1示出了其示意图。i)通过每次偶联后的乙酰化以及n次重复进行SPPS；ii)添加分子X1-L-X2；iii)固定化；iv)洗涤；v)碱性裂解；vi)过滤；vii)再生。1：纯化树脂，2：捕获分子，3：天然肽(期望的产物)，4：终止序列，x＝1至n，n：全长肽，n-x：终止序列。
图2示出了在测量用0.5vol.％的N2H4裂解肽(方案3中的化合物3)后的上清液时，278nm处的吸光度，以演示实施例1中腙键的可逆性。Abs.：负载有肽的醛修饰的琼脂糖载体的上清液在278nm处的吸光度。t：在添加了0.5％的肼溶液后经过的时间(以分钟(min)为单位)。n：基于吸光度计算得出的上清液中肽的量(以nmol为单位)。虚线：非线性回归，公式为：y＝0.142*x/(3.16+x)，R2＝92，t1/2＝3.16min。图3示出了根据实施例2的天然化学连接(NCL)后，根据本发明对肽进行纯化时各个相的色谱图。色谱图1示出了24小时后NCL的反应混合物中的期望的产物(P)。色谱图2示出了固定化30分钟后的上清液。色谱图3示出了30分钟的洗涤和裂解后的期望的产物(P)。P：期望产物的峰值。
图4示出了在根据实施例4的固相肽合成后，根据本发明纯化肽7-13的过程中的色谱图。用上清液标记的色谱图示出了可通过该方法分离的杂质。FM＝根据本发明的捕获分子；(a)肽7(Tau1)；(b)肽8(Tau2)；(c)肽9(GNRH)；(d)肽10(蛙皮素)；(e)肽11(Terts72Y)；(f)肽12(比伐卢定(Bivalrudin))；(g)肽13(TAT)；(h)肽14(研究肽)。相应的上图示出了合成后的肽，相应的下图示出了纯化后的肽。
为了对根据本发明的方法进行阐述，图5示出了其示意图。图5示出了图1的替代图。
SEQ ID No：1至10示出了根据实施例1、2和4的肽。
具体实施方式
实施例
实施例1：腙键/肟键的可逆性的演示
在下文中，使用腙键的实施例，演示肽与醛修饰的琼脂糖珠的可逆结合，由于电子相似性(也参见A.Dirksen，P.Dawson，Bioconjugate Chem.2008，19，2543-2548)，这些结果也可以转用至肟键。示出了，可以通过添加肼(N2H4)来控制平衡。
方案3：肽和纯化树脂之间的腙键的可逆性。i)0.1M NH4OAc，pH＝4，0.1M PhNH2，30分钟；ii)0.5％N2H4，5mM TCEP；肽序列(黑色区域中的白色字母序列)是SEQ ID NO：1。
在30分钟内，将肽3在缀合缓冲剂(0.1M NH4OAc，0.1M PhNH2，pH＝3)中施用至载体1(方案3)。接下来用水洗涤并且移除上清液。然后将0.5体积百分比的水合肼溶液加入到珠上，并以时间间隔测量上清液(200μL)在278nm处的吸光度(使用NanoDrop Technologie公司的设备ND-I000分光光度计)。在此示出了，在10分钟后，可在上清液中测得80％的肽。在接下来的50分钟后，可以恢复86％的肽。通过非线性衰减，确定了三分钟的半衰期，图2示出了在加入N2H4后，测量上清液时278nm处吸附。
实施例2：天然化学连接(NCL)后的肽的纯化
对来自含有肽物质混合物以及有机和无机杂质的复杂系统的肽进行纯化。
方案4：天然化学连接后肽的纯化i)0.1M Na2HPO4，3M Gdn*HCl，20mM TCEP，50mM MesNa，1％(v/v)PhSH，pH＝7，15小时；ii)加入琼脂糖凝胶树脂和2倍体积的0.1M NH4OAc，pH＝2.5，pH＝4，30分钟；iii)洗涤H2O，EtOH；iv)N2H4，4mM TCEP，30分钟。肽序列配属于SEQ ID NO：1(黑色区域中的白色字母序列)和SEQ ID NO：2(白色区域中的“YENDRIK”)。
在NCL后获得待纯化的混合物(方案4)。该反应发生在水性缓冲系统中，并且用于合成较大的肽和蛋白质结构域。在24小时的NCL反应时间后，存在粗混合物，该粗混合物主要含有期望的连接产物以及过量使用的硫酯(H-YENRIK-MESA)。这可以在图3中的色谱图(Waters公司的UPLC-MS，Acquity H-Class PDA/QDa，在Polaris C18 A 5μm 250/4柱上)中看出。
将两倍体积的缀合缓冲剂加入到连接缓冲剂(0.1M Na2HPO4，20mM TCEP，50mM MesNa，pH＝7)中。随后，加入修饰的琼脂糖凝胶珠，并且振荡两相系统30分钟。借助于UPLC-MS分析琼脂糖凝胶的上清液(图3，色谱图2)，在连接的质谱仪中没有发现可以分配给连接产物的质量。然而，由于在产物的保留时间中可以看到吸收信号，因此同样清楚的是，可以移除不能通过HPLC分离的杂质。在用水和少量乙醇和乙腈洗涤后，将0.5vol.％水合肼水合物加入到装载肽的琼脂糖珠中，并且在30分钟后分析上清液，其中得到色谱图3(图3)。这示出了肽(期望产物)的超过90％的高纯度。
实施例3：固相肽合成后的肽混合物的示例性纯化
接下来描述根据本发明的纯化的反应方案(方案5)。
方案5：根据本发明，对固相肽合成(SPPS)后的肽混合物进行纯化i)通过每次偶联后的乙酰化以及n次重复进行SPPS；ii)添加分子2；iii)用TFA裂解；iv)通过添加pH 3-4的Ph-NH2，固定化在纯化树脂上；v)用水和缓冲剂进行洗涤；vi)5％的NH4OH碱；vii)通过添加H2O/丙酮/TFA(49.5/49.5/1)，再生纯化树脂1。1：纯化树脂，2：捕获分子，3：天然肽(期望的产物)，4：终止序列，x＝1至n，n：全长肽，n-x：终止序列。
方案6：琼脂糖珠的官能化i)NaOH，NaBH4，H2O，室温，o/n，18小时；ii)20mM NaIO4，H2O，室温，1小时。
在固相合成(SPPS)后，将捕获分子2(方案5)施加于最后偶联的氨基酸。此处的重要前提是在前面步骤中完整地完成乙酰化。此后，所有终止序列和捕获分子修饰的全长肽从树脂上裂解。随后，通过醚沉淀移除非肽杂质，并将粗肽混合物溶解在pH为3-4的乙酸盐缓冲剂中，其中在乙酸盐缓冲剂中加入0.1M苯胺作为催化剂。现在将该溶液加入到官能化的琼脂糖凝胶珠1中(方案5和6)。该材料可在蛋白质纯化中用作亲和色谱法的材料。琼脂糖凝胶具有易于穿透肽的优点。琼脂糖凝胶先前已被醛修饰过(参见上述方案)，琼脂糖凝胶的醛修饰可从J.Guisan，Enzyme Microb.Technol.1988，10，第375页中已知。
