本申请是申请日为2002年9月20日，申请号为00810878.1， 发明名称为“代谢控制的工程化”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及代谢控制的工程化，更具体地涉及工程化的宿主细 胞，其可以增加异源多肽和代谢物的产量，本发明还涉及在宿主细 胞中生产异源多肽和代谢物的方法。
背景技术
重组DNA技术的应用使得可工程化宿主细胞，以产生所需的化 合物，如多肽和次生代谢物。在工程细胞中大规模生产多肽使得可 生产具有药学用途的蛋白质和具有工业用途的酶。次生代谢物是来 自自然界的产物，长久以来已知其生物学和医学重要性。由于这种 分子固有的结构复杂性，传统的化学合成通常需要大量人力并使用 昂贵的前体和辅因子以制备该化合物。近年来，在细胞中表达异源 蛋白已经促进在生物中异源生物合成途径的工程化，以从非昂贵的 起始材料生产代谢物。以此方式，已产生了许多化合物，包括聚酮 化合物，β-内酰胺抗生素，单萜，类固醇，和芳香化合物。
发明内容
本发明部分基于如下发现，即可通过使用受次生代谢物如乙酰 磷酸浓度调节的启动子调节多肽(如生物合成酶)的表达，而增加 异源多肽和代谢物的产生。术语“异源”是指多肽或代谢物是通过 人为导入的。异源多肽或代谢物可与天然存在的内源性物质相同。
术语“代谢物”指是一或多个生物化学反应的产物的有机化合物。
代谢物其自身可以是其它反应的前体。次生代谢物是产生自另一代 谢物的代谢物。
因此本发明一方面涉及一种含有一核酸序列的细菌宿主细胞， 该核酸序列包含一个启动子和一个编码异源多肽的核酸序列。细菌 宿主细胞例如包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，根 瘤土壤杆菌，嗜热水生菌，和豌豆根瘤菌细胞。此核酸序列可操纵 地与由应答调节蛋白控制的启动子连接。换而言之，核酸序列与启 动子的连接方式是使核苷酸序列在体外或体内表达。“启动子”是指 导遗传物质转录的任何DNA片段。启动子是由应答调节蛋白控制 的，例如大肠杆菌的ntrC，phoB，phoP，ompR，cheY，creB，或 torB，或其它细菌菌种的同源物。另外，应答调节蛋白可以是簇合 直向同源组(cluster orthologous group，COG)COG0745的另一成员， 其由http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/所定义(Tatusov等，核酸研 究(2000)；28：33-36)。在一实施方案中，启动子是与大肠杆菌 ntrC结合的。术语“ntrC”是指大肠杆菌ntrC蛋白(SWISSPROT： P06713，http://www.expasy.ch/)及在其它适当细菌中的同源物。 本文所用“结合”是指平衡结合常数(KD)小于100nM，优选小于 1nM的物理缔合作用。一适当的启动子例如是大肠杆菌glnAp2启动 子，如以GenBank登记号No.M10421公布的DNA序列的大约93 -323位之间的区域(Reitzer & Magasanik(1985)美国科学院院报 82：1979-1983)。此区域包括glnA基因的未翻译序列。另外，可 在glnA编码序列和异源多肽的编码序列之间构建一翻译融合体。
宿主细胞被遗传修饰从而启动子由乙酰磷酸在无氮饥饿的情况 下调节。例如，宿主细胞可通过缺失或突变编码组氨酸蛋白激酶的 基因而遗传修饰，例如，该组氨酸蛋白激酶是COG0642的成员(如 由http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/所述；Tatusov等，如前)，例 如glnL，phoR，phoQ，creC，或envZ。在另一实施例中，组氨酸 蛋白激酶对控制启动子的应答调节蛋白有特异性。组氨酸蛋白激酶 可由glnL，如大肠杆菌glnL(SWISSPROT P06712， http://www.expasy.ch/)编码。
