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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711459576.4 (22)申请日 2017.12.28 (71)申请人 山西省农业科学院作物科学研究所 地址 030031 山西省太原市小店区龙城大 街81号 (72)发明人 张晓军阎晓涛田志刚李光蓉 畅志坚李欣郭慧娟乔麟轶 任永康车丽高伟秦秀珍 (74)专利代理机构 太原科卫专利事务所(普通 合伙) 14100 代理人 朱源 (51)Int.Cl. C12N 1/14(2006.01) C12R 1/77(2006.01) (54)发明名称 小麦赤霉病谷粒菌种制作及。
2、使用方法 (57)摘要 本发明涉及植物真菌病害病原菌培养， 具体 为小麦赤霉病谷粒菌种制作及使用方法， 解决现 有接菌鉴定方法需培养菌液， 方法复杂， 菌液不 能长期存放， 接菌成功率低的问题， 谷粒菌种制 备： 带壳谷粒泡5%绿豆水保持60%持水率， 分装入 袋轻压紧密， 封口制菌筒， 高温高压灭菌晾至室 温， 两端接菌黑暗恒温通风高湿度培养， 转移至 透气纸袋， 压散阴凉通风晾干封口袋中低温避光 保存。 使用方法： 先检测活性， 抽穗后扬花前基部 小穗侧小花内稃接菌， 包裹保湿至外稃变褐取下 包裹层， 高湿度弥雾保湿28天。 优点： 1、 菌种可长 期保存； 2、 一次制作， 多次使用， 。
3、用量少， 便于运 输； 3、 接菌方法简单高效， 发病率高， 抗病性鉴定 结果准确。 权利要求书1页 说明书4页 CN 108277165 A 2018.07.13 CN 108277165 A 1.一种小麦赤霉病谷粒菌种制作方法， 包括以下操作步骤： a、 准备新鲜饱满， 无虫蛀及发霉的绿豆50g， 加入纯净水1200ml， 置于火上烧开， 水沸腾 后熬制15-20min， 在绿豆刚刚开花的时候关火， 用细纱布滤去绿豆残渣， 仅保留绿豆水， 补 充纯净水至1000ml， 配制成5%的绿豆水， 备用； b、 准备干燥、 无霉变、 去净浮皮、 碎渣的新鲜带壳谷粒1kg， 置于干净容器中， 加入温。
4、热 的5%绿豆水， 充分搅拌使谷粒完全湿润， 加盖保湿4小时， 使谷粒充分吸水； c、 滤去多余水分， 将浸泡好的谷粒在阴凉通风处摊开晾干30min， 使谷粒持水率达到约 60%左右， 用手捏不成团即可； d、 将处理好的谷粒分装到耐高温高压聚丙烯灭菌袋中， 每袋分装300-500g， 轻压使其 保持较为紧密的状态； e、 用透气的菌种袋海绵封口套环在耐高温高压聚丙烯灭菌袋两端进行封口， 制作成菌 筒， 防止杂菌污染； f、 制作好的菌筒置于高压灭菌锅中， 125高温高压灭菌2小时， 放气后晾至室温； g、 在超净工作台上打开菌筒一端的海绵封口套环的海绵盖， 用灭过菌的镊子夹取黄豆 大的一小块。
5、赤霉菌种， 放入菌筒一端谷粒上， 盖好透气海绵盖； 另一端如法炮制， 使菌筒两 端都接上菌种； h、 接好菌的菌筒置于完全黑暗的培养箱或培养间中25恒温培养， 保持通风， 培养箱 或培养间保持相对湿度60 %左右， 菌种培养期间间隔1-2天翻转一次菌筒， 保证菌丝生长一 致， 约7-10天左右， 待菌丝长满菌筒后， 菌筒培养结束； i、 在超净工作台上将培养好的菌筒一端打开， 将菌种转移到无菌的透气纸袋中， 将带 菌的谷粒压散， 置于阴凉通风处悬挂晾干； j、 完全晾干的菌种可装入无菌自封口塑料袋中， 贴上菌种标签， 注明菌种名称及日期， 在4条件下避光保存； 也可装入真空包装袋中， 抽真空后。
