技术领域
本发明是一种普鲁兰酶及其生产方法。属于作用在α-1，6-糖苷键上的淀粉水解酶。
背景技术
淀粉是绿色植物光合作用的产品，在植物淀粉中，支链淀粉的含量约占70％～95％，如玉米中74％、马铃薯中76％、小麦中75％、稻谷中占81％，糯米中占100％。支链淀粉的相对分子量很大，大约100万～600万。支链淀粉中，如同在直链淀粉中一样，D-葡萄糖单位也通过α-1，4-苷键连接成一直链，只不过在此直链上又通过α-1，6-苷键形成侧链，在侧链上又会出现另一个分支侧链。因此结构很复杂，成树形分支结构。由于支链淀粉中约含有4％～5％的α-1、6-糖苷键，而传统淀粉酶对淀粉中的α-1、6-糖苷键的水解能力较弱，一直影响着淀粉最终水解度的提高。
普鲁兰酶(Pullulanase，EC.3.2.1.41)能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1、6-糖苷键，剪下整个侧枝，而使其变成直链淀粉。有效的弥补了糖化酶在淀粉水解中的不足，普鲁兰酶与糖化酶复合使用具有良好的协同效果，在糖化酶用量低于传统用量的50％的条件下，可使DE值高达98％以上。普鲁兰酶与β-淀粉酶混合使用时，几乎可以全部将淀粉转化为麦芽糖。从而能够生产出80％以上的超高麦芽糖浆。在啤酒生产工艺中，添加普鲁兰酶在提高糖化效果的同时缩短了糖化时间，在干啤酒生产中应用它减少糊精含量，提高了啤酒的品质。另外，将普鲁兰酶用于直链淀粉的生产、酿造酒精、味精、抗消化淀粉、歧化环糊精、缓慢消化淀粉、高直链淀粉制造等以淀粉为原料的工业产品产业，都可以得到很高的产率，极大的提高了淀粉资源的利用率。进而为人类生活需要的食品、饮料、保健品、药品以及纺织、食品包装、及环境保护提供了优质原料。
但现有技术中的的普鲁兰酶还存在如下不足：
1.耐热性差，最适温度在60℃左右，超过60℃活力迅速下降；
2.耐酸性差，pH低于5.0不稳定；
3.酶活力低，制造成本过高；
4.价格昂贵。
发明内容
本发明的目的在于避免上述现有技术中的不足之处，而提供一株耐热、耐酸性能好，酶活力高、性能稳定而且价格较低的普鲁兰酶产品。
本发明的目的还在于提供一种发酵酶活力高、提取收率高、制造成本低的普鲁兰酶液态生物发酵生产方法。
本发明的目的可以通过如下措施来达到：
本发明的普鲁兰酶，其特征在于：
a.酶学特性
最适pH 3.8～4.4，稳定pH 3.5～4.5；最适作用温度为50℃-65℃；
b.选用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为产酶菌种，来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC编号10185)，采用底料与补料复合加料液态发酵工艺制备，达到如下工艺技术指标：
①产品酶活力：≥1100u/ml
②发酵周期72～80小时
③液体酶回收率≥86.5％。
发明人选用的地衣芽孢杆菌，其最适pH及耐热性与糖化酶比较接近，有着较好的配伍性，能更好地应用于以淀粉为原料的食品加工行业。
适合的产酶菌种与液态发酵工艺巧妙结合，产生了意想不到的技术效果，从而完成了本发明的任务。
本发明的目的还可以通过如下措施来达到：
本发明的发明人通过改变菌种发酵条件来提高酶活力，使生产的普鲁兰酶活性高，性能稳定。
下面公开一种本发明的普鲁兰酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
a.菌种培养
培养基包括如下按照重量份数计的原料组分：
①液态培养基
糯米淀粉 30
蛋白胨 5
KH2PO4 12
K2H PO4 5
MgSO4·7H2O 1
pH 7.0
②斜面培养基
糯米淀粉 1.0
