接头分子及其在纯化肽的方法中的用途.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201780008536.X (22)申请日 2017.01.30 (30)优先权数据 102016101606.3 2016.01.29 DE (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2018.07.26 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/EP2017/051932 2017.01.30 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2017/129818 DE 2017.08.03 (71)申请人 贝兰迪克有限责任公司 地址 德国柏林 (72)发明人 罗伯特齐特巴特奥利弗塞茨

2、(74)专利代理机构 北京超凡志成知识产权代理 事务所(普通合伙) 11371 代理人 王晖李丙林 (51)Int.Cl. C07C 243/38(2006.01) C07C 317/28(2006.01) C07D 207/46(2006.01) C07K 1/00(2006.01) C07C 317/18(2006.01) C07K 1/107(2006.01) C07K 1/14(2006.01) C07K 7/08(2006.01) (54)发明名称 接头分子及其在纯化肽的方法中的用途 (57)摘要 当前发明涉及一种用于纯化通过固相肽合 成(SPPS)制得的肽的方法， 并且涉及用在该方

3、法 中的对应的接头分子。 权利要求书5页 说明书32页 序列表3页 附图9页 CN 108602762 A 2018.09.28 CN 108602762 A 1.式 X1-L-X2 (1)的化合物， 其中 X1选自 -其中每个R1和R2都彼此独立地选自H或B， 其中至少R1或R2是B， 其中 -R3选自H或B， -其中B是对酸不稳定的氨基保护基团， 其中 -R4选自H、 C1-C12-烷基或芳基， 其中醛基或酮基可以由对酸不稳定的保护基团保护， L选自在碱性条件下可从X2上亲核裂解的官能接头化合物， 特别地L具有-T-U-的形式， 其中 -T是X1和U之间的间隔基， 其中T特别地选自取代或未

4、取代的-C1-C12-烷基， 特别是C1- C6-烷基， 特别是C1-C3-烷基， -R5-C(O)-NH-R6-， -R5-C(O)-O-R6-， -R5-C(O)-O-， -C( O)-O-R6-， -C(O)-NH-R6-， -C(O)， -C(O)-O-， -R5-苯基-R6-， -R5-苯基-， -苯基-R6-， -苯 基-， -其中R5和R6独立地选自取代或未取代的C1-C12-烷基， 特别是C1-C6-烷基， 尤其是C1-C3- 烷基， 并且其中 -U是官能性接头化合物的裂解活化部分， 其中活化部分被设计用于稳定在从X2上碱性 裂解时产生的阴离子， X2具有-Y-Z的形式， 其中

5、 -Y选自-O-C(O)-或-S(O)2-， 并且 -Z是吸电子的离去基团。 2.根据权利要求1所述的化合物， 其中 -B选自Boc(-COOtBu)、 三苯甲基(-C(Ph)3)、 Mmt(-C(Ph)2C6H4OMe)、 DMT(-C(Ph) (C6H4OMe)2)、 Cbz(-COOCH2Ph)、 亚苄基胺(CPh)、 邻苯二甲酰亚胺(CO)2C6H4)、 对甲苯 磺酰胺(-SO2C6H4Me)、 苯甲胺(-CH2Ph)、 乙酰胺(-COMe)、 三氟乙酰胺(-COCF3),Dde(1-(4,4- 二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-乙基)以及1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代

6、环己-1-亚 基)-3-甲基丁基(ivDde)， 其中B特别地是Boc， 和/或 -缩醛或缩酮保护基团选自 其中r处于0至12之间， 特别地是0、 1或2。 权利要求书 1/5 页 2 CN 108602762 A 2 3.根据权利要求1或2所述的化合物， 其中T选自-C1-C12-烷基-、 -R5-C(O)-NH-R6-、 - R5-C(O)-O-R6-、 -R5-C(O)-O-、 -C(O)-O-R6-、 -C(O)-NH-R6-、 -C(O)-、 -C(O)-O-， 其中R5和R6独立地选自C1-C6-烷基， 特别是C1-C2-烷基， T特别地选自-CH2-、 -CH2-C(O)-NH-

7、 (CH2)2-、 -(CH2)-C(O)-O-(CH2)2-、 -CH2-C(O)-O-、 -C(O)-O-、 -C(O)-O-(CH2)2-、 -C (O)-， 特别是-CH2-、 -CH2-C(O)-NH-(CH2)2-、 -C(O)-O-(CH2)2-、 -CH2-C(O)-O-、 -C (O)-。 4.根据权利要求1至3中至少一项所述的化合物， 其中化合物T-U-Y的U选自根据式(5)、 (6)、 (7)、 (8)、 (9)、 (10)和(11)的化合物， 特别地选自(5)、 (6)、 (8)、 (9)和(10)， -其中R8选自C1-C6-烷基、 CF3、 CH2CF3、 特 别