6、， 置于-20条件下长期保存。 2.小麦赤霉病谷粒菌种使用方法， 包括以下操作步骤： 一、 检测活性： 在干净的培养皿中铺一张滤纸， 加入少量灭菌蒸馏水， 使滤纸完全湿润， 每个培养皿中放入50粒谷粒菌种， 使菌种完全散开， 加盖后贴上菌种标签， 置于完全黑暗的 培养箱中25恒温培养， 36小时后观察菌丝生长情况， 若谷粒菌种周围长满白色菌丝， 表明 菌种具有活性， 若谷粒菌种未生长菌丝， 则表明菌种失去活性， 安排2-3次重复， 记录并统计 具有活性菌种的比例， 若具有活性菌种占90%以上， 则可用于田间接菌； 二、 采用单花接菌法进行接菌， 接菌时期为小麦抽穗后至扬花前， 接菌部位为小麦基。
7、部 最下方小穗一侧往上数第6个小穗的右侧小花， 选取抽穗2-3天的穗子， 用镊子夹取一粒谷 粒菌种， 放入目标小穗右侧小花的内稃中， 用手持喷雾水壶对准接菌穗子喷2-3下纯净水， 保持穗子湿润， 将穗子包一层透明保鲜膜， 或用PE塑料袋套住该麦穗保湿， 悬挂标签， 记录 接菌时间， 每行材料接菌至少10个穗子； 三、 接菌后注意观察接菌部位， 保湿约3-5天， 待接菌小穗外稃变褐后， 取下保鲜膜或塑 料袋； 四、 加装弥雾保湿系统， 每日喷水5-10次， 使其生长环境保持湿度大于50%， 湿度越大越 有利于赤霉菌扩展， 若气候干燥， 则适当增加喷水次数； 五、 分别于接菌后21天和28天调查赤。
8、霉病发病情况， 调查方法采用常规方法进行调查。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108277165 A 2 小麦赤霉病谷粒菌种制作及使用方法 技术领域 0001 本发明涉及植物真菌病害病原菌培养， 具体为小麦赤霉病谷粒菌种制作及使用方 法。 背景技术 0002 小麦赤霉病 （Fusarium head blight， FHB） 是由禾谷镰刀菌 （Fusarium graminearum） 引起的严重危害小麦穗部及籽粒的一种毁灭性病害， 主要发生于长江中下 游、 淮河流域冬麦区和东北春麦区等潮湿及半潮湿地区。 病害流行年份， 可造成小麦70%- 100%的产量损失， 经赤霉菌感染的小麦病粒， 。
9、含有多种毒素， 尤其是DON毒素， 对人和动物均 有很强的毒性， 能引起人和动物呕吐、 腹泻、 皮肤刺激、 拒食、 神经紊乱、 流产、 死胎等。 当病 麦率达到4%以上时， 即不能食用， 失去商品价值。 0003 近年来， 随着全球气候变暖加剧以及耕作制度的变化， 厄尔尼诺和拉尼娜事件交 替出现， 极端天气频发， 小麦赤霉病逐渐由偶发病害上升为常发病害， 发生面积也不断扩 大， 赤霉病已由常发的长江中下游麦区扩展到黄淮麦区和华北麦区， 淮河流域麦区已经成 为受赤霉病为害最严重的地区之一。 但世界上尚无防治赤霉病的有效方法， 也未研制出能 够彻底防治小麦赤霉病的化学药剂， 因此， 选育与推广抗赤。
10、霉病品种就成为目前控制与预 防小麦赤霉病最为经济环保的途径。 0004 接菌鉴定是选育小麦抗赤霉病品种的重要手段， 常用的方法有单花滴注法、 菌液 喷雾法、 土表接菌法等， 这几种方法各有优缺点。 单花滴注法接菌精确， 能够保证接菌成功 率， 可进行定性定量鉴定； 但在接菌前需要进行菌液培养， 所需设备较为复杂， 对环境及培 养条件要求严格， 每次接菌前需要在显微镜下检测活菌数目， 且培养好的菌液不能长期存 放， 极易丧失活性， 因此对于赤霉病的鉴定极为不便。 菌液喷雾法接菌方便， 利于进行大面 积、 成规模接菌鉴定； 但同样需要在每次接菌前培养菌液， 并在显微镜检测活菌数目， 菌液 保存不便。