在此，只有肽锚定在固体载体上，其携带具有酰肼功能的捕获分子。理论上也可以与醛反应的胺在所用的pH值下被质子化，因此对于在醛上的作用而言不够亲核。仍然存在于琼脂糖凝胶中的终止序列可以用水冲洗掉。用例如氨水等碱性溶液处理琼脂糖凝胶允许捕获分子分裂，并且全长肽变成溶液。然后可以将溶液冻干，除去氨。之后获得固体纯形式的肽。该方法的一个优点是快速固定化和对不同肽的广泛适用性。
实施例4：纯化树脂的示例性再生
在用捕获分子2进行肽纯化(方案5)后，1的原始醛官能团保持被肼阻断，为了提供再次用于新纯化循环的纯化树脂，必须再生树脂，并且由此恢复醛官能团。这在通过添加醛或酮来改变平衡时实现。示例性可行性如下所示。纯化树脂1被分成三个相等的等分试样(I、II、III)，并且用缀合缓冲剂中的肼处理两个等分试样(II、III)30分钟。然后用水洗涤，并且用水、丙酮和TFA(49.5:49.5:1)构成的混合物洗涤等分试样III七次。此后，用缀合缓冲剂中的FmocN2H3处理所有等分试样14小时，并且之后用水、DMF和水分别洗涤五次。然后用DMF/哌啶(20％)处理两次，每次4分钟，然后测量上清液中所得芴哌啶加合物在301nm处的UV吸收(Hellma公司的1mL半微量石英比色皿中的BioRad公司的SmartSpecTMPlus分光光度计)。未处理的等分试样I示出了27μmol/g的负载量；没有再生的等分试样II具有18μmol/g(I的67％)的负载量，并且再生树脂示出了25μmol/g(I的93％)的负载密度。该实验示出了纯化树脂的成功再生。
表1：不同再生处理后纯化树脂的紫外吸收和负载密度
实施例5：肽混合物的纯化
根据本发明的用于纯化肽的方法被应用至七种不同极性的肽，这些是阿尔茨海默症相关的Tau蛋白质的H-TLADEVSASLAK-OH(SEQ ID No：3)(7)片段427-438、Tau的H-ATLADEVSASLAK-NH2(SEQ ID No：4)(8)片段427-439、来自蛋白质促性腺激素释放激素原2(Progonadoliberin-2)(9)的半胱氨酰肽H-CQWSLHRKRHLARTLLTAAREPRPAPPSSNKV-NH2(SEQ ID NO：5)(8)、H-GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS-NH2(SEQ ID NO：6)蛙皮素(10)、H-YLFFYRKSV-NH2Terts72Y(SEQ ID NO：7)(11)、H-FPRPGGGGNGDFEEIPEEYL-NH2(SEQ ID NO：8)比伐卢定(12)以及H-GRKKRRQRRRPQ-NH2TAT(SEQ ID NO：9)(13)。
将粗肽混合物溶解在缀合缓冲剂中，并在30-60分钟内施加到琼脂糖凝胶珠1上，然后用水和中性水溶液(4M尿素，1M盐)洗涤，以移除所有乙酰化的终止序列和其它杂质。用5％氨水溶液在20分钟内完成接头2的裂解(方案7)，接下来现场用乙酸中和，并且提高溶解度。
借助于UPLC-MS(超高效液相色谱质谱联用)，检查单个阶段的纯度。未纯化(无捕获分子FM)肽和已纯化肽以及含有杂质的上清液的色谱图都参见图4。对于7可以达到85％的肽纯度(最初为39％)，对于8肽纯度为93％(最初为39％)，对于9为80％(最初为24％)，对于10为90％(最初为23％)，对于11为87％(最初为60％)，对于12为90％(最初为40％)，对于13为95％(最初为37％)(见图4)。
表2：在应用根据本发明的纯化方法后，不同肽的纯度和产量
按照接下来的方案7进行对碱不稳定的接头2的合成。
方案7：对碱不稳定的接头的合成i)N2H4*H2O；ii)2.2当量pNO2PhCO2Cl；iii)mCPBA；n：肽。
材料和方法
肽的固相肽合成以及纯化
使用Intavis AG的MultiPep RS肽合成自动装置，在25μmol的方法中完成自动化的固相肽合成。肽酰胺的合成在来自Rapp Polymer公司的Tentagel R RAM树脂(0.2mmol·g-1)上进行。在合成开始之前，将树脂转运到对3mL注射器式反应器(Multisyntech公司的PE反应器)中并且在DMF中溶胀。除非另有说明，否则关于当量的说明是指所用树脂的初始加载。
Fmoc裂解：为了裂解临时Fmoc保护基团，使用400μL哌啶/DMF(4:1)处理树脂两次，一次处理4分钟，另一次处理6分钟，并且随后用800μL DMF洗涤五次，并且继续Fmoc氨基酸衍生物的偶联。
Fmoc氨基酸衍生物的偶联：在室温下，5当量氨基酸在DMF中的溶液与4.5当量HCTU在DMF(0.3M)中的溶液和10当量预活化的NMM在DMF(0.6M)中的溶液温育1分钟，并且随后将其加入到树脂中。在30分钟的反应时间后，用800μL DMF洗涤树脂三次，并继续阻断终止序列。
阻断终止序列：用400μl AC2O/2,6-二甲基吡啶/DMF(5:6:89)溶液处理树脂一次，持续5分钟，并且紧接着分别用800μl DMF洗涤七次。
最后的步骤——捕获分子的偶联：作为固相肽合成的最后步骤，将捕获分子2偶联至期望的目标肽。将合成树脂与DMF(0.3M)中的5当量捕获分子2、DMF(0.3M)中的5当量2-肟氰乙酸乙酯(Oxyma)及DMF(0.7M)中的12当量DIPEA构成的溶液混合。在60分钟的反应时间后，分别用800μL的DMF洗涤两次。
从聚合物载体上释放：向树脂中加入2mL 96％TFA、2％水、2％三异丙基硅烷的溶液，在目标序列中有含硫醇的氨基酸(半胱氨酸或甲硫氨酸)的情况下，向溶液中加入0.5％乙二硫醇和0.5％茴香硫醚，其中TFA的量减少了1％。将该裂解混合物掺入合成树脂，并且在室温下振荡2小时。随后收集裂解溶液，并且分别用1mL的TFA对树脂进行两次再洗涤。将裂解溶液与洗涤液合并，并在50ml冷二乙醚中沉淀。接下来离心分离该悬浮液，并且弃去有机上清液。
在纯化树脂上的固定化：在离心分离后，将粗沉淀物溶于在3ml缀合缓冲剂(0.1M NH4OAc，0.1M苯胺，pH＝3)中，当混合物未溶解时，加入乙腈。该溶液被加入到bBraun公司的6ml喷射器中，该喷射器具有Multisyntech公司的孔径为25μm的PE过滤元件，在该注射器中有以克为单位官能化的琼脂糖凝胶。固定化进行30至60分钟。接下来用纯度为MilliQ的去离子水洗涤5次，用4M尿素溶液洗涤5次，用水洗涤5次。随后，用5v％NH4OH和1v％巯基乙醇的水溶液，碱性地使期望的肽从树脂上裂解。冻干提供白色絮状固体形式的期望的肽。
捕获分子2的合成(方案7中的化合物2——对应于化合物(25))：
叔丁基羧酸肼5(方案7中的化合物5)