8、地 选 自 Boc-Lys(Boc)， -其中R7n、 R9m、 R10p、 R11q、 R13r和R14s选自C1-C6-烷基或者产生-I和/或-M效应的取代基， 特 别是C1-C3-烷基、 -F、 -Cl、 -Br、 -I、 -CN-NO2、 -N3、 -CF3、 -SO3H和-CO2H， -其中n等于0、 1、 2、 3或4， 特别地， n是0或1， 特别是0 -其中m等于0、 1、 2或3， 特别地， m是0或1， 特别是0 -其中p等于0、 1、 2、 3或4， 特别地， p是0或1， 特别是0 -其中q等于0、 1、 2或3， 特别地， q是0或1， 特别是0 权利要求书 2/5

9、页 3 CN 108602762 A 3 -其中r等于0、 1、 2或3， 特别地， r是0或1， 特别是0 -其中s等于0、 1、 2或3， 特别地， s是0或1， 特别是0。 5.根据权利要求1至4中至少一项所述的化合物， 其中Z选自组-F、 -Cl、 -Br、 -I、 -N3、 - SR12、 -OCF3、 -OCH2CF3、 -OSO2CF3、 -SO2C6H4CH3、 -SO2CF3、 -SO2CH3 特别是特别是 其中R12是C1-C6-烷基残基、 芳基残基或苯甲基残基。 6.根据权利要求1至5中至少一项所述的化合物， 其中X1是根据式(2)或(3)的化合物， 特 别是根据式(3)

10、的化合物， 其中R3是H， R1和R2具有Boc保护基团， 或者R1是H且R2是Boc保护基 团， 其中特别地， R1是H并且R2是Boc保护基团。 7.根据权利要求1至6中至少一项所述的化合物， 其中Y具有-O-C(O)-的形式。 8.根据权利要求1至7中至少一项所述的化合物， -其中T具有-(CH2)-C(O)-NH-(CH2)2-、 -(CH2)-C(O)-O-(CH2)2-、 -C(O)-O-(CH2)2- 的形式， 特别是-C(O)-O-(CH2)2-和-(CH2)-C(O)-NH-(CH2)2-， 特别是-(CH2)-C(O)- NH-(CH2)2-， -其中U是根据式(5)或(6

11、)的化合物， 特别是根据式(6)的化合物， 9.根据权利要求1至7中至少一项所述的化合物， -其中T具有-CH2-C(O)-O-、 -C(O)-O-的形式， 特别是-CH2-C(O)-O-， -其中U是根据式(7)的化合物，其中R7选自C1-C6-烷基或产生- I和/或-M效应的取代基， 特别是C1-C3-烷基、 -F、 -Cl、 -Br、 -I、 -CN-NO2、 -N3、 -CF3、 -SO3H和- CO2H， 其中n等于0、 1、 2、 3或4， 特别是0或1， 特别是0。 10.根据权利要求1至7中至少一项所述的化合物， -其中T具有-CH2-的形式， 权利要求书 3/5 页 4 CN

12、 108602762 A 4 -其中U是根据式(8)的化合物， -其中R8是Boc-Lys(Boc)-， 并且r等于0。 11.根据权利要求1至7中至少一项所述的化合物， -其中T具有-CH2-、 -(CO)-的形式， 特别是-CH2-， -其中U是根据式(9)的化合物， 其中s等于0， 12.根据权利要求1至7中至少一项所述的化合物， -其中T具有-C(O)-的形式， -其中U是根据式(10)的化合物， 其中m等于0， -其中Y具有-SO2-的形式， 并且 -其中Z是Cl。 13.根据权利要求1至12中至少一项所述的化合物作为全长肽的N端氨基与固相之间的 连接的用途。 14.式X1-L-Y-

13、PEP(12)的化合物， 其中根据独立权利要求1及权利要求1的从属权利要求 定义X1、 L和Y， 并且其中PEP包括全长肽， 而该全长肽通过其N端与X2 连接。 15.式D-X1 -L-Y-PEP(13)的化合物， -其中D是表面修饰的固体载体， 其特征在于， 通过合成或天然聚合物对表面进行修饰， 特别是修饰的多糖， 特别是醛或者肼修饰的琼脂糖凝胶/琼脂糖或纤维素。 -其中X1 具有-NH-O-、 -NH-NH-或-C(O)-的形式， -其中根据权利要求12定义L、 Y和PEP。 16.一种用于纯化肽的方法， 特别是借助于固相肽合成(SPPS)制备的肽， 所述方法包括 下列步骤： i.将待纯化