11、及保存时间短， 接菌成功率较低。 土表接菌法采用谷物类籽粒培养菌种， 洒于土表 后依靠孢子弹射自然发病， 对环境要求较高， 接菌成功率较低， 难以对小麦品种进行定性定 量鉴定。 0005 因此， 研究一种制作、 使用方法简单， 接菌成功率高， 可长期保存的小麦赤霉病谷 粒及使用方法是很有必要的。 发明内容 0006 本发明解决目前现有的接菌鉴定方法需培养菌液， 且制备方法复杂， 培养好的菌 液不能长期存放， 接菌成功率低的问题， 提供一种制备方法简单、 无需培养菌液， 制备好的 谷粒可以长期保存而不丧失活性， 接菌成功率高的小麦赤霉病谷粒菌种制作及使用方法。 0007 本发明是通过以下操作步骤。
12、实现的： 小麦赤霉病谷粒菌种制作方法， 包括以下操 作步骤： a、 准备新鲜饱满， 无虫蛀及发霉的绿豆50g， 加入纯净水1200ml， 置于火上烧开， 水沸腾 说明书 1/4 页 3 CN 108277165 A 3 后熬制15-20min， 在绿豆刚刚开花的时候关火， 用细纱布滤去绿豆残渣， 仅保留绿豆水， 补 充纯净水至1000ml， 配制成5%的绿豆水， 备用； b、 准备干燥、 无霉变、 去净浮皮、 碎渣的新鲜带壳谷粒1kg， 置于干净容器中， 加入温热 的5%绿豆水， 充分搅拌使谷粒完全湿润， 加盖保湿4小时， 使谷粒充分吸水； c、 滤去多余水分， 将浸泡好的谷粒在阴凉通风处摊开。
13、晾干30min， 使谷粒持水率达到约 60%左右， 用手捏不成团即可； d、 将处理好的谷粒分装到耐高温高压聚丙烯灭菌袋中， 每袋分装300-500g， 轻压使其 保持较为紧密的状态； e、 用透气的菌种袋海绵封口套环在耐高温高压聚丙烯灭菌袋两端进行封口， 制作成菌 筒， 防止杂菌污染； f、 制作好的菌筒置于高压灭菌锅中， 125高温高压灭菌2小时， 放气后晾至室温； g、 在超净工作台上打开菌筒一端的海绵封口套环的海绵盖， 用灭过菌的镊子夹取黄豆 大的一小块赤霉菌种， 放入菌筒一端谷粒上， 盖好透气海绵盖； 另一端如法炮制， 使菌筒两 端都接上菌种； h、 接好菌的菌筒置于完全黑暗的培养箱。
14、或培养间中25恒温培养， 保持通风， 培养箱 或培养间保持相对湿度60 %左右， 菌种培养期间间隔1-2天翻转一次菌筒， 保证菌丝生长一 致， 约7-10天左右， 待菌丝长满菌筒后， 菌筒培养结束； i、 在超净工作台上将培养好的菌筒一端打开， 将菌种转移到无菌的透气纸袋中， 将带 菌的谷粒压散， 置于阴凉通风处悬挂晾干； j、 完全晾干的菌种可装入无菌自封口塑料袋中， 贴上菌种标签， 注明菌种名称及日期， 在4条件下避光保存； 也可装入真空包装袋中， 抽真空后， 置于-20条件下长期保存。 0008 小麦赤霉病谷粒菌种使用方法， 包括以下操作步骤： 一、 检测活性： 在干净的培养皿中铺一张滤。
15、纸， 加入少量灭菌蒸馏水， 使滤纸完全湿润， 每个培养皿中放入50粒谷粒菌种， 使菌种完全散开， 加盖后贴上菌种标签， 置于完全黑暗的 培养箱中25恒温培养， 36小时后观察菌丝生长情况， 若谷粒菌种周围长满白色菌丝， 表明 菌种具有活性， 若谷粒菌种未生长菌丝， 则表明菌种失去活性， 安排2-3次重复， 记录并统计 具有活性菌种的比例， 若具有活性菌种占90%以上， 则可用于田间接菌； 二、 采用单花接菌法进行接菌， 接菌时期为小麦抽穗后至扬花前， 接菌部位为小麦基部 最下方小穗一侧往上数第6个小穗的右侧小花， 选取抽穗2-3天的穗子， 用镊子夹取一粒谷 粒菌种， 放入目标小穗右侧小花的内稃。
16、中， 用手持喷雾水壶对准接菌穗子喷2-3下纯净水， 保持穗子湿润， 将穗子包一层透明保鲜膜， 或用PE塑料袋套住该麦穗保湿， 悬挂标签， 记录 接菌时间， 每行材料接菌至少10个穗子； 三、 接菌后注意观察接菌部位， 保湿约3-5天， 待接菌小穗外稃变褐后， 取下保鲜膜或塑 料袋； 四、 加装弥雾保湿系统， 每日喷水5-10次， 使其生长环境保持湿度大于50%， 湿度越大越 有利于赤霉菌扩展， 若气候干燥， 则适当增加喷水次数； 五、 分别于接菌后21天和28天调查赤霉病发病情况， 调查方法采用常规方法进行调查。 0009 本发明小麦赤霉病谷粒菌种与现有技术相比较， 具有以下优点： 1、 与单。