尽管宿主细胞被遗传修饰从而启动子由乙酰磷酸在无氮饥饿的 情况下调节，以表达异源多肽或代谢物，但宿主细胞可在任何所需 条件下繁殖，例如在氮饥饿条件，氮缺乏条件，或氮富足条件下繁 殖。
由此核酸序列编码的异源多肽可以是产生代谢物所需的生物合 成酶，其可以是哺乳动物蛋白，例如分泌的生长因子，单克隆抗体， 或胞外基质组分。在另一实施例中，异源多肽可以是用于疫苗中的 所需抗原，例如来自病毒，细菌，真菌或原生动物病原体的表面蛋 白。
本发明的另一方面涉及一种试剂盒，其含有一种核酸序列，该 核酸序列包括由应答调节蛋白控制的启动子。此试剂盒还任选的含 有已经遗传修饰的细菌宿主细胞，从而启动子在不存在氮饥饿情况 下由乙酰磷酸调节。此试剂盒还可提供使用说明。所述核酸序列可 含有位于启动子3’端的限制酶多接头，这样插入多接头的序列与 由应答调节蛋白控制的启动子可操纵地连接。在该试剂盒的一实施 方案中，启动子是大肠杆菌glnAp2启动子，细菌宿主细胞是含有glnL 基因缺失或突变的大肠杆菌细胞。
本发明另一方面涉及含有第一个表达盒的宿主细胞。第一个表 达盒包括启动子，如上述那些启动子，以及编码异源代谢物生物合 成所需的酶的核酸序列。本文所用术语“酶”是指具有催化一个化 学反应或多个反应的能力的多肽。所述核酸序列可操纵地与启动子 连接，该启动子在无氮饥饿情况下由乙酰磷酸调节。宿主细胞还含 有表达代谢物生物合成所需的其它酶的另外的核酸序列。这种另外 的核酸序列可以是表达内源酶的内源序列，或表达异源酶的导入的 序列。
在一实施例中，异源代谢物是类异戊二烯，多羟基链烷酸酯， 聚酮化合物，β-内酰胺抗生素，芳香化合物，或其前体，例如上游 代谢物，或其衍生物，例如下游代谢物。例如，类异戊二烯可以是 类胡萝卜素，固醇，紫杉醇，二萜，赤霉素，和醌。类异戊二烯的 特别例子包括二磷酸异戊酯，二磷酸二甲基烯丙酯，二磷酸香叶酯， 二磷酸法呢酯，二磷酸香叶基香叶酯，和八氢番茄红素。类胡萝卜 素特别例子包括β-胡萝卜素，ζ-胡萝卜素，虾青素，玉米黄质， 玉米黄质-β-葡糖苷，六氢番茄红素，链孢红素，叶黄素和torulene。 当所需的异源代谢物是类异戊二烯时，异源酶可以是异戊烯二磷酸 异构酶，二磷酸香叶基香叶酯合酶，或1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶。 当所需的异源代谢物是多羟基链烷酸酯时，异源酶可以是3-酮酯酰 还原酶，或聚-3-羟基链烷酸酯聚合酶。
宿主细胞可以是细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。此宿主细胞任 选地通过缺失或突变一个基因而遗传修饰，该基因例如是上述编码 组氨酸蛋白激酶的基因。在一特异的实施例中，宿主细胞还含有第 二个表达盒，其含有与受乙酰磷酸浓度调节的启动子如glnAp2可操 纵连接的编码烯醇丙酮酸磷酸合酶的核酸序列。
本发明另一方面涉及一种在宿主细胞中生产异源类异戊二烯的 方法。该方法包括过表达烯醇丙酮酸磷酸合酶，和表达异源类异戊 二烯合成所需的生物合成酶。在一实施方案中，在宿主细胞中编码 丙酮酸激酶或烯醇丙酮酸磷酸羧化酶的基因经遗传缺失或弱化。在 另一实施方案中，编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的基因在宿主细胞中 过表达。本发明的另一方面涉及一种在宿主细胞中生产番茄红素的 方法，此方法包括表达以下异源酶：1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶， 二磷酸香叶基香叶酯合酶，八氢番茄红素合酶，和八氢番茄红素饱 和酶。在此方法的一实施方案中，异戊烯二磷酸异构酶例如使用 glnAp2启动子而过表达。