14、的全长肽和至少一种杂质， 特别是至少一种乙酰化的终止序列的组合物与 根据权利要求1至12中任一项所述的捕获化合物接触， 随后反应， 以产生式(12)的化合物， ii.通过添加酸， 使对酸不稳定的保护基团裂解， iii.将步骤ii中的组合物与表面修饰的固体载体接触， 其中在捕获化合物和固体载体 之间形成共价腙或肟键， 并提供式(13)的化合物， iv.使全长肽从固体载体上裂解。 权利要求书 4/5 页 5 CN 108602762 A 5 17.根据权利要求16所述的方法， 其中固体载体在其表面上具有官能基团醛， 特别是- O-CH2-CHO， 酮， 羟胺， 特别是-ONH2， 以及肼， 特别是

15、-N2H3。 18.根据权利要求16所述的方法， 其中在全长肽从固体载体上裂解后或过程中， 固体载 体D从捕获化合物的残基X1-L上裂解， 并且固体载体再生。 权利要求书 5/5 页 6 CN 108602762 A 6 接头分子及其在纯化肽的方法中的用途 技术领域 0001 当前发明涉及一种用于纯化通过固相肽合成(SPPS)制得的肽的方法， 并且涉及用 在该方法中的对应的接头分子。 背景技术 0002 固相肽合成是一种已知的用于制备肽的方法。 除了肽的合成， 其纯化也是一个至 关重要的方法步骤。 0003 广泛使用的用于纯化肽的方法是制备型高效液相色谱(HPLC)。 该方法的缺点是在 期望的

16、生产量方面的可扩展性差， 因此不能使用同一设备来生产不同的量； 这导致对应的 复杂设施的相对高的购置成本。 另一缺点在于， 对单个级分的正确分析评估需要相对广泛 的知识； 还要补充的是， 在操作过程中溶剂和色谱柱材料(固相)的消耗。 0004 因此， 为了降低肽制备的成本， 成本更加低廉且更不易受干扰的方法是有利的。 0005 EP 0 552 368 A1描述了一种用于纯化肽的方法， 其中所谓的接头一方面与合成 的全长肽的N端末端共价键合， 另一方面通过硫醇基与官能化的硅藻土反应共价键合至硫 醚。 全长肽由此被固定化并且可以被纯化。 随后， 在碱性条件下释放全长肽。 然而， 该方法不 适合于

17、含硫醇的肽， 例如含有氨基酸半胱氨酸或青霉胺的肽。 另外， 存在的缺点是， 用于纯 化的固相(在这种情况下是硅藻土)不是预设用于再利用的或不适合于再利用。 0006 EP 2 501 711 B1提出了一种类似的方法， 其中接头一方面通过合成的全长肽的N 端末端， 另一方面通过叠氮化物(-N3)和炔烃之间的1,3-偶极环加成(Huisgen反应)， 与固 相(合成的亲水聚合物， 诸如PEGA)结合。 该方法的缺点是， 在此必须加入铜或含铜化合物， 以进行1,3-偶极环加成反应。 许多肽络合铜， 特别是具有硫的那些， 即含有甲硫氨酸和/或 半胱氨酸的那些； 精氨酸和赖氨酸同样可以结合铜。 因此，

18、 难以再次移除铜， 并且由于剩余 铜的毒性， 该方法并不能应用至所有情况， 特别地不适用于肽治疗剂的纯化。 而且， 在此也 有这个缺点， 即用于纯化的固相不是预设用于再利用的或不适合于再利用。 发明内容 0007 因此， 本发明的目的在于， 提供一种用于纯化肽的方法， 该方法不需要完整的HPLC 设备， 也适合于含硫或结合铜的肽。 此外， 本发明的目的在于， 提供一种适合于纯化肽的方 法， 该方法使得用于纯化的固相的再生和再利用成为可能。 另外， 本发明的目的在于， 提供 一种化合物， 其使得全长肽的N端氨基和固相之间的连接成为可能。 0008 在当前发明的第一方面中， 该目的通过一种具有通式

19、 0009 X1-L-X2 (1)的化合物得以实现， 其中 0010 X1选自 说明书 1/32 页 7 CN 108602762 A 7 0011 0012 -其中每个R1和R2都彼此独立地选自H或B， 其中至少R1或R2是B， 其中 0013 -R3选自H或B， 0014 -其中B是对酸不稳定的氨基保护基团， 其中 0015 -R4选自H、 C1-C12-烷基或芳基， 其中醛基或酮基可以由对酸不稳定的保护基团保 护， 0016 L选自在碱性条件下可从X2上亲核裂解的官能接头化合物， 特别地L具有-T-U-的 形式， 其中 0017 -T是X1和U之间的间隔基， 其中T特别地选自取代或未取代