17、花滴注法 比较： 单花滴注法需使用恒温摇床培养菌液， 每次接种前需要在显微镜下检测孢子数目， 培 说明书 2/4 页 4 CN 108277165 A 4 养好的菌液不能长期存放 （在4条件下保存不能超过1个月） ， 孢子易丧失活性， 异地鉴定 携带不方便； 本发明制作的谷粒菌种使用5%的绿豆水浸泡谷粒后， 所含营养成分较为丰富， 既有利于赤霉菌丝营养体的生长， 也有利于赤霉菌孢子的形成， 而且不需要恒温摇床， 只需 要在25左右的恒温条件下培养7-10天 （因繁殖菌量大， 所以培养时间较长一些） ， 培养条 件相比绿豆水液体培养更加容易实现， 干燥后的带菌谷粒， 赤霉菌孢子处于休眠状态， 有。
18、利 于菌种的长期保存， 也方便携带到异地进行接种鉴定， 而且谷粒菌种在置于适宜的温湿度 条件下， 孢子很快萌发， 恢复营养生长， 实验表明4条件下保存的菌种和-20条件下保存 的菌种， 保存6个月以后， 具有活性的菌种都达到95%以上。 2、 与菌液喷雾法比较： 菌液喷雾 法适宜大面积大量接菌鉴定， 但受环境影响大， 接菌成功率低， 无法对鉴定目标进行精确定 性定量分析， 仅适合育成品种的抗病鉴定， 不适合遗传群体单株 （或单穗） 鉴定； 本发明制作 的谷粒菌种可以进行单株接种， 能够保证接种效果与发病成功率， 而且适宜进行遗传群体 单株 （或单穗） 鉴定。 3、 与土表接菌法比较： 土表接菌。
19、法常采用谷物类籽粒 （如小麦、 玉米、 水 稻粒等） 培养菌种， 洒于土表后依靠孢子弹射自然发病， 对环境要求较高， 接菌成功率较低， 难以对小麦品种进行定性定量鉴定； 本发明制备的谷粒菌种单粒体积小， 因谷子带壳， 菌种 制作过程中不易发生粘连， 由菌丝生长的粘连很容易分散成单颗谷粒， 干燥后可以撒于土 壤表面进行土表接种， 也可使用镊子夹取单颗谷粒置于麦穗小花内稃， 达到与单花滴注法 相同的接种效果， 可以进行遗传群体单株 （或单穗） 鉴定， 因此， 适用范围比使用小麦、 玉米、 水稻粒等制作的菌种更广。 4、 此外， 本发明制备的谷粒菌种一次制作， 多次使用， 谷粒较小， 千粒重仅为2.。
20、2-4.0g左右， 一次制作1kg， 可获得菌种22-40万粒， 即可以接菌22-40万个小 麦穗子， 用量少， 便于运输， 制作一次菌种即可供应多地多次使用； 5、 接菌方法简单高效， 发 病率高， 抗病性鉴定结果准确， 完全可替代传统的单花滴注法鉴定赤霉病抗性。 具体实施方式 0010 小麦赤霉病谷粒菌种制作方法， 包括以下操作步骤： a、 准备新鲜饱满， 无虫蛀及发霉的绿豆50g， 加入纯净水1200ml， 置于火上烧开， 水沸腾 后熬制15-20min， 在绿豆刚刚开花的时候关火， 用细纱布滤去绿豆残渣， 仅保留绿豆水， 补 充纯净水至1000ml， 配制成5%的绿豆水， 备用； b、。
21、 准备干燥、 无霉变、 去净浮皮、 碎渣的新鲜带壳谷粒1kg， 置于干净容器中， 加入温热 的5%绿豆水， 充分搅拌使谷粒完全湿润， 加盖保湿4小时， 使谷粒充分吸水； c、 滤去多余水分， 将浸泡好的谷粒在阴凉通风处摊开晾干30min， 使谷粒持水率达到约 60%左右， 用手捏不成团即可； d、 将处理好的谷粒分装到耐高温高压聚丙烯灭菌袋中， 每袋分装300-500g， 轻压使其 保持较为紧密的状态； e、 用透气的菌种袋海绵封口套环在耐高温高压聚丙烯灭菌袋两端进行封口， 制作成菌 筒， 防止杂菌污染； f、 制作好的菌筒置于高压灭菌锅中， 125高温高压灭菌2小时， 放气后晾至室温； g、。