本发明的另一方面涉及一种核酸序列，其含有一个启动子和编 码产生第一种代谢物所需的生物合成酶的序列。该启动子可操纵地 与该序列连接，并由第二种代谢物调节，该第二种代谢物的浓度是 生物合成第一种代谢物的前体的可用性的指示。在一实施例中，第 二种代谢物是从生物合成第一种代谢物的前体中产生的废物。
在一实施方案中，第一种代谢物是多羟基链烷酸酯，例如多羟 基丁酸酯，所述核酸序列编码生物合成酶，例如3-酮酯酰辅酶A (coA)还原酶，或聚-3-羟基辛酰辅酶A聚合酶。在另一种情况 中，第一种代谢物是聚酮化合物，β-内酰胺抗生素，或芳香化合物。 在另一种情况中，第一种代谢物是类异戊二烯，例如本文提及的类 异戊二烯。所述核酸序列可编码类异戊二烯生成所需的生物合成酶， 例如异戊烯二磷酸异构酶，二磷酸香叶基香叶酯合酶，1-脱氧木酮 糖-5-磷酸合酶，烯醇丙酮酸磷酸合酶，二磷酸法呢酯合酶，二磷酸 香叶基香叶酯合酶，八氢番茄红素合酶，八氢番茄红素脱饱和酶， 或番茄红素环化酶。类异戊二烯的一个前体可以是丙酮酸。丙酮酸 浓度与乙酸和乙酰磷酸浓度相关。因此，在这种情况下，第二种代 谢物是乙酰磷酸。对乙酰磷酸的应答的启动子可通过应答调节蛋白 控制，如以上提及的应答调节蛋白。这种启动子在特异的宿主细胞 中可只应答乙酰磷酸。在一特定的实施例中，应答乙酰磷酸浓度的 启动子与大肠杆菌ntrC结合，例如大肠杆菌glnAp2启动子。
启动子可以由cAMP调节。启动子可以是结合CAP(分解代谢 物激活蛋白)的细菌启动子。在哺乳动物中，启动子可以是含有cAMP 应答元件(CRE)的启动子，其结合CREB，CREM，或ATF-1蛋 白。在酵母细胞中，启动子可以是由cAMP调节的启动子，或结合 Gis1，Msn2或Msn4蛋白的启动子。启动子的其它可能的调节信号 可以是果糖-1-磷酸，或果糖-6-磷酸。大肠杆菌FruR蛋白调节这种 启动子。
所述核酸序列可包含在质粒中，其还可含有一个细菌复制源点， 和一个选择标记。此序列还可包含酵母或其它真核生物复制源点， 和适当的选择标记，并可整合入基因组中。
在宿主细胞中对生物合成异源化合物的优化，依赖于细胞生理 学感应参数，并依赖于利用这些参数调节生物合成。本领域的一种 标准方法是培养细胞，使用者外源性加入试剂如诱导物，以激活所 需产物的生物合成所需的基因。已广泛观测到高水平诱导重组蛋白 或途径导致生长延迟及降低代谢活性。(Kurland和Dong(1996)分 子微生物学21：1-4)。外源性应用诱导物根据经验进行，并不监 测细胞中生物合成资源的可用性。相反，天然途径依赖于反馈机制 控制这种过程。在本发明中一些启动子与特异的遗传限定的宿主细 胞和异源多肽的组合，令人预料到地产生高度精确的通用控制线路， 其应答细胞代谢状态而调节异源多肽或代谢物合成的通量。实际上， 动态控制的重组途径使产量增加，生长延迟最小化，并降低副产物 形成所产生的毒性。对生理状态应答而调节基因表达也有益于其它 应用，如基因治疗。
本发明的一或多种实施方案详见下述。通过以下阐述和权利要 求可清楚本发明的其它特征，目的和优点。
具体实施方式
本发明提供了代谢控制工程方法，例如利用特异宿主细胞中的 启动子优化蛋白质表达以生产蛋白质或合成代谢物的方法。
本发明的中心成分是一表达盒，其包含一个启动子和编码希望 表达的异源多肽的核酸序列。此表达盒用本领域的标准方法构建， 从而编码核酸序列可操纵地与启动子相连，例如由启动子调节。选 择受细胞生理学或细胞代谢状态参数调节的启动子。有许多启动子 可以使用。在一些应用中，所述表达盒包含于质粒中，如具有细菌 复制源点和选择标记的细菌质粒。表达盒可用本领域的标准方法整 合入细胞的基因组中。