在0℃下，将异丙醇(100mL)逐滴掺入一水合肼(80％，32.5g，520mmol)，将异丙醇(50mL)中的Boc2O(50.0g，230mmol)构成的溶液逐滴掺入。在添加后，反应混合物变浑浊，并且在室温下继续搅拌2小时。移除溶剂，将残余物溶于二氯甲烷中，并且用硫酸镁干燥。然后，蒸发溶剂，并且残余物用己烷重结晶，由此产生无色晶体形式的标题化合物5(22.8g，75％)。熔点36-37℃Rf(EtOAc/己烷1:1)0.20。1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ6.16(s，1H，NH)，3.67(s，2H，NH2)，1.42(s，9H，C(CH3)3)。13C-NMR(75MHz，CDCl3，TMS)：δ158.3，77.2，28.5。分析数据与文献数据一致(A.Bredihhin，Tetrahedron 2008，64，6788-6793)。
双(4-硝基苯基)(硫代双(乙烷-2,1-二基))双(碳酸酯)6(方案7中的化合物6)
将6.72(33mmol)4-硝基苯氯甲酸加入到1.87ml(2.12g，15mmol)2,2-硫代双乙醇在40ml无水二氯甲烷中的溶液中。随后在冰冷却且用力搅拌的过程中，缓慢地逐滴加入2.68ml(33mmol)无水吡啶。在室温下搅拌反应混合物1小时。向反应溶液中掺入100ml饱和氯化铵溶液，用100ml氯仿萃取三次，并用无水硫酸镁干燥。合并有机相并真空浓缩。将残余物溶于在乙酸乙酯中，并用少量环己烷沉淀产物。在过滤后获得5.43g(12mmol，80％)白色固体。熔点：136.5℃，Rf(EtOAc/环己烷1:1)0.78。1H NMR(300MHz，DMSO)δ8.30(d，J＝9.2Hz，2H，Ar-H)，7.55(d，J＝9.3Hz，2H，Ar-H)，4.42(t，J＝6.4Hz，2H，CH2)，2.96(t，J＝6.5Hz，2H，CH2)。13C-NMR(75MHz，CDCl3，TMS)：δ155.22，151.93，145.17，125.41，122.56，67.85，29.63。
2-[2-(1-((叔丁基)氧基-羰基)氧基-羰基)-肼基-乙基硫烷基]-乙基4-硝基苯基碳酸酯7(方案7中的化合物7)
在20ml干燥的二氯甲烷中存在1.97g(4.31mmol)双(4-硝基苯基)(硫代双(乙烷-2,1-二基))双(碳酸酯)6，并且在0℃下，在一个小时中，将3当量(1.13ml，6.66mmol)DIPEA缓慢滴入1当量(0.58g，4.31mmol)叔丁基羧酸肼5。继续搅拌反应溶液12小时，然后用水处理。用100ml二氯甲烷萃取产物三次，并用无水硫酸镁干燥。合并有机相并在真空浓缩。通过柱色谱法纯化残余物(EtOAc/环己烷2:1)，之后得到1.03g(2.31mmol，53％)透明油状物。Rf(EtOAc/环己烷1:1)0.20。1H NMR(300MHz，CDCh)δ8.28(d，J＝9.1Hz，2H，Ar-H)，7.39(d，J＝9.1Hz，1H，Ar-H)，6.64(s，1H，NH)，6.33(s，1H，NH)，4.44(t，J＝6.8Hz，2H，CH2)，4.33(t，J＝6.6Hz，2H，CH2)，2.92(t，J＝6.8Hz，2H，CH2)，2.84(t，J＝6.6Hz，2H，CH2)，1.46(s，9H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ155.52，152.57，125.47，121.96，82.09，68.06，65.34，64.18，31.10，30.59，28.27，27.03。
2-[2-(1-((叔丁基)氧基-羰基)氧基-羰基)-肼基-乙基硫烷基]-乙基4-硝基苯基碳酸酯2(方案7中的化合物2)
在室温下，将77％m-CPBA(489g，2.2mmol)缓慢加入到硫醚7(0.52g，1.1mmol)的50ml二氯甲烷溶液中。搅拌12小时后，向反应混合物中掺入1M NaHCO3溶液，并用50ml二氯甲烷萃取有机相三次。通过硫酸镁干燥合并的有机相，并且在旋转式蒸发器上移除溶剂，随后产物沉淀为白色无定形固体0.52mg(1.1mmol，定量)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.29(d，J＝9.2Hz，2H，Ar-H)，7.41(d，J＝9.2Hz，2H，Ar-H)，6.89(s，1H，NH)，6.36(s，1H，NH)，4.74(t，J＝5.9Hz，2H，CH2)，4.63(t，J＝5.3Hz，2H，CH2)，3.54(t，J＝5.9Hz，2H，CH2)，3.45(t，J＝5.5Hz，2H，CH2)，1.45(s，9H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ155.85，155.18，152.29，145.79，125.56，122.00，82.32，62.25，59.45，54.01，53.24，28.23。
按照标准模块原理完成根据式(14)、(15)、(17)、(18)、(19)的化合物的合成，该标准模块原理在一般合成方案(方案1)中有显示。
合成式(14)代表化合物
N,N′-双-(叔丁氧羰基)-氨基氧乙酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(BS2：X＝O，R1＝Boc)
在0℃下，向市售的N,N′-双-Boc-氨基氧乙酸(1.00g，3.20mmol)的11ml乙酸乙酯/二恶烷(1:1)溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.41g，3.20mmol)和二环己基碳二亚胺(0.67g，0.32mmol)。在室温下，搅拌溶液3小时，并且通过硅藻土过滤悬浮液并用乙酸乙酯进行后洗涤。将滤出液在真空下浓缩至干，并重新溶解在100ml乙酸乙酯中。用5％NaHCO3溶液、饱和NaCl溶液和水(各100ml)洗涤。用MgSO4干燥有机相，并在真空下使其蒸发，其中获得1.24g(3.20mmol)白色固体形式的产物。产量：1.24g(定量)；Rf(环己烷/乙酸乙酯，1:1)0.50；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ4.86(s，2H)，2.85(s，4H)，1.53(s，18H)。
N,N′-双-(叔丁氧羰基)-氨基氧乙酰基-1-((2-氨乙基)硫代)丙烷-2-醇酰胺(BS3：X＝O，R1＝Boc)