蛋白胨 5
酵母膏 5
KH2PO4 4.5
MgSO4·7H2O 1
琼脂 2.0
pH 7.0
③分离培养基
红色普鲁兰糖 3
酵母膏 5
KH2PO4 4.5
MgSO4·7H2O 1
琼脂 2.0
pH 7.0
④发酵培养基
液A组分
豆饼粉 50
玉米浆 20
糯米粉 30
CaCl2 0.45
pH 7.0
液B组分
柠檬酸三钠 20
K2H PO 16
KH2PO4 4
pH 7.5
其中液A∶液B＝9∶1(体积比)，接种前混合；
菌种培养工艺条件
分离平板：34℃ 36小时；
液体种子：34℃ 24小时摇床转速200r/m；
斜面培养 34℃ 2～3天；
发酵摇瓶：34℃ 3天摇床转速200r/m；
b.种子罐扩大培养
①以重量份数计的培养基原料组分
淀粉 6
豆饼粉 5
玉米浆 2
CaCl2 0.15
柠檬酸三钠 0.2
K2H PO 1.2
KH2PO4 0.4
硫酸铵 0.4
消泡剂 0.04
pH 7.0
②灭菌工艺条件：121℃-124℃，0.11～0.12Mpa下，灭菌30分钟；
③培养工艺条件
罐压Mpa 0.05～0.08
温度℃ 34
风量m3/h 30
搅拌转速r/min 180
④移种条件：菌体染色深、粗壮，无杂菌，酶活力在10u/ml左右。
c.液态发酵生产普鲁兰酶
①包括如下按照重量份数计的原料组分：
淀粉 2
糯米粉 3
豆饼粉 5
玉米浆 2
CaCl2 0.15
柠檬酸三钠 0.2
K2H PO 1.6
KH2PO4 0.5
硫酸铵 0.4
消泡剂 0.04
pH 7.0
②液化水解
加入高温淀粉酶100重量份升温至90℃，保温30分钟；
③灭菌工艺条件
121℃～124℃，0.11～0.12Mpa下，灭菌30分钟；
④发酵工艺条件
罐压Mpa 0.05～0.08
温度℃ 34
风量m3/h 0～24小时1∶0.3
24～48小时1∶0.5
48小时～出料1∶0.6
搅拌转速r/min 180：
pH 5～6.7；
d.补料
①包括如下按照重量份数计的原料组分：
淀粉 20
糯米粉 6
CaCl2 0.15
消泡剂 0.04
pH 7.0
②液化水解
加入高温淀粉酶500重量份升温至90℃，保温30分钟；
③灭菌工艺条件
121℃～124℃，0.11～0.12Mpa下，灭菌30分钟；
④补料方法
当DO降至最低再升至35％时，开始补料，控制DO在30％-40％；
e.出料
培养72小时左右，酶活力增长缓慢，菌体开始部分自溶，即可放；
f.普鲁兰酶提取
发酵液→预处理→压滤→超滤→标准化→精滤→调配→灌装→检测→成品。
发明人发现，支链淀粉对于本发明采用的地衣芽胞杆菌产酶具有更强大的诱导作用。这是因为支链淀粉相比其它碳源具有更多的支链，对普鲁兰酶的产生具有更强的诱导作用。糯米粉结构中支链淀粉含量为100％，全部是支链淀粉，适量的糯米粉组分有利于地衣芽胞杆菌产酶。
氮源对发酵产酶有重要影响，实验表明，豆饼粉和酵母膏效果较佳，其次为牛肉膏和蛋白胨。无机氮源中硫酸铵对产酶有一定的促进作用。而硝酸铵则对酶的合成有抑制作用。
pH是微生物生长代谢的重要参数，pH对产酶活力有明显的影响。实验表明，在pH6.5±0.2发酵产酶酶活最高，而随着pH的逐渐升高或者降低，酶活则都会降低低，在pH5.5和pH8.0的时候，酶活就下降到了20％左右，而在pH 4.5和pH 9.0的时候，就基本上没有酶活力了。
此外，通风量、无机盐的组分和含量、培养温度、发酵时间等都对菌种产酶活力有重要影响。本发明的发明人对液态发酵工艺中的培养基原料组分进行了多次实验，对碳源、氮源、pH值、通风量、发酵温度、发酵周期及加料方式都进行了周密、细致、严谨的优化筛选。上述所有液态发酵工艺条件的协调配合，极大的提高了采用菌株的产酶能力。