如果表达盒用于工程异源多肽在晚期对数生长期或稳定期的调 控产生，则可由此选择启动子。例如，可选择应答其水平在对数生 长期或稳定期积累的小分子信号如第二信使的启动子。第二信使可 以是作为生物化学途径的前体，中间体，或废物而积累的分子。在 细菌中，小分子信号可以是糖酵解的中间体，如果糖-1-磷酸或果糖- 6-磷酸，或糖酵解的废物，如乙酸或乙酰磷酸。在真核细胞中，cAMP 浓度是熟知的营养状态信号。
表达盒中的启动子可基于大规模表达分析试验的结果选择，例 如基因芯片试验。由乙酰磷酸诱导的基因可通过与从在乙酸中生长 的细胞中制备的微阵列标记cDNA杂交，并将信号与参照信号对比 而鉴别，参照信号例如是用从早期对数生长的细胞中制备的cDNA 所得的信号。此试验可在原核或真核细胞，例如细菌，酵母，植物 和哺乳动物细胞中进行。在原核生物中进行的这种试验例如见Talaat 等，(2000)自然生物技术18：679-82和Oh&Liao(2000)生物技 术进展16：278-86所述。一旦鉴别出在所需条件下表达的基因， 其启动子可用在表达盒中。或者，可通过外源性加入所需分子(如 代谢途径中的前体)，或通过人工操纵试验条件(如生长至晚期对数 期，或在生物合成酶过量产生同时仍生长)，进行此试验。可基于诱 导的基因鉴别启动子。
在一种情况下，使用表达盒在细菌细胞中工程代谢物的调控产 生。可选择由第二种代谢物调节的启动子，该第二种代谢物的浓度 是生物合成第一种代谢物的前体的可用性的指标。例如，如果第一 种代谢物是合成自前体丙酮酸和甘油醛-3-磷酸的类异戊二烯，则 第二种代谢物可以是乙酰磷酸。在富集环境中，细胞产生过量的乙 酰辅酶A，这是丙酮酸的一种产物。过量的乙酰辅酶A用于产生ATP 和乙酸，乙酸作为废物分泌。乙酸浓度随细胞密度提高。乙酸，乙 酰辅酶A和乙酰磷酸浓度通过以下生物化学反应而相关：
(1)
(2)
因此，高乙酰磷酸浓度表明过量的乙酰辅酶A和过量的丙酮酸。 通过缺失或突变例如glnL而遗传修饰的宿主细胞，使ntrC功能成为 乙酰磷酸依赖性的(Feng等，(1992)细菌学杂志174：6061-6070)。 在此方式中，由ntrC调节的启动子，例如glnAp2启动子，可用于控 制对乙酰磷酸应答的基因表达。glnAp2启动子可使用本领域标准方 法获得。例如，可设计并合成与glnAp2启动子退火的引物。可使用 聚合酶链反应(PCR)扩增含有glnAp2启动子的核酸片段，此片段 可用于进一步构建过程。类似地，可容易地制备含有组氨酸蛋白激 酶基因例如glnL缺失的大肠杆菌菌株。见Link等，(1997)细菌学 杂志179：6228-6237详细阐述了一种可能的方法。编码所需异源 多肽的序列可克隆入glnAp2启动子的下游，以便其可操纵地与启动 子相连。然后可将具有失活的glnL基因的宿主细胞用此序列转化。 培养转化的菌株，并在生长期间监测多肽的产生。在高细胞密度可 观测到强的蛋白质表达，如Farmer和Liao(2000)自然生物技术18：533 -537所述，其内容在此并入参考。
哺乳动物细胞可用作生产多肽或代谢物的宿主细胞。可选择例 如对cAMP应答的启动子。这种启动子可含有cAMP应答元件 (CRE)，其结合CREB，CREM或ATF-1蛋白。使用本领域标准方 法，可将所需编码序列置于启动子的控制下，并转化入哺乳动物细 胞中。在一些情况中，可将此构建体插入病毒中，如失活的病毒。 这种应用使得在基因治疗方案中可实现由异源生物合成酶产生的蛋 白质或代谢物的调控产生。植物细胞也可用作宿主细胞。同样，可 选择适当的启动子，例如应答植物激素，代谢物，或产生所需代谢 物的前体的启动子。启动子可通过微阵列试验鉴别。在将所需启动 子与所需编码序列在适当载体中融合后，可将此构建体电穿孔入根 瘤农杆菌中，然后使用本领域标准方法用于转化植物细胞。在另一 实施例中，可操作酵母细胞使之在代谢控制下表达异源多肽或代谢 物。例如，酿酒酵母启动子可以是由cAMP调节的启动子，例如与 Gis1，Msn2，或Msn4蛋白结合的启动子。应答各种代谢条件的所 有酵母基因的调控正在日益增加地充分研究。例如，DeRisi等， (1997)科学278：680-686阐述了在各种代谢条件下，近于全部 的根瘤农杆菌基因的转录模式的试验。可基于这些数据选择由所需 代谢物调节的启动子。本领域熟知产生酵母质粒和转化酵母的方法。