20、的-C1-C12-烷基， 特别是 C1-C6-烷基， 特别是C1-C3-烷基， -R5-C(O)-NH-R6-， -R5-C(O)-O-R6-， -C(O)-O-R6-， -C (O)-NH-R6-， -C(O)， -R5-苯基-R6-， -R5-苯基-， -苯基-R6-， -苯基-， 0018 -其中R5和R6独立地选自取代或未取代的C1-C12-烷基， 尤其是C1-C6-烷基， 尤其是 C1-C3-烷基， 并且其中 0019 -U是官能性接头化合物的裂解活化部分， 其中活化部分被设计用于稳定在从X2上 碱性裂解时产生的阴离子， 0020 X2具有-Y-Z的形式， 其中 0021 -Y选自-

21、O-C(O)-或-S(O)2-， 并且 0022 -Z是吸电子的离去基团。 0023 在当前发明的上下文中， 术语分子的 “裂解活化部分” 是指反应性官能团的结构要 素。 0024 “反应性官能团” 是指可以被激化(活化)以产生反应性物质的化合物。 这可以通过 例如催化剂或pH值变化来完成。 反应性物质能够在短时间内与合适的反应物形成共价键， 例如氨基甲酸酯键。 因此， 反应性官能团包括在其活化后与其他官能基团(例如氨基或酰胺 基)特异性反应的基团。 0025 术语 “间隔基” 是指分子内的多个原子的化合物， 其本身不含反应性官能团并在空 间上分离分子的两个官能基团。 间隔基是共价连接的链或环

22、结构， 其由碳、 磷、 硫、 硅、 氮和/ 或氧原子组成。 间隔基可含有对待分离的官能基团之间的距离没有贡献的取代基。 0026 术语 “分组” 是指分子内的多个原子的化合物。 通常， 这些原子形成例如间隔基等 官能单元、 反应性官能团或施加中介或诱导效应的分子结构。 0027 术语 “官能性接头化合物” 或 “接头化合物” 是指连接分子内的两个官能单元的官 能基团。 接头化合物与官能基团共价连接。 0028 术语 “接头” 、“接头分子” 、“接头系统” 和 “捕获化合物” 是指通过与相应的另一分 子形成共价键而连接两个其他分子的分子。 与其它两种分子的官能基团的共价键合仅在特 定反应条件下

23、发生。 特别地， 术语 “接头” 、“接头分子” 、“接头系统” 和 “捕获化合物” 是指属 于式(1)并且可以在肽的N端和固体载体之间建立连接的化合物。 说明书 2/32 页 8 CN 108602762 A 8 0029 术语 “取代” 是指向母体化合物中加入原子或分子基团或化合物。 可以受保护地或 不受保护地在母体分子中的一个或多个可用位点上添加取代基或化合物。 取代基或化合物 本身可以是取代的或未取代的， 并且可以直接或通过诸如如烷基、 酰胺基或烃基等连接基 团或化合物与母体分子连接。 取代基或化合物包括例如卤素、 氧、 氮、 硫、 羟基、 烷基、 烯基、 炔基、 羧基(-C(O)OR

24、a)、 酰基-(-C(O)Ra)-基团、 脂族基、 脂环基、 烷氧基、 氨基(-N(Rb) (Rc)、 亚氨基-(NRb)、 酰氨基-(-C(O)N(Rb)(Rc)或-N(Rb)C(O)Ra)基团、 肼类衍生物(-C (NH)NRaRb)、 三唑、 四唑(CN4H2)、 叠氮基(-N3)、 硝基(-NO2)、 氰基(-CN)、 异氰基(-NC)、 氰酰基 (-OCN)、 异氰酸基(-NCO)、 氰硫基(-SCN)； 异硫氰酸基(-NCS)、 脲基(-OC(O)N(Rb)(Rc)或- (Rb)C(O)ORa)基团、 硫醇(-SRb)、 亚硫酰基(-S(O)Rb)、 磺酰基(-S(O)2Rb)、

25、磺酰胺基(-S(O)2N (Rb)(Rc)或-N(Rb)S(O)2Rb)基团以及氟化化合物， 诸如-CF3、 -OCF3、 -SCF3、 -SOCF3或-SO2CF3。 Ra， Rb和Rc独立地为H或另一取代基。 0030 术语 “烷基” 是指最多12个碳原子的饱和直链或支链烃链。 优选的烷基的实例是甲 基、 乙基、 丙基、 丁基、 异丙基、 正己基、 辛基、 癸基。 0031 术语 “芳基” 是指在碳原子之间具有交替的双键和单键的形成了环结构的烃化合 物。 0032 术语 “离去基团” 是指分子内的官能基团， 其施加-M和/或-I效应， 并且由此可以轻 松地裂解， 其中在裂解后， 在离去基团