将BS2(X＝O，R1＝Boc，1.00g，2.55mmol)混入25ml含有1-((2-氨乙基)硫代)丙烷-2-醇(0.38g，2.55mmol)和二异丙基乙胺(DIPEA，0.53ml，3.06mmol)的二氯甲烷中，并且搅拌过夜。用5％NaHCO3溶液、饱和NaCl溶液和水(各100ml)洗涤。用MgSO4干燥有机相，并在真空浓缩，其中获得1.04g(2.55mmol)白色固体形式的产物。产量：1.04g(定量)；Rf(CH2Cl2/MeOH，98:2)0.35；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.95(s，1H)，4.44(s，2H)，3.92–3.82(m，1H)，3.53(qd，J＝6.7、1.5Hz，2H)，2.83–2.65(m，4H)，2.49(dd，J＝13.7、8.7Hz，1H)，1.55(s，18H)，1.25(d，J＝6.2Hz，3H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ167.94，150.57，85.41，65.98，41.86，38.81，32.21，28.19，22.23。
2,2-二甲基丙酰氧基-[2-[2-[2-(4-硝基苯氧基)羰基氧基丙基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]氨基]2,2-二甲基丙酸酯P’(X＝O，R1＝Boc，R2＝OC6H4pNO2)
将双(4-硝基苯基)碳酸酯(1.01g，4.95mmol)加入到5ml干燥的CH2Cl2中的BS3(X＝O，R1＝Boc)(1.52g，3.30mmol)中。随后在冰冷却条件下滴入干燥的吡啶(0.40ml，4.95mmol)。搅拌反应溶液18小时。滤出沉淀物并用50ml DCM再洗涤。用饱和NH4Cl溶液(50ml)洗涤滤出液，并用50ml CHCl3对水相进行萃取。在用MgSO4干燥后，将合并的有机相旋转式蒸发器上浓缩，并且借助于柱色谱法(环己烷/EtOAc，2:1)纯化残余物。产量：1.27g(67％)；Rf(环己烷/EtOAc，1:1)0.44；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.27(d，J＝9.2Hz，2H)，7.89(s，1H)，7.39(d，J＝9.2Hz，2H)，5.00(dd，J＝12.5，6.3Hz，1H)，4.43(s，2H)，3.53(dd，J＝13.3，6.5Hz，1H)，2.86–2.69(m，2H)，1.53(s，18H)，1.47(d，J＝6.3Hz，3H)。
2,2-二甲基丙酰氧基-[2-[2-[2-(4-硝基苯氧基)羰基氧基丙基磺酰基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]氨基]2,2-二甲基丙酸酯，式(14)
在室温下，将m-CPBA(0.96g，4.30mmol)缓慢加入到21ml二氯甲烷中的P’(X＝O，R1＝Boc，R2＝OC6H4pNO2)(1.27g，2.15mmol)溶液中。搅拌12小时后，用饱和NaHCO3溶液(15ml)洗涤反应混合物两次，并且在用MgSO4干燥后真空浓缩有机相。获得白色固体形式的砜。产量：1.26g(97％)；Rf(环己烷/EtOAc，1:1)0.29；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.28(d，J＝9.3Hz，1H)，8.15(t，J＝5.8Hz，1H)，7.41(d，J＝9.3Hz，1H)，5.48–5.39(m，1H)，4.44(s，1H)，3.83(dd，J＝6.2，4.2Hz，1H)，3.56(dd，J＝14.9，8.3Hz，1H)，3.37(t，J＝6.5Hz，1H)，3.27(dd，J＝14.9，3.9Hz，1H)，1.57(d，J＝6.4Hz，1H)，1.54(s，7H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ168.58，155.42，151.58，150.52，145.67，125.46，122.04，85.60，77.16，76.62，70.63，58.19，53.67，33.07，28.16，20.21；ESI-MS：(计算得出MNa+：628.16g/mol，实测：628.17m/z)。
合成式(18)代表的化合物
((叔丁氧羰基)氨基)甘氨酸(BS1X＝NH，R1＝H)
在0℃下，向NaOH(0.70g，17.4mmol)和Boc-肼(1.17g，8.7mmol)的甲醇溶液(10ml)中加入溴乙酸(1.48g，10.4mmol)。回流加热溶液5小时。接下来移除MeOH并且添加50ml水。用乙酸乙酯(50ml)萃取水相三次。接下来利用柠檬酸将水相调整至pH为2，并且用50ml乙酸乙酯进行三次萃取。用MgSO4干燥合并的有机相，并且减压移除溶剂。产量：0.85g(51％)白色固体；Rf(CH2Cl2/MeOH，8:2)0.15，1H NMR(300MHz，DMSO)δ8.55(s，2H)，8.17(s，2H)，3.40(s，2H)，1.37(s，9H)；ESI-MS：(计算得出MH+：191.10g/mol，实测：191.33m/z)。
N-(叔丁氧羰基)-N-((叔丁氧羰基)氨基)甘氨酸(BS1X＝NBoc，R1＝H)
向((叔丁氧羰基)氨基)甘氨酸(5.00g，26.0mmol)和NaOH(1.57g，39.04mmol)在104mL二恶烷/H2O(1:1)中的溶液中加入固体Boc2O(5.74g，26.03mmol)。在室温下搅拌溶液18小时过夜，并且随后减压移除二恶烷。将100ml饱和NaHCO3溶液掺入水性残余物，并用100ml Et2O洗涤两次。通过柠檬酸将水相调整至pH为2。用150ml乙酸乙酯萃取白色悬浮液三次。在用MgSO4干燥后，移除溶剂，其中形成了白色固体。产量：7.56g(定量)；Rf(CH2Cl2/MeOH，9:1)0.75；1H NMR(300MHz，DMSO))δ12.34(s，1H)，9.24(s，1H)，3.56(s，2H)，1.46–1.32(m，18H)。
N-(叔丁氧羰基)-N-((叔丁氧羰基)氨基)甘氨酰基-N-羟基琥珀酰亚胺(BS2X＝NBoc，R1＝H)