可使用上述表达方法重建各种代谢途径。例如，通过构建以下 基因的表达载体，可将产生番茄红素的途径导入大肠杆菌中，所述 基因为：来自大肠杆菌的dxs(编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸 合酶)，来自Archaeoglobus fulgidus的gps(编码二磷酸香叶基香叶 酯(GGPP)合酶)，和来自Erwinia uredovora的crtBI(分别编码番 茄红素合酶和脱饱和酶)。这些基因可位于单个或多个质粒上，或可 整合入大肠杆菌染色体中。另外，可使用任何方法过表达烯醇丙酮 酸磷酸合酶，例如通过与glnAp2启动子融合而进行。异戊基二磷酸 异构酶可使用任何方法过表达，例如通过与glnAp2启动子融合而进 行。
在另一实施例中，可将产生多羟基链烷酸酯(PHA)，例如多羟 基丁酸酯的途径导入大肠杆菌中。PHA是一类具有各种热塑性和商 业用途的羟酸线性聚酯。编码3-酮酯酰辅酶A还原酶和聚-3-羟 基链烷酸酯聚合酶的铜绿假单胞菌基因可置于所需启动子例如 glnAp2的调节下，因为乙酰辅酶A水平可表明合成PHA的前体的 可用性。
不用进一步详细阐述，确信以上阐述已充分说明了本发明。以 下实施例只是举例说明本发明，而无任何限制之意。文中所引用的 文献均以全文并入参考。
方法
生长条件：将所有大肠杆菌全部生长于含有指定的培养基的摇瓶中， 此摇瓶置于37℃水浴摇床(Model G76；New Brunswick Scientific， Edison，NJ)中。将培养物生长于基本培养基中，该培养基由含有0.5 ％(wt/vol)葡萄糖的M9限定盐34，或含有1.5％(wt/vol)葡萄 糖的YE限定盐组成。YE限定盐(每升)由14g K2HPO4，16g KH2PO4， 5g(NH4)2SO4，1g MgSO4，和1mg硫胺素组成。在550nm经分光光 度法监测细胞浊度。
代谢物测定：用HPLC(Constametric 3500溶剂输送系统和分光监测 仪3100可变波长检测仪；LDC Analytical，Riviera Beach，FL)经 保持在65℃的有机酸层析柱(Aminex HPX-87H，Bio-Rad实验室， Hercules，CA)，测定乙酸，丙酮酸和其它有机酸。流动相由0.01N H2SO4组成，流速保持在0.6ml/分钟。在210nm检测层析柱峰。用Sigma 试剂盒No.315-100测定葡萄糖。为定量番茄红素，将1ml细菌培 养物用丙酮提取，离心，并在474nm测定上清吸光度。通过与标准 曲线吸光度对比计算番茄红素浓度。
SDS-PAGE和酶分析：SDS-PAGE方法见于Laemmli(1970)自然 227：680-685所述。测定β-半乳糖苷酶活性基本如Miller(1992) 细菌遗传学简要课程，冷泉港实验室出版社，冷泉港NY所述。
结果
在大肠杆菌中使用glnAp2启动子与lacZ的异源融合体
乙酰磷酸水平提高可表明过量葡萄糖通量。本发明特征是宿主 细胞，核酸序列，和利用乙酰磷酸作为信号调节所需代谢途径中控 速酶的表达，以充分利用过量碳通量并使通量不产生毒性产物，乙 酸。
为测试glnAp2作为产物表达的动态控制物的潜力，构建含有可 操纵地与glnAp2启动子连接的异源lacZ基因的核酸序列。含有启动 子和两个ntrC结合位点的glnAp2启动子区域，通过本领域的标准方 法可易于获得。此glnAp2启动子经PCR从大肠杆菌基因组DNA中 扩增出，使用正向引物5’-CAGCTGCAAAGGTCATTGCACCAAC (含有工程PvuII位点)，和反向引物5’-GGTACCAGTACGT- GTTCAGCGGACATAC(含有工程KpnI位点)。这两个引物扩增公 布的DNA序列16(GenBank登记号No.M10421)的93-343位之 间的区域。