26、上保留有结合电子对。 0033 术语 “表面修饰的固体载体” 是指诸如琼脂糖凝胶单元、 琼脂糖单元或纤维素单 元、 硅胶或多葡聚糖等固体结构， 其由诸如多糖、 聚赖氨酸、 聚芳基酰胺、 聚乙二醇(PEG)或 丙烯酰胺-PEG-共聚物等合成或天然聚合物修饰。 固体载体的表面由醛基、 酮基、 羟胺基或 肼基表征。 0034 在一些实施方式中， Z是吸电子的离去基团， 其施加-M和/或-I效应， 并且在异裂键 断裂时携带结合的电子对。 0035 在一些实施方式中， Z是吸电子的离去基团， 其中对应于离去基团的阴离子的酸由 小于五的pks值表征。 0036 在一些实施方式中， Z是吸电子的离去基团，

27、其中对应于离去基团的阴离子的酸由 小于五的pks值表征， 并且其中离去基团特别地施加-M和/或-I效应， 并且在异裂键断裂时 携带结合的电子对。 0037 在一些实施方式中， U是官能性接头化合物的裂解活化部分， 其中活化部分表示一 种分组， 所述分组允许通过-M和-I效应形成阴离子， 并且通过电子对移位稳定所产生的阴 离子化合物， 其中该稳定化引起U和X2之间的异裂键断裂。 0038 在一些实施方式中， B选自Boc(-COOtBu)、 三苯甲基(-C(Ph)3)、 Mmt(-C(Ph) 2C6H4OMe)、 DMT(-C(Ph)(C6H4OMe)2)、 Cbz(-COOCH2Ph)、 亚苄

28、基胺(CPh)、 邻苯二甲酰亚胺 (CO)2C6H4)、 对甲苯磺酰胺(-SO2C6H4Me)、 苯甲胺(-CH2Ph)、 乙酰胺(-COMe)、 三氟乙酰胺 (-COCF3),Dde(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-乙基)以及1-(4,4-二甲基-2, 6-二氧代环己-1-亚基)-3-甲基丁基(ivDde)， 其中B特别地是Boc。 0039 在一些实施方式中， 缩醛或缩酮保护基团选自 说明书 3/32 页 9 CN 108602762 A 9 0040 其中r处于0至12之间， 特别地是0、 1或2。 0041 本领域技术人员已知， 也可以用其它对酸不稳定的保护基

29、团形成根据本发明的化 合物。 0042 在一些实施方式中， T选自取代或未取代的C1-C12-烷基-， 特别是C1-C6-烷基， 特别 是C1-C3-烷基， -R5-C(O)-NH-R6-， -R5-C(O)-O-R6-， -R5-C(O)-O-， -C(O)-O-R6-， -C (O)-NH-R6-， -C(O)-， -C(O)-O-， 其中R5和R6独立地选自取代或未取代的C1-C12-烷基， 特别是C1-C6-烷基， 特别是C1-C3-烷基。 0043 当T是取代的烷基时， 取代基特别是那些提高水溶性的取代基， 例如-SO3H、 -CO2H 或-NO2。 0044 在一些实施方式中， T

30、选自-CH2-、 -CH2-C(O)-NH-(CH2)2-、 -(CH2)-C(O)-O- (CH2)2-、 -CH2-C(O)-O-、 -C(O)-O-、 -C(O)-O-(CH2)2-和-C(O)-。 0045 在一些实施方式中， T选自-CH2-、 -CH2-C(O)-NH-(CH2)2-、 -C(O)-O-(CH2)2-、 - CH2-C(O)-O-和-C(O)-。 0046 在一些实施方式中， 化合物T-U-Y的U选自根据式(5)、 (6)、 (7)、 (8)、 (9)、 (10)和 (11)的化合物， 特别地选自(5)、 (6)、 (8)、 (9)和(10)， 其中R8选自C1-C

31、6-烷基、 CF3、 CH2CF3、 说明书 4/32 页 10 CN 108602762 A 10 0047 特别地选自Boc-Lys(Boc)-， 0048 其中R7n、 R9m、 R10p、 R11q、 R13r和R14s选自C1-C6-烷基或者产生-I和/或-M效应的取代 基， 特别是C1-C3-烷基、 -F、 -Cl、 -Br、 -I、 -CN-NO2、 -N3、 -CF3、 -SO3H和-CO2H， 0049 -其中n等于0、 1、 2、 3或4， 特别地， n是0或1， 特别是0 0050 -其中m等于0、 1、 2或3， 特别地， m是0或1， 特别是0 0051 -其中p等于

32、0、 1、 2、 3或4， 特别地， p是0或1， 特别是0 0052 -其中q等于0、 1、 2或3， 特别地， q是0或1， 特别是0 0053 -其中r等于0、 1、 2或3， 特别地， r是0或1， 特别是0 0054 -其中s等于0、 1、 2或3， 特别地， s是0或1， 特别是0。 0055 在一些实施方式中， R7n、 R9m、 R10p、 R11q、 R13r和R14s选自C1-C6-烷基或者产生-I和/或- M效应的取代基， 特别是C1-C3-烷基、 -F、 -Cl、 -Br、 -I、 -CN-NO2、 -N3、 -CF3、 -SO3H和-CO2H， 特别 是-F、 -Cl