在0℃下，向N-(叔丁氧羰基)-N-((叔丁氧羰基)氨基)甘氨酸(1.36g，4.45mmol)的15ml乙酸乙酯/二恶烷(1:1)溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.52g，4.45mmol)和二环己基碳二亚胺(DCC，0.93g，4.45mmol)。在室温下搅拌溶液15小时。接下来，通过硅藻土过滤悬浮液并且用乙酸乙酯进行后洗涤。将滤出液在真空下浓缩至干，并重新溶解在100ml乙酸乙酯中。用5％NaHCO3溶液、饱和NaCl溶液和水(各100ml)洗涤。用MgSO4干燥有机相，并在真空下使其蒸发，其中获得1.24g(3.20mmol)白色泡沫形式的产物。产量：1.51g(88％)；Rf(环己烷/乙酸乙酯，1:1)0.45；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ4.67(s，1H)，4.19(s，2H)，2.87(s，4H)，1.49(m，18H)。
N-(叔丁氧羰基)-N-((叔丁氧羰基)氨基)甘氨酰基-1-((2-氨乙基)硫代)丙烷-2-醇酰胺(BS3：X＝NBoc，R1＝H)
将BS2(X＝NBoc，R1＝H，0.36g，0.92mmol)混入10ml含有1-((2-氨乙基)硫代)丙烷-2-醇(0.13g，0.92mmol)和DIPEA(0.18ml，1.01mmol)的二氯甲烷中，并且搅拌过夜。用5％NaHCO3溶液、饱和NaCl溶液和水(各100ml)洗涤。用MgSO4干燥有机相，并真空浓缩，其中获得0.27g(0.65mmol)白色泡沫形式的产物。产量：0.27g(定量)；Rf(CH2Cl2/MeOH,，98:2)0.36：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.34(s，1H)，6.66(s，1H)，4.05(s，2H)，3.90–3.81(m，1H)，3.49(dd，J＝10.4，4.0Hz，2H)，2.78–2.63(m，3H)，2.47(dd，J＝13.7，8.7Hz，1H)，1.49(s，9H)，1.46(s，9H)，1.23(d，J＝6.2Hz，3H)。
[2-(2,2-二甲基丙酰氧基)-2-[2-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氧基丙基亚硫酰基]乙基氨基]-2-氧代-乙基]肼基]2,2-二甲基丙酸酯P’(X＝O，R1＝Boc，R2＝ONO2C2H4)
将N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(0.19g，0.72mmol)加入到5ml干燥的CH2Cl2中的BS3(X＝NBoc，R1＝H)(0.25g，0.72mmol)溶液中。随后在冰冷却条件下滴入干燥的吡啶(0.06ml，0.73mmol)。搅拌反应溶液17小时。向溶液中加入50ml DCM。用10％柠檬酸溶液洗涤有机相并用MgSO4对其进行干燥。将合并的有机相在旋转式蒸发器上浓缩，并且借助于柱色谱法(CH2Cl2/MeOH，19:1)纯化残余物。产量：1.27g(67％)；Rf(CH2Cl2/MeOH，9:1)0.60；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.53(d，J＝95.5Hz，1H)，7.07(s，J＝9.0Hz，1H)，4.01(s，2H)，3.82(ddd，J＝8.2、6.1、3.9Hz，1H)，3.41(d，J＝6.1Hz，4H)，2.67(dt，J＝13.2、9.3Hz，4H)，2.46(dd，J＝13.7、8.2Hz，2H)，1.44(s，9H)，1.41(s，9H)，1.18(t，J＝6.8Hz，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ169.71，162.47，154.43，77.16，66.04，50.53，41.57，39.13，32.22，28.18，28.12，25.57，22.06，18.88。
[2-(2,2-二甲基丙酰氧基)-2-[2-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氧基丙磺酰基]乙基氨基]-2-氧代-乙基]肼基]2,2-二甲基丙酸酯(式(18))
在室温下，将m-CPBA(0.81g，0.36mmol)缓慢加入到P’(X＝NBoc，R1＝H，R2＝ONO2C2H4)(0.10g，0.18mmol)的5ml二氯甲烷溶液中。在搅拌14小时后，用饱和NaCl溶液中的5％NaHCO3洗涤反应混合物三次(各33ml)，并且随后用MgSO4干燥有机相。在真空下移除溶剂，并且获得白色无定形固体形式的砜。产量：0.08g(76％)；Rf(CH2Cl2/MeOH，9:1)0.45；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.48(s，1H)，6.95(s，1H)，4.39(dt，J＝15.7、7.8Hz，1H)，4.06(s，2H)，3.73(d，J＝4.3Hz，2H)，3.48–3.17(m，4H)，3.41(d，J＝6.1Hz，2H)，3.02(d，J＝13.2Hz，1H)，2.85–2.68(m，3H)，1.46(s，9H)，1.43(s，9H)，1.30(d，J＝6.4Hz，3H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ170.18，167.99，154.71，133.30，131.86，130.13，129.83，128.20，77.16，62.88，53.37，33.53，28.23，28.16，25.57，23.25。ESI-MS：(计算得出MNa+：603.19g/mol，实测：603.06m/z)。
合成式(15)代表的化合物
N-(叔丁氧羰基)-氨氧乙酰基-1-((2-氨乙基)硫代)丙烷-2-醇酰胺(BS3：X＝O，R1＝H)
将市售的2-(((叔丁氧羰基)氨基)氧基)乙酸(1.00g，4.73mmol)溶于干燥的CH3CN(47ml)。将N-羟基琥珀酰亚胺(0.66g，5.68mmol)和DCC(1.18g，5.68mmol)依次加入溶液中，并且在室温下搅拌所得的反应混合物1小时。之后，加入1-((2-氨乙基)硫代)丙烷-2-醇(0.85g，5.68mmol)的3ml干燥的CH3CN溶液，并且在室温下搅拌所得的反应混合物18小时。移除CH3CN，并且将浓缩物溶于在50ml乙酸乙酯中。用10％柠檬酸溶液(50ml)和饱和NaCl溶液洗涤。利用MeOH(1-8％)的CH2Cl2作梯度溶液为流动相，通过硅胶柱色谱法纯化所得残余物。获得白色泡沫形式的期望的块。产量：0.26g(16％)；Rf(CH2Cl2/MeOH，9:1)0.50；1H NMR(300MHz，丙酮)δ8.14(s，1H)，4.22(s，2H)，3.85(t，J＝1.6Hz，1H)，3.53–3.38(m，2H)，2.72–2.66(m，2H)，2.62–2.58(m，2H)，1.46(s，9H)，1.19(d，J＝6.1Hz，3H)。