将glnAp2PCR片段也克隆入pRS551的EcoRI位点，因此产生 p2GFPuv，其含有在无启动子的lacZ基因之前的glnAp2。通过同源 重组(Simons等，(1987)基因53：85-96)，将glnAp2-lacZ区域 转移至λRS45中，产生噬菌体λp2GFPuv。通过用λp2GFPuv噬菌体 感染(Silhavy等，(1984)，基因融合试验，冷泉港实验室出版社， 冷泉港NY)，将glnAp2-lacZ融合体分别整合入BW13711(lacX74) 和BW18302(lacX glnL2001；Feng等，如前)的染色体中而构建 JCL1595和JCL1596。此菌株含有glnL2001等位基因，其由glnL编 码序列的23和182密码子之间的内部缺失组成，并预计产生无效突 变(Feng等，如前)。
β-半乳糖苷酶活性的时程是在野生型和glnL突变体中测定的。 glnAp2-β-半乳糖苷酶活性以时间依赖型方式增加，这类似于从 glnL宿主(JCL1596)中分泌的乙酸浓度，而在等基因的野生型对 照(JCL1595)中未发现启动子活性被诱导。
表1：glnAp2-lacZ的β-半乳糖苷酶活性
因此，在没有glnL的情况下，glnAp2能应答由乙酸分泌代表的 过量碳通量。随着细胞接近晚指数期，生物合成需求降低，细胞开 始呈现过量碳通量，这由乙酸的产生增加而表明。在这点上，在大 约6小时，令人意外的glnAp2-β-半乳糖苷酶活性开始提高 (～700nmol/分钟/mg蛋白，见表1)，而野生型菌株(JCL1595)中 glnAp2-β-半乳糖苷酶活性相对较低，并在整个期间保持恒定 (～100nmol/分钟/mg蛋白，见表1)。在10小时以后，在无glnL情 况下，glnAp2-β-半乳糖苷酶活性达到～1500nmol/分钟/mg蛋白， 见表1。glnASp2的诱导分布图也完全与lac启动子(Plac)的分布图 形成鲜明对照。菌株VJS632(lac+)中染色体Plac活性在用IPTG(异 丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导后迅速提高，并在细胞中达到恒 定水平表达(～550nmol/分钟/mg蛋白，见表1)，其不依赖于生长时 期。
在大肠杆菌中使用glnAp2启动子与pps和aroG的异源融合体
将两个不同的代谢酶，烯醇丙酮酸磷酸合酶(pps)和3-脱氧 -D-阿拉伯庚酮糖酸(arabinoheptulosonate)-7-磷酸(DAHP) 合酶(aroG)的表达置于glnAp2启动子的控制下。作为对照，将同 样的这两个蛋白也用呈静置对照的tac启动子(Ptac)，在相同遗传背 景和环境条件下过表达。表达pps的标准方法导致生长延迟(Patnaik 等，细菌学杂志174：7527-7532)。
通过将含有aroG pRW5tkt的PCR片段克隆入pJF118EH的EcoRI -BamHI位点中，构建质粒pAROG。质粒pPS706已由Patnaik等 (如前)阐述。这两个质粒表达在Ptac启动子下的相应基因。将含有 glnAp2启动子的PCR片段分别克隆入质粒pAROG和pPS706的 EcoRV-EcoRI位点中，产生含有在glnAp2启动子控制下的相应基 因的质粒p2AROG3和pPSG706。
用所有4个质粒转化宿主菌株BW18302(lacXglnL2001)。将具 有相应质粒的菌株培养于M9盐-葡萄糖培养基中。在5小时后对 比生长情况。
表2：过表达菌株的生长
在生长5小时后的OD550 无质粒 ～0.5 Ptac-aroG ～0.5 glnAp2-aroG ～0.5 Ptac-pps ～0.12 glnAp2-pps ～0.4