33、、 -Br、 -I、 -NO2和-N3 0056 -其中n等于0、 1、 2、 3或4， 特别地， n是0或1， 特别是0 0057 -其中m等于0、 1、 2或3， 特别地， m是0或1， 特别是0 0058 -其中p等于0、 1、 2、 3或4， 特别地， p是0或1， 特别是0 0059 -其中q等于0、 1、 2或3， 特别地， q是0或1， 特别是0 0060 -其中r等于0、 1、 2或3， 特别地， r是0或1， 特别是0 0061 -其中s等于0、 1、 2或3， 特别地， s是0或1， 特别是0。 0062 在一些实施方式中， R7n、 R9m、 R10p、 R11q、 R1

34、3r和R14s选自提高水溶性的取代基， 特别地 选自-NO2、 -SO3H和-CO2H。 0063 在一些实施方式中， Z选自组-F、 -Cl、 -Br、 -I、 -N3、 -SR12、 -OCF3、 -OCH2CF3、 - OSO2CF3、 -SO2C6H4CH3、 -SO2CF3、 -SO2CH3， 0064 0065 说明书 5/32 页 11 CN 108602762 A 11 其中R12是C1-C6-烷基残基、 芳基残基或苯甲基残基。 0066 在一些实施方式中， Z选自-Cl、 0067特别地选自 0068 在一些实施方式中， X1是根据式(2)或(3)的化合物， 其中R3是H，

35、R1和R2具有Boc保 护基团， 或者R1是H且R2是Boc保护基团。 0069 在一些实施方式中， X1是根据式(3)的化合物， 其中R1和R3是H且R2是Boc保护基团。 0070 在一些实施方式中， Y具有-O-C(O)-的形式。 0071 在一些实施方式中， T具有-CH2-C(O)-NH-(CH2)2-、 -CH2-C(O)-O-(CH2)2-、 -C (O)-O-(CH2)2-的形式， 并且U是根据式(5)或(6)的化合物， 0072 0073 在一些实施方式中， T具有-C(O)-O-(CH2)2-或者-CH2-C(O)-NH-(CH2)2-的形 式， 并且U是根据式(6)的化合

36、物。 0074 在一些实施方式中， T具有-C(O)-O-(CH2)2-或者-CH2-C(O)-NH-(CH2)2-的形 式， 并且U是根据式(6)的化合物。 0075 在一些实施方式中， T具有-CH2-C(O)-NH-(CH2)2-的形式， 并且U是根据式(6)的 化合物。 0076 在一些实施方式中， T具有-CH2-C(O)-O-或者-C(O)-O-的形式， 并且U是根据 式(7)的化合物， 0077 0078 其中R7选自C1-C6-烷基或产生-I和/或-M效应的取代基， 特别是C1-C3-烷基、 -F、 - Cl、 -Br、 -I、 -CN-NO2、 -N3、 -CF3、 -SO3

37、H和-CO2H， 其中n等于0、 1、 2、 3或4， 特别是0或1， 特别是0。 0079 在一些实施方式中， T具有-CH2-C(O)-O-的形式， 并且U是根据式(7)的化合物， 其中n等于0。 0080 在一些实施方式中， T具有-CH2-的形式， 并且U是根据式(8)的化合物， 0081 其中R8是Boc-Lys(Boc)-， 并且r等于0。 0082 在一些实施方式中， T具有-CH2-或者-(CO)-的形式， 并且U是根据式(9)的化合 物， 说明书 6/32 页 12 CN 108602762 A 12 0083 其中s等于0。 0084 在一些实施方式中， T具有-CH2-的

38、形式， 并且U是根据式(9)的化合物。 0085 在一些实施方式中， T具有-C(O)-的形式， 并且U是根据式(10)的化合物， 0086 0087 其中m等于0， Y具有-SO2-的形式， 并且Z是Cl。 0088 在一些实施方式中， 根据式(1)的化合物选自2,2-二甲基丙酰氧基-2-2-2-(4- 硝基苯氧基)羰基氧基丙基磺酰基乙基氨基-2-氧代-乙氧基氨基2,2-二甲基丙酸酯 (式(14)， 2-2-2-(4-硝基苯氧基)羰基氧基丙基磺酰基乙基氨基-2-氧代乙氧基氨 基2,2-二甲基丙酸酯(式(15)， 2-(4-氯磺酰基-3-硝基苯甲酰基)肼基2,2-二甲基丙酸 酯(式(16)，