[[2-[2-[2-(4-硝基苯氧基)羰基氧基丙基亚硫酰基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]氨基]2,2-二甲基丙酸酯P’(X＝O，R1＝H，R2＝OC6H4pNO2)
将双(4-硝基苯基)碳酸酯(0.276g，0.90mmol)加入到BS3(X＝O，R1＝H)(0.24g，0.75mmol)的5ml干燥的CH2Cl2中。随后在冰冷却条件下滴入干燥的吡啶(0.07ml，0.75mmol)。搅拌反应溶液18小时。滤出沉淀物并用50ml DCM再洗涤。用饱和NH4Cl溶液(50ml)洗涤滤出液，并用50ml CHCl3对水相进行萃取。在用MgSO4干燥后，将合并的有机相在旋转式蒸发器上浓缩，并且借助于柱色谱法(环己烷/EtOAc，2:1)纯化残余物。产量：0.27g(96％)；Rf(环己烷/EtOAc，1:1)0.34；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.35(s，1H)，8.27(d，J＝9.1Hz，2H)，7.58(s，1H)，7.40(d，J＝9.1Hz，2H)，5.06–4.94(m，1H)，4.32(s，2H)，3.54(d，J＝6.3Hz，2H)，2.87–2.73(m，4H)，1.48(d，J＝4.1Hz，3H)，1.47(s，Hz，9H)。
[[2-[2-[2-(4-硝基苯氧基)羰基氧基丙基磺酰基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]氨基]2,2-二甲基丙酸酯式(15)
在室温下，将m-CPBA(0,263g，1.18mmol)缓慢加入到P’(X＝O，R1＝Boc，R2＝OC6H4pNO2)(0.30g，0.59mmol)的5ml二氯甲烷溶液中。搅拌12小时后，用饱和NaHCO3溶液(15ml)洗涤反应混合物两次，并且在用MgSO4干燥后真空浓缩有机相。获得白色泡沫形式的砜。产量：0.250g(84％)；Rf(环己烷/EtOAc，1:1)0.05；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.51(s，1H)，8.28(d，J＝9.2Hz，2H)，7.64(s，1H)，7.41(d，J＝9.2Hz，3H)，5.47–5.35(m，1H)，4.33(s，2H)，3.88–3.79(m，2H)，3.57(dd，J＝14.9、8.3Hz，1H)，3.41–3.34(m，2H)，3.28(dd，J＝14.8、3.8Hz，1H)，1.57(d，J＝6.4Hz，3H)，1.48(s，9H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ168.58，155.42，151.58，150.52，145.67，125.46，122.04，85.60，77.16，76.62，70.63，58.19，53.67，33.07，28.16，20.21；ESI-MS：(计算得出MH+：528.16g/mol，实测：528.15m/z)。
合成式(16)代表的化合物
4-羧基-2-硝基苯磺酸钠
将4-磺酰基苯甲酸溶于5ml发烟HNO3和10ml H2SO4(95％)组成的混合物中。将反应溶液在90℃下搅拌过夜，并且随后用100ml水稀释。在0℃下，通过添加Na2CO3，中和酸。接下来通过加入HCl进行酸化，直至pH值为2。移除水，并且用EtOH/iPrOH(1:1)萃取残余物。接下来，移除有机溶剂，获得棕色固体形式的产物。产量：6.86g(61％)；Rf(CH2Cl2/MeOH/AcOH，7:2:1)0.05；1H NMR(300MHz，MeOD)δ8.23(d，J＝1.6Hz，1H)，8.17(d，J＝1.6Hz，1H)，8.16(s，1H)；ESI-MS(neg.)：(计算得出(M-Na)-：245.97g/mol，实测296.00m/z)。
4-(2-(叔丁氧羰基)肼-1-羰基)-2-硝基苯磺酸钠
肼基甲酸叔丁酯(1.91g，14.27mmol)和4-羧基-2-硝基苯磺酸钠(3.84g，14.27mmol)以及1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺(2.76g，14.27mmol)的溶液在室温下在60ml甲醇/H2O(1:1)中搅拌过夜。减压移除溶剂，并且借助于柱色谱法(CH2Cl2/MeOH，9:1)纯化残余物。肼基甲酸叔丁酯(1.91g，14.27mmol)和4-羧基-2-硝基苯磺酸钠(3.84g，14.27mmol)以及1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺(2.76g，14.27mmol)的溶液在室温下在60ml甲醇/H2O(1:1)中搅拌过夜。减压移除溶剂，并且借助于柱色谱法(CH2Cl2/MeOH，9:1)纯化残余物。产量：6.86g(61％)；Rf(CH2Cl2/MeOH/AcOH，7:2:1)0.30；1H NMR(300MHz，DMSO)δ10.46(s，1H)，9.04(s，1H)，8.01(d，J＝1.5Hz，1H)，7.99(d，J＝1.5Hz，1H)，7.96(s，1H)，1.43(s，9H)；ESI-MS(neg.)：(计算得出(M-Na)-：360.05g/mol，实测：360.00m/z)。
2-(4-(氯磺酰基)-3-硝基苯甲酰基)肼-1-羧酸叔丁酯
向4-(2-(叔丁氧羰基)肼-1-羰基)-2-硝基苯磺酸钠(0.55g，1.42mmol)和18-冠-6醚(0.02g，0.07mmol)的溶液中加入干燥丙酮中的氰尿酰氯(0.26g，1.42mmol)。回流加热溶液18小时。在冷却后，通过硅藻土过滤反应混合物，并且借助于柱色谱法(CH2Cl2/MeOH，9:1)进行纯化。产量：0.23g(43％)；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ10.18(s，2H)，8.22(d，J＝0.5Hz，1H)，8.22(dd，J＝1.7、0.5Hz，1H)，8.18(d，J＝1.6Hz，1H)，8.15(d，J＝0.6Hz，1H)，1.23(s，9H)；ESI-MS(neg.)：(计算得出(M)-：379.02g/mol，实测378.92m/z)。