如前所述，用Ptac-pps过表达pps导致生长明显延迟。然而， 使用glnAp2意外地产生接近正常的生长(见表2)。在15小时后， 从每个菌株中分离蛋白质，并在10％SDS-PAGE凝胶上进行分析。 当与Ptac启动子控制的pps基因相对比时，由glnAp2启动子控制的 pps基因有至少多500％的pps蛋白质表达。另一令人惊奇的发现是， 利用glnAp2启动子进行表达与利用Ptac启动子进行表达相比，在细 胞的提取物中AroG蛋白也至少多300％，aroG蛋白的过表达没有 公开的害处。
通过idi过表达在大肠杆菌中生产番茄红素
通过表达来自大肠杆菌的dxs基因(编码1-脱氧-D-木酮糖 5-磷酸合酶)，来自Archaeoglobus fulgidus的gps基因(编码二磷 酸香叶基香叶酯(GGPP)合酶)，和来自Erwinia uredovora的crtBI 基因(分别编码八氢番茄红素合酶和脱饱和酶)，在大肠杆菌中重建 重组番茄红素途径。将这些基因插入低拷贝数质粒pCL1920中形成 pCW9，并同时过表达。
使用glnAp2启动子控制idi(异戊烯二磷酸异构酶)的表达。含 有idi基因的构建体衍生自无启动子载体pJF118。插入glnAp2启动 子形成p2IDI。作为对照，插入Ptac启动子形成pTacIDI。将这些质 粒分别导入含有pCW9的glnL菌株(BW18302)中。含有p2IDI的 菌株(glnAp2-idi)在含有葡萄糖的规定培养基中培养26小时后， 产生100mg/L的番茄红素。与此相反，含有Ptac-idi的菌株在相同 条件下，只产生少量的番茄红素(＜5mg/L)。另外，p2IDI菌株比pTacIDI 产生几乎少3倍的乙酸，这表明为流向乙酸的碳通量已更改为流向 番茄红素。
表3在大肠杆菌分批培养物中番茄红素形成的碳收率
在葡萄糖上番茄红素碳收率 (mol C/mol C) 宿主(BW18302) 0.0000 +pTacIDI(Ptac-idi) 0.0003 +pTacIDI(Ptac-idi)/pPS184(Ptac-pps) 0.0012 +p2IDI(glnAp2-idi) 0.014 +p2IDI(glnAp2-idi)/pPSG184(glnAp2-pps) 0.022
使用pps增加番茄红素产量
从另一相容质粒pPSG18中经glnAp2过表达pps，同时用pCL1920 表达番茄红素途径其余基因(dxs，gps，crtBI)。pps和idi与番茄红 素途径共表达使番茄红素的终滴度提高50％，并使产量提高3倍， 从0.05mg/ml/小时提高至0.16mg/ml/小时(表3)。这与含有pTacIDI 和pPS184的对比菌株(Ptac-idi+Ptac-pps)相反，它们的产量没 有明显改进，并发生实际生长抑制。
生产番茄红素的其它宿主细胞
将pykF::cat和pykA::kan等位基因导入野生型菌株中，以产 生两个单突变体菌株(JCL1610(pykF)和JCL1612(pykA))，和一 个双突变体菌株(JCL1613(pykF pykA))(Ponce等，(1995)细菌 杂志177：5719-5722)。双突变体菌株能达到终番茄红素滴度为大 约14mg番茄红素/g干细胞，而每个单突变体菌株所得番茄红素滴 度为大约2.5mg番茄红素/g干细胞。单pyk突变体产生的番茄红素 水平与野生型菌株相似，大约为4mg番茄红素/g干细胞。另外，过 表达Pck(烯醇丙酮酸磷酸羧激酶)使番茄红素的终滴度提高大约3 倍。过表达Ppc(烯醇丙酮酸磷酸羧化酶)使番茄红素的产量降低 大约30％。
其它实施方案
本发明的许多实施方案已经阐述。另外应知在不违背本发明精 神和范围之下，可对本发明加以各种修改。因此，其它实施方案在 所附权利要求的范围内。例如，提及的多肽和基因的所有同源物均 在本发明范围内。