22、 在超净工作台上打开菌筒一端的海绵封口套环的海绵盖， 用灭过菌的镊子夹取黄豆 大的一小块赤霉菌种， 放入菌筒一端谷粒上， 盖好透气海绵盖； 另一端如法炮制， 使菌筒两 端都接上菌种； 说明书 3/4 页 5 CN 108277165 A 5 h、 接好菌的菌筒置于完全黑暗的培养箱或培养间中25恒温培养， 保持通风， 培养箱 或培养间保持相对湿度60 %左右， 菌种培养期间间隔1-2天翻转一次菌筒， 保证菌丝生长一 致， 约7-10天左右， 待菌丝长满菌筒后， 菌筒培养结束； i、 在超净工作台上将培养好的菌筒一端打开， 将菌种转移到无菌的透气纸袋中， 将带 菌的谷粒压散， 置于阴凉通风处悬挂晾。
23、干； j、 完全晾干的菌种可装入无菌自封口塑料袋中， 贴上菌种标签， 注明菌种名称及日期， 在4条件下避光保存； 也可装入真空包装袋中， 抽真空后， 置于-20条件下长期保存。 0011 小麦赤霉病谷粒菌种使用方法， 包括以下操作步骤： 一、 检测活性： 在干净的培养皿中铺一张滤纸， 加入少量灭菌蒸馏水， 使滤纸完全湿润， 每个培养皿中放入50粒谷粒菌种， 使菌种完全散开， 加盖后贴上菌种标签， 置于完全黑暗的 培养箱中25恒温培养， 36小时后观察菌丝生长情况， 若谷粒菌种周围长满白色菌丝， 表明 菌种具有活性， 若谷粒菌种未生长菌丝， 则表明菌种失去活性， 安排2-3次重复， 记录并统计 。
24、具有活性菌种的比例， 若具有活性菌种占90%以上， 则可用于田间接菌； 二、 采用单花接菌法进行接菌， 接菌时期为小麦抽穗后至扬花前， 接菌部位为小麦基部 最下方小穗一侧往上数第6个小穗的右侧小花， 选取抽穗2-3天的穗子， 用镊子夹取一粒谷 粒菌种， 放入目标小穗右侧小花的内稃中， 用手持喷雾水壶对准接菌穗子喷2-3下纯净水， 保持穗子湿润， 将穗子包一层透明保鲜膜， 或用PE塑料袋套住该麦穗保湿， 悬挂标签， 记录 接菌时间， 每行材料接菌至少10个穗子； 三、 接菌后注意观察接菌部位， 保湿约3-5天， 待接菌小穗外稃变褐后， 取下保鲜膜或塑 料袋； 四、 加装弥雾保湿系统， 每日喷水5。
25、-10次， 使其生长环境保持湿度大于50%， 湿度越大越 有利于赤霉菌扩展， 若气候干燥， 则适当增加喷水次数； 五、 分别于接菌后21天和28天调查赤霉病发病情况， 调查方法采用常规方法进行调查。 0012 实施例一： 2017年4月在北方某省市农业科学院科技创新基地日光温室内的小麦 试验田中， 利用本发明制作的小麦赤霉菌谷粒菌种给139行小麦的695个穗子接菌鉴定。 其 中12个穗子因人为原因穗子折断， 鉴定无效。 其余683个穗子中， 有效发病穗为671个， 接菌 发病率为98.24%。 共鉴定出高抗至免疫赤霉病的小麦新品系35个， 其中6个品系病小穗率为 5.48%， 为139个品系中。
26、抗性最好的品种。 感病对照品种绵阳8545的病小穗率为55.56%， 抗病 对照苏麦3号的病小穗率为10.01%。 0013 实施例二： 同年4月， 在南方某省市农业科学院现代农业科技创新示范园小麦试验 田中， 利用本发明制作的小麦赤霉菌谷粒菌种给120行小麦的1200个穗子接菌鉴定。 其中39 个穗子因刮风、 下雨等原因， 保湿膜脱落， 鉴定无效。 其余1161个穗子， 有效发病穗为1093 个， 接菌发病率为94.14%。 共鉴定出高抗至免疫赤霉病的小麦新品系27个， 其中8个品系病 小穗率为6%以下， 且整行全部接种穗抗性一致。 感病对照品种绵阳8545的病小穗率为 48.22%， 感病对照Alondra的病小穗率为57.64%， 抗病对照苏麦3号的病小穗率为9.26%， 抗 病对照望水白的病小穗率为11.38%。 说明书 4/4 页 6 CN 108277165 A 6 。