合成式(20)代表的化合物
6-叠氮基异苯并呋喃-1(3H)-酮
将6-氨基-苯酞(2.50g，15.92mmol)在1M HCl(28ml)中的澄清溶液冷却至0℃，并且逐滴掺入3ml NaNO2(1.66g，13.89mmol)水溶液。在0℃下搅拌如此获得的悬浮液10分钟，并在0℃下逐滴掺入10ml NaN3(2.09g，31.85mmol)溶液(剧烈放出HN3气体，发泡)。在0℃下搅拌泡沫状悬浮液1小时。抽滤出沉淀物，并用总共300ml水洗涤数次。将棕色固体压碎并在干燥箱中干燥过夜。接下来将其溶于300ml CH2Cl2中并过滤。在真空下将溶剂从滤出液中除去，其中获得浅褐色固体。产量：2.53g(91％)；Rf(CH2Cl2/MeOH/AcOH，7:2:1)0.30；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.58(d，J＝1.9Hz，1H)，7.47(dd，J＝8.2，0.7Hz，1H)，7.31(dd，J＝8.2，2.1Hz，1H)，5.31(s，2H)；ESI-MS：(计算得出(MH)+：176.05g/mol，实测：176.23m/z)。
5-叠氮基-2-(羟甲基)苯甲酰肼
将6-叠氮基异苯并呋喃-1(3H)-酮(0.50g，2.83mmol)溶于6ml二甲基甲酰胺(DMF)中，加入水合肼(0.71ml，14.13mmol)，并且在70℃下搅拌溶液3小时。在真空下移除DMF和水合肼。借助于柱色谱法(CH2Cl2/MeOH，9:1)纯化残余物，其中获得了淡黄色的粉末。产量：0.10g(17％)。Rf(CH2Cl2/MeOH，9:1)0.53；1H NMR(300MHz，DMSO)δ9.62(s，1H)，7.57(d，J＝8.3Hz，1H)，7.20(dd，J＝8.3，2.4Hz，1H)，7.09(d，J＝2.4Hz，1H)，5.31–5.21(m，1H)，4.57(d，J＝5.7Hz，2H)，4.50(s，2H)，3.33(s，2H)，ESI-MS：(计算得出(MH)+：208.08g/mol，实测：207.90m/z)，(计算得出(MNa)+：230.07g/mol，实测：230.01m/z)。
2-(5-叠氮基-2-(羟甲基)苯甲酰基)肼-1-羧酸叔丁酯
将5-叠氮基-2-(羟甲基)苯甲酰肼(0.10g，0.48mmol)溶于10ml二恶烷/EtOAc/iPrOH(1:1:1))，并且掺入Boc酸酐(0.105g，0.48mmol)和DIPEA(0.10ml，0.57mmol)。在室温下搅拌溶液12小时，并且随后减压移除溶剂。将残余物溶于50ml CH2Cl2中并用10％柠檬酸溶液洗涤两次(各50ml)。在用MgSO4干燥并移除有机溶剂后，得到浅黄色油状物。产量：0.10g(67％)。Rf(CH2Cl2/MeOH，9:1)0.75：1H NMR(300MHz，DMSO)δ10.06(s，1H)，9.04(d，J＝30.3Hz，1H)，7.69–7.58(m，1H)，7.25(dd，J＝8.3，2.4Hz，1H)，7.10(d，J＝1.3Hz，1H)，5.28(t，J＝5.7Hz，1H)，4.62(d，J＝5.6Hz，2H)，1.43(s，9H)；ESI-MS：(计算得出(MNa)+：330.12g/mol，实测：330.29m/z)。
2-(5-叠氮基-2-(((((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)氧基)甲基)苯甲酰基)肼-1-羧酸叔丁酯
将N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(0.105g，0.41mmol)加入到5ml干燥的二甲基甲酰胺中的2-(5-叠氮基-2-(羟甲基)苯甲酰基)肼-1-羧酸叔丁酯(0.105g，0.34mmol)中。随后滴入干燥的吡啶(0.03ml，0.41mmol)。在室温下搅拌反应溶液17小时。在真空下移除溶剂。向溶液中加入50ml DCM。用10％柠檬酸溶液洗涤有机相(2x 50ml)并用MgSO4干燥。将合并的有机相在旋转式蒸发器上浓缩，并且借助于柱色谱法(CH2Cl2/MeOH，19:1)纯化残余物。产量：0.06g(40％)。Rf(CH2Cl2/MeOH，19:1)0.45；1H NMR(300MHz，DMSO)δ10.06(s，J＝10.9Hz，1H)，8.99(s，J＝8.4Hz，1H)，7.62(d，J＝8.3Hz，1H)，7.53(s，1H)，7.25(dd，J＝8.3，2.4Hz，1H)，5.76(s，2H)，3.34(s，4H)，1.43(s，9H)，ESI-MS：(计算得出(MNa)+：471.12g/mol，实测：471.25m/z)。
合成式(21)代表的化合物
6-甲氧基异苯并呋喃-1(3H)-酮
回流加热3-甲氧基苯甲酸(10.00g，65.07mmol)、37％福尔马林溶液(7.5mL，80mmol)、37％HCl(8.00mL)和75mL 100％乙酸的混合物18小时。在冷却后，澄清溶液，关闭搅拌器并在此温度下放置14小时。在80℃时，在气流中移除乙酸。残余物溶于150ml的甲苯中并且浓缩至40ml。用40ml份的20％Na2CO3溶液(3次)以及40ml水洗涤80℃的热溶液。在加入3ml吗啉后，在80℃下搅拌有机相2小时，然后用50ml份的10％H2SO4(3次)和水洗涤。为了使产物结晶，将混合物浓缩至25ml并搅拌混合物。通过过滤，获得白色晶体形式的产物。产量：3.52g(33％)。1H NMR(300MHz，DMSO)δ7.58(dd，J＝8.3，0.7Hz，1H)，7.35(dd，J＝8.3，2.4Hz，1H)，7.31(d，J＝2.2Hz，1H)，5.34(s，2H)，3.84(s，3H)。
6-羟基异苯并呋喃-1(3H)-酮