39、2,2-二甲基丙酰氧基-2-4-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氧基甲基 苯氧基-2-氧代-乙氧基氨基2,2-二甲基丙酸酯(式(17)， 2-(2,2-二甲基丙酰氧基)- 2-2-2-2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氧基丙磺酰基乙基氨基-2-氧代-乙氧 基肼基2,2-二甲基丙酸酯(式(18)， 2-(2,2-二甲基丙酰氧基)-2-2-2-2-(2,5-二氧 代吡咯烷-1-基)氧基羰基氧基乙基磺酰基乙基氨基-2-氧代-乙基肼基2,2-二甲基丙 酸酯(式(19)， 2-5-叠氮基-2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氧基甲基苯甲酰 基肼基2,2-二甲基丙酸酯(式(20)

40、， 3-(2,2-二甲基丙酰氧氨基)氨基甲酰基-4-(2, 5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氧基甲基苯基2,6-双(2,2-二甲基丙酰氧氨基)己酸酯 (式(21)， 2-2-2-2-(4-硝基苯氧基)羰基氧基丙磺酰基乙基氨基-2-氧代-乙氧基 肼基2,2-二甲基丙酸酯(式(22)， 2-2-2-2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氧 基-丙磺酰基乙基氨基-2-氧代-乙氧基肼基2,2-二甲基丙酸酯(式(23)， 2-2-4- (2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氧基甲基苯氧基-2-氧代-乙基肼基2,2-二甲基- 丙酸酯(式(24)， 2-2-2-(4-硝基苯氧基)羰基氧基乙磺酰基乙

41、氧羰基肼基2,2-二甲 基丙酸酯(式(25)， 3-2-(2,2-二甲基丙酰氧基)肼基甲基-4-(2,5-二氧代吡咯烷- 1-基)氧基羰基氧基甲基苯基2,6-双(2,2-二甲基丙酰氧氨基)己酸酯(式(26)， 2-5- 叠氮基-2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基氧基甲基苯基甲基肼基2,2-二甲基丙 酸酯(式(27)， 说明书 7/32 页 13 CN 108602762 A 13 0089 说明书 8/32 页 14 CN 108602762 A 14 0090 说明书 9/32 页 15 CN 108602762 A 15 0091 0092 在一些实施方式中， 根据式(1)的化合

42、物选自根据式(14)、 (15)、 (16)、 (17)、 (18)、 (19)、 (20)和(21)的化合物。 0093 在一些实施方式中， 根据式(1)的化合物选自根据式(16)、 (19)、 (20)和(21)的化 合物。 0094 在另一方面中， 本发明的目的通过应用一种根据第一方面的化合物得以实现， 该 化合物实现全长肽的N端氨基和固相之间的连接。 0095 在另一方面中， 本发明的目的通过一种根据式(12)的化合物， X1-L-Y-PEP(12)， 得 以实现， 其中通过第一方面及其实施方式定义X1、 L和Y， 并且其中PEP包括全长肽， 而该全长 肽通过其N端与X2 连接。 00

43、96 在另一方面中， 本发明的目的通过一种根据式(13)的化合物， D-X1 -L-Y-PEP (13)， 得以实现， 其中D是表面修饰的固体载体， 其特征在于， 通过合成或天然聚合物对表面 进行修饰， 其中X1 具有-NH-O-、 -NH-NH-或-C(O)-的形式， 并且其中L、 Y和PEP通过第一方 面及其实施方式定义。 0097 在一些实施方式中， 表面修饰的固体载体D由修饰的多糖表征。 0098 在一些实施方式中， 表面修饰的固体载体D由醛或者肼修饰的琼脂糖凝胶/琼脂糖 或纤维素表征。 0099 在另一方面中， 本发明的目的通过一种用于纯化肽的方法得以实现， 特别是借助 于固相肽合成

44、(SPPS)制备的肽， 所述方法包括下列步骤： 0100 i.将待纯化的全长肽和至少一种杂质， 特别是至少一种乙酰化的终止序列的组合 物与通过第一方面及其实施方式定义的捕获化合物接触， 随后反应， 以产生式(12)的化合 物， 0101 ii.通过添加酸， 使对酸不稳定的保护基团裂解， 0102 iii.将步骤ii中的组合物与表面修饰的固体载体接触， 其中在捕获化合物和固体 载体之间形成共价腙或肟键， 并提供式(13)的化合物， 说明书 10/32 页 16 CN 108602762 A 16 0103 iv.使全长肽从固体载体上裂解。 0104 在一些实施方式中， 步骤i.包括将还处于固相(