本发明的普鲁兰酶，适用于啤酒外加酶法糖化工艺，酒精、味精、氨基酸、乳酸等以淀粉为原料的发酵工业，超高麦芽糖浆制造工业，抗消化淀粉、歧化环糊精、缓慢消化淀粉等改性淀粉产品，以及直链淀粉、高直链淀粉制造。
本发明的普鲁兰酶及其生产方法所公开的技术方案，相比现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，并能产生如下积极效果：
1提供了一种耐热、耐酸性能好，酶活力高、性能稳定而且价格较低的普鲁兰酶产品。
2.提供了一种发酵酶活力高、提取收率高、制造成本低的普鲁兰酶液态生物发酵生产方法。
3.产品用途广泛。
具体实施方式
本发明下面将结合实施例作进一步详述：
实施例1
本发明的一种普鲁兰酶的制备方法，包括如下步骤：
a.菌种培养
培养基包括如下按照重量份数计的原料组分：
①液态培养基
糯米淀粉 30
蛋白胨 5
KH2PO4 12
K2H PO4 5
MgSO4·7H2O 1
pH 7.0
②斜面培养基
糯米淀粉 1.0
蛋白胨 5
酵母膏 5
KH2PO4 4.5
MgSO4·7H2O 1
琼脂 2.0
pH 7.0
③分离培养基
红色普鲁兰糖 3
酵母膏 5
KH2PO4 4.5
MgSO4·7H2O 1
琼脂 2.0
pH 7.0
④发酵培养基
液A组分
豆饼粉 50
玉米浆 20
糯米粉 30
CaCl2 0.45
pH 7.0
液B组分
柠檬酸三钠 20
K2H PO 16
KH2PO4 4
pH 7.5
其中液A∶液B＝9∶1(体积比)，接种前混合；
菌种培养工艺条件
分离平板：34℃ 36小时；
液体种子：34℃ 24小时摇床转速200r/m；
斜面培养 34℃ 2～3天；
发酵摇瓶：34℃ 3天摇床转速200r/m；
b.种子罐扩大培养
①以重量份数计的培养基原料组分
淀粉 6
豆饼粉 5
玉米浆 2
CaCl2 0.15
柠檬酸三钠 0.2
K2H PO 1.2
KH2PO4 0.4
硫酸铵 0.4
消泡剂 0.04
pH 7.0
②灭菌工艺条件：121℃-124℃，0.11～0.12Mpa下，灭菌30分钟；
③培养工艺条件
罐压Mpa 0.05～0.08
温度℃ 34
风量m3/h 30
搅拌转速r/min 180
④移种条件：菌体染色深、粗壮，无杂菌，酶活力在10u/ml左右。
c.液态发酵生产普鲁兰酶
①包括如下按照重量份数计的原料组分：
淀粉 2
糯米粉 3
豆饼粉 5
玉米浆 2
CaCl2 0.15
柠檬酸三钠 0.2
K2H PO 1.6
KH2PO4 0.5
硫酸铵 0.4
消泡剂 0.04
pH 7.0
②液化水解
加入高温淀粉酶100重量份升温至90℃，保温30分钟；
③灭菌工艺条件
121℃～124℃，0.11～0.12Mpa下，灭菌30分钟；
④发酵工艺条件
罐压Mpa 0.05～0.08
温度℃ 34
风量m3/h 0～24小时1∶0.3
24～48小时1∶0.5
48小时～出料1∶0.6
搅拌转速r/min 180：
pH 5～6.7；
d.补料
①包括如下按照重量份数计的原料组分：
淀粉 20
糯米粉 6
CaCl2 0.15
消泡剂 0.04
pH 7.0
②液化水解
加入高温淀粉酶500重量份升温至90℃，保温30分钟；
③灭菌工艺条件：121℃～124℃，0.11～0.12Mpa下，灭菌30分钟；
④补料方法
当DO降至最低再升至35％时，开始补料，控制DO在30％-40％；
e.出料
培养72小时左右，酶活力增长缓慢，菌体开始部分自溶，即可放；
f.普鲁兰酶提取
发酵液→预处理→压滤→超滤→标准化→精滤→调配→灌装→检测→成品。
技术指标：
①产品酶活力：≥1100u/ml
②发酵周期72-80小时
③液体酶回收率≥86.5％。