在氮气气氛下，将6-甲氧基异苯并呋喃-1(3H)-酮(3.00g，18.09mmol)溶于无水二氯甲烷(100ml)中。磁力搅拌所得混合物并将其置于冰浴中冷却10分钟。之后滴入BBr3(3.46ml，36.18mmol)。随即将反应混合物加热至室温，并且搅拌12小时。接下来加入5ml水，并且混合物被转移至分液漏斗并且用乙酸乙酯(3×100ml)进行萃取。将合并的有机萃取物用硫酸镁干燥、过滤并且减压浓缩，其中得到白色固体。产量：1.52g(56％)。1H NMR(300MHz，DMSO)δ10.08(s，1H)，7.47(dd，J＝8.3，0.6Hz，1H)，7.19(d，J＝2.3Hz，1H)，7.16(d，J＝2.3Hz，1H)，7.10(d，J＝2.0Hz，1H)，5.28(s，2H)；ESI-MS：(计算得出(MH)+：151.04g/mol，实测：151.05m/z)。
5-叠氮基-2-(羟甲基)苯甲酰肼
将6-羟基异苯并呋喃-1(3H)-酮(0.43g，2.83mmol)溶于6ml二甲基甲酰胺(DMF)中，加入水合肼(1.42ml，28.26mmol)，并且在100℃下搅拌溶液3小时。在真空下移除DMF和水合肼。借助于柱色谱法(CH2Cl2/MeOH，9:1)纯化残余物，其中获得了淡黄色的粉末。产量：0.10g(17％)。Rf(CH2Cl2/MeOH，9:1)0.40；1H NMR(300MHz，DMSO)δ10.08(s，1H)，9.73(s，1H)，7.47(d，J＝8.3Hz，1H)，7.18(dd，J＝8.3，2.3Hz，1H)，7.10(d，J＝2.3Hz，1H)，4.57(d，J＝5.7Hz，2H)，4.50(s，2H)，3.33(s，2H)，ESI-MS：(计算得出(MH)+：183.08g/mol，实测：183.15m/z)。
利用捕获分子(14)的示例性纯化
在市售的醛修饰的琼脂糖(高密度乙二醛，来自ABT的6BCT)上，利用另一示例肽14(AKADEVSLHKWYG；SEQ ID No：10)和根据式(14)的接头(捕获分子14)进行纯化。
肽的固相肽合成以及纯化
使用Intavis AG的MultiPep RS肽合成自动装置，在100μmol的附件中完成自动化的固相肽合成。在Carl Roth公司的Wang-Harz(1.0-1.4mmol/g)上进行合成。在合成开始之前，对5mL注射器式反应器(Intavis公司的PE反应器)中对应量的肽合成树脂进行称重并且在DMF中溶胀。除非另有说明，否则氨基酸当量的原重是指所用树脂的初始负载。
Fmoc裂解：
为了临时Fmoc保护基团的裂解，使用1500μL哌啶/DMF(4:1)处理树脂两次，一次处理5分钟，另一次处理8分钟，并且随后用10.2mL DMF洗涤七次，并且继续Fmoc氨基酸衍生物的偶联。
Fmoc氨基酸衍生物的偶联：
在室温下，5当量氨基酸在DMF中的溶液与4.5当量HCTU在DMF(0.3M)中的溶液和10当量预活化的NMM在DMF(0.6M)中的溶液温育1分钟，并且随后将其加入到树脂中。在30分钟的反应时间后，用10.2mL DMF洗涤树脂三次，并继续阻断终止序列。
阻断终止序列：
用1.5mL AC2O/2,6-二甲基吡啶/DMF(5:6:89)溶液处理树脂两次，持续5分钟，并且紧接着分别用10.2mL DMF洗涤七次。
最后的步骤——捕获分子的偶联：
作为固相肽合成的最后步骤，将捕获分子(14)偶联至期望的目标肽(50μmol)。将合成树脂与4当量捕获分子(0.3M)、DMF(0.4M)中的6当量HOBt以及DMF(0.3M)中的4当量DIPEA构成的溶液混合。在60分钟的反应时间后，分别用2mL DMF洗涤两次，用2mL CH2Cl2洗涤两次，并且接下来再次用2mL DMF洗涤两次。
乙酰化全长肽的替代最后一步：
类似于阻断终止序列的程序，同样将作为对照样品的全长肽乙酰化(肽-乙酰化)。
从聚合物载体上释放：
用3mL 95％TFA、2.5％水和2.5％三异丙基硅烷的溶液处理树脂。将该裂解混合物掺入合成树脂，并且在室温下振荡3小时。随后收集裂解溶液，并且分别用1mL的TFA对树脂进行两次再洗涤。将裂解溶液与洗涤液合并，并通过氩气流将其浓缩至约1mL的体积。接下来用10mL冷二乙醚沉淀，并且接下来离心分离沉淀物。弃去上清液。在图4h(上)中示出了在纯化前具有45％的纯度的无接头肽的色谱图。
纯化
将粗沉淀物(约5μmol理论产量)溶于在缀合缓冲剂(0.1M NH4OAc，0.1M苯胺，pH＝3.8)中。当混合物未完全溶解时，加入了乙腈。向具有25μm PE预过滤器的3mL注射器式反应器中加入了400μL(～160mg)琼脂糖。然后通过用缀合缓冲剂(0.1M NH4OAc，0.05M苯胺，pH＝3.8)洗涤3次来调节纯化树脂。然后将肽溶液加入到纯化树脂上。接下来进行固定化60分钟。之后用缀合缓冲剂洗涤三次，用5M尿素溶液洗涤三次，用70％的乙醇洗涤三次，最后用水洗涤五次。然后用5v％NH4OH，在水中碱性处理混合物，以使缀合的肽从树脂上裂解。冻干得到白色絮状固体形式的肽。
证明固定化
为了明确证明固定化，在该实验中用PEC在经修饰和纯琼脂糖(6％B琼脂糖珠STANDARD，ABT)上纯化乙酰化肽和具有结合的接头的肽。分别借助于UPLC-UV测量接头裂解后的洗脱液。结果显示，在裂解后，在修饰的纯化树脂上仅有具有结合的接头的肽检测到具有产物质量的明显信号。额外地，可以看出，与修饰的琼脂糖相比，即便使用纯琼脂糖，也可获得约2.3％的产物。
表3：关于在用修饰的和未修饰的琼脂糖进行的纯化后肽的产物峰的积分
纯化树脂的再生
在用捕获分子(14)进行肽纯化后，1中初始的醛官能团保持为被羟基修饰的捕获分子阻断。为了提供再次用于新纯化循环的纯化树脂，必须再生树脂，并且由此恢复醛官能团。这在通过添加醛或酮来改变平衡时实现。用于重复的纯化循环的再生如下所示：
同时进行肽14的两种纯化(纯化I)。接下来，分别用水、丙酮和TFA(酮，49.95:49.95:0.1)的混合物或者说水、乙醛和TFA(醛，89.95:9.95:0.1)的混合物洗涤用于再生的纯化树脂四次，并且用水洗涤5次。之后，类似于上文中描述程序进行包括调节的纯化。再生和纯化总共进行三次(纯化II-IV)，并且冻干产物被分别溶于在等体积的水、乙腈和TFA(69.9:29.9:1)中，并通过UPLC-MS进行测量。
表4：关于产物峰的积分，以及在用修饰的琼脂糖(纯化I)进行的纯化后并且在三次再生循环(纯化II-IV)后的肽百分比
结果显示，树脂在两种情况下都可再生。通过酮进行的再生只在第三次循环(纯化IV)中显著下降。相反，醛再生时的纯化量保持在初始量的约四分之一，但是在第二次循环(纯化III)后就已经降至该值。在两个实验中，可以达到约60％的纯度，其在再生循环过程中保持恒定(纯化I、醛的示例色谱图，图4h(下))。