45、合成树脂)上的全长肽和终止序列 的混合物与通式X1-L-X2的化合物(捕获分子)接触， 其中按上文定义X1、 X2和L， 并且其中进 行接触的步骤引起化合物X1-L-X2在X2上与全长肽的游离N端氨基的反应， 以形成共价键。 借 助于酸， 进行肽从固相(合成树脂)上的裂解， 由此获得固相肽合成(SPPS)制得的与捕获分 子共价连接的全长肽与肽的乙酰化的终止序列的混合物。 例如通过过滤， 进行固相和液相 的分离。 在-78至0的温度下， 通过在醚中的沉淀， 移除非肽的杂质。 优选地， 在此将酸混 合物加入到所提供的醚中， 其中所有肽材料都沉淀下来， 而有机杂质保留在醚中。 接下来， 例如通过离心

46、作用来将醚溶液与肽混合物分离。 获得无定形固体形式的肽混合物。 0105 在一些实施方式中， 步骤ii.包括使步骤i)中的无定形固体溶于在pH值处于2至4 之间， 优选地处于2.5至3.5之间， 尤其优选地为3的至少部分水性的缓冲溶液中。 在此通过 添加酸或碱， 适当地调节pH值。 0106 在一些实施方式中， 步骤iii.包括使ii)中的混合物与表面修饰的固体载体(纯化 树脂)接触， 以通过形成腙或肟键， 共价连接通过捕获分子(步骤i)修饰的全长肽。 在此尤其 有利的是， 添加胺和/或乙酸作为催化剂， 以改善连接反应的动力学。 0107 通过用有机溶剂和/或用水和水性缓冲溶液洗涤， 移除并非

47、通过腙/肟键与固体载 体结合的肽终止序列， 优选加入离液物质， 以溶解可能非共价结合的肽。 0108 在一些实施方式中， 步骤iv.包括通过在碱性(亲核)条件下接头L从Y上的裂解， 使 全长肽从固相上分离， 其中以CO2或SO2的形式释放Y。 0109 在从式(13)(D-X1 -L-Y-PEP)开始的全长肽的裂解过程中， 产生全长肽(PEP)、 CO2 或SO2(Y )以及D-X1 -L或D 和X1 -L 。 0110 在一些实施方式中， 固体载体在其表面上具有官能基团醛、 酮、 羟胺和肼。 0111 在一些实施方式中， 固体载体在其表面上具有官能基团-O-CH2-CHO。 0112 在一些

48、实施方式中， 固体载体在其表面上具有官能基团-ONH2或-N2H3。 0113 在一些实施方式中， 通过过滤将固相与期望的全长肽分离； 通过用肼(H4N2)和/或 氢氧化铵H4NOH和/或醛和/或酮处理和/或用水洗涤， 再生固相(纯化树脂， D)。 0114 使用酸来使肽从合成树脂上裂解(步骤i)， 在此优选的是pks值低于4的有机酸和 无机酸。 尤其适合的是选自含氟酸的组的酸： 三氟乙酸(TFA)、 氢氟酸(HF)和三氟甲烷磺酸。 除此之外， 适合的是： 氢溴酸(HBr)、 盐酸(HCl)、 亚硫酸(H2SO3)、 硫酸(H2SO4)、 磷酸(H3PO4)、 硝酸(HNO3)或甲磺酸。 01

49、15 对于步骤i)中的沉淀， 使用在沉淀温度下以液体形式存在的有机溶剂， 这些溶剂 对于本领域技术人员而言通常是已知的。 优选来自醚类的有机溶剂， 尤其优选二乙醚和/或 甲基叔丁醚。 也可以使用在沉淀温度下呈液体形式的烷烃， 其中尤其优选的是正己烷和/或 正戊烷。 在步骤ii)中应用的、 恰当的至少部分水性的缓冲溶液对于本领域技术人员而言是 已知的， 即在2-5的pH范围内具有缓冲量的缓冲剂， 由此是具有下列阴离子的缓冲剂： 柠檬 酸盐、 苹果酸盐、 甲酸盐、 乳酸盐、 琥珀酸盐、 醋酸盐、 新戊酸盐和磷酸盐， 其与下列阳离子组 合： 钠、 钾、 铵(NH4、 NMe4、 NEt4、 NPr4、 NBu4、 HNC5H5)。 0116 为了调节pH值， 可以使用有机或无机酸， 优选HCl， 并且优选使用碱金属类氢氧化 物和/或碱土金属氢氧化物作为碱， 尤其优选NaOH和/或KOH。 说明书 11/32 页 17 CN 108602762 A 17 0117 为了更好地溶解肽， 在步骤ii)中可能有利的是， 向系统中加入可与水混溶的有机 溶剂， 这些溶剂对于本领域技术人员而言通常是已知的， 并且可以选自以下组： 二甲基甲酰 胺(DMF)、 乙腈。 四氢呋喃(THF)、 二恶烷、 吡啶、 丙酮、