双酶体系制备L叔亮氨酸类化合物的方法.pdf

本发明涉及一种基于采用生物酶制剂拆分制备手性化合物的方法，尤其是指一种双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，所述的方法为以式II所示的N-酰化叔亮氨酸类化合物在双酶体系下，于水或缓冲溶剂中15-60℃下反应制备式III所示手性L-叔亮氨酸类化合物，所述生物酶为酰化氨基酸消旋酶(丙氨酸消旋酶)和水解酶的混合酶，其制备反应方程式为：其中，X＝OH，NH2，NR1R2，OR3(其中R1，R2，R3＝C1～C5直链，支链，一、二或者三卤素取代的烷烃)的任一基团。本发明能在室温下进行，并且操作简单，无污染，能显著降低生产成本。

1.  一种双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，其特征在于：所述的方法为以式I所示的N-酰化叔亮氨酸类化合物在双酶体系下，于水或缓冲溶剂中反应制备式II所示的手性L-叔亮氨酸类化合物，所述生物酶为酰化氨基酸消旋酶和水解酶的混合酶，其制备反应方程式为：

其中，X＝OH，NH₂，NR₁R₂，OR₃(其中R₁，R₂，R₃＝C₁～C₅直链，支链，一、二或者三卤素取代的烷烃)的任一基团。

2.  根据权利要求1所述的双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，其特征在于：所述的酰化氨基酸消旋酶为丙氨酸消旋酶Alanine racemasefrom Pseudomonas putida KT2440；所述水解酶为脂肪酶或酯酶，其中脂肪酶为：Lipase from Thermomyces lanuginosus，Lipase B from Candidaantarctica，Lipase from Candide Rugosa，Lipase PS“Amano”SD，LipaseAS“Amano”，Lipase AK“Amano”，Lipase AYS“Amano”的一种或多种；酯酶为：Esterase from Escherichia coli.K12的一种或多种。

3.  根据权利要求1或2所述的双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，其特征在于：所述式I化合物与混合酶的质量之比为1∶0.005～0.1。

4.  根据权利要求1或2所述的双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，其特征在于：所述缓冲溶剂为Tris盐酸缓冲液、PBS磷酸缓冲溶液或者混合溶液，所述混合溶液为叔丁醇、乙醇、甲醇、丙酮或丁酮与水、Tris盐酸缓冲液、PBS磷酸缓冲溶液任一种的混合液，体积比为1∶20-1∶2。

5.  根据权利要求1或2所述的双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，其特征在于：所述反应温度为15-60℃，控制反应温度波动幅度为±5℃；所述反应的反应时间为2-15小时。

6.  根据权利要求1或2所述的双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，其特征在于：所述反应是以TLC小板跟踪监测反应，展开剂是乙酸乙酯与石油醚体积比为1～2∶5的混合试剂；通过监测反应中新产生的点的浓度和剩下的点的浓度来判断反应终点。

7.  根据权利要求1或2所述的双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，其特征在于：所述反应用液相监测反应进度，通过监测液相色谱中式II化合物的形成和式I化合物的消失来判断反应终点。

8.  根据权利要求1或2所述的双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，其特征在于：所述反应完毕后，用有机溶剂萃取产物，所使用的有机溶剂为：乙醚、甲苯、氯苯、乙酸乙酯，异丙醚，正己烷，甲酸乙酯，环己烷之中的任一种。并且溶剂经简单处理后可以重复套用。

9.  根据权利要求1或2所述的双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，其特征在于：所述反应体系中所使用的混合酶为酰化氨基酸消旋酶与水解酶的质量之比为：1∶3-2∶1；反应完毕后，将缓冲溶液的pH值调节到前相同值，酶体系可重复使用。

10.  根据权利要求1或2所述的双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，其特征在于：所述反应的是按照以下步骤进行：
a.将化合物I投放到水溶液中，然后加入助溶剂。再加入按照一定比例组成双酶制剂。于摇床中或者动力搅拌装置中充分搅拌反应。
b.按照化合物I：酶制剂，质量之比为1∶0.005～0.1进行投料。
c.控制温度于15～60℃进行反应，期间用TLC硅胶板或液相色谱进行跟踪监测，直至反应基本进行完毕；反应完毕，用有机溶剂萃取反应液。然后减压除去有机溶剂，即可得到粗化合物II。
d.将反应溶液调节pH值于一定的值，可重复利用该反应溶液。

双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法
技术领域
本发明涉及一种基于采用生物酶制剂拆分制备手性化合物的方法，尤其是指一种双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法。
背景技术
L-叔亮氨酸(III)主要用作营养强化剂、动物饲用添加剂，合成药物。作为合成药物中间体主要用于合成抗艾滋病(HIV)药物阿扎那韦(Atazanavir)和山德士(Sandoz)，以及一些抗癌药物、生物抑制剂及生物活性肽等。

抗HIV作用的蛋白酶抑制剂阿扎那韦是目前世界上主要的抗艾滋病药物，仅在美国就已有约13万名患者接受这种药物的治疗，该药物的有效成分--“C-末端中间体”是合成强效的蛋白酶抑制剂阿扎那韦的重要中间体，具有持续强效抑制艾滋病病毒、低耐药、用药方便、对脂肪代谢副作用小的特点，2006年全球销售额达到32.26亿美元。
阿扎那韦药品目前仍属于专利保护药品，专利由施贵宝公司掌握，只授权少数几家制药公司生产。根据L-叔亮氨酸用于生产阿扎那韦的用量估计，预计今后几年医药行业对该中间体的需求将迅速增加，阿扎那韦的专利将于2011年到期，届时随着药品专利的失效，仿制药生产厂家将大量出现，对L-叔亮氨酸的需求也将成倍增长。目前每年国内外市场对L-叔亮氨酸的需求量为10-15吨，预计5年后可增加至百吨。该产品今年预计可实现销售收入1.3亿元，实现利税2400-3600万元。预计2011年将实现销售收入3.2亿元，利税约0.9亿元。
目前国内外生产L-叔亮氨酸的生产方法主要有：
(1)以3，3-二甲基丁酸利用类似Leuckart反应合成消旋产物，再用S-苯乙胺拆分得到(R)和(S)-叔完氨酸，收率较低(23％)，e.e.值为95％(TetrahedronLett.1997，38，2153-2154)。(2)由光学活性的(R)-叔丁基甘氨醇出发，经过氨基保护、氧化、氢化脱保护，得到L-叔亮氨酸.收率可达到64％，e.e.值大于99％(Pat.Appl，DE 19524338.2)。(3)在催化剂邻羟苯亚甲基亚胺衍生物非金属催化剂的存在下，HCN对亚胺的加成，得到的加成化合物，收率为88％，e.e.值为96％，重结晶后(e.e.值大于99％)，再经过水解、脱甲酰化制得L-叔亮氨酸，收率可达84％，e.e.值大于99％(Org，Lett.2000，2(6)，867-870)。通过不对称合成方法可以得到好的光学产率，但因所用的催化剂价格昂贵，不适合大规模生产。(4)在BuOH存在下，脂肪酶(Lipase)选择性催化水解4-叔丁基-2-苯基吖内酯，生成的酯，先用蛋白酶(Alcalase)水解，以防逆反应发生，再用酸水解断键，得到L-叔亮氨酸，收率为69％，e.e.值为97％(Tetrahedron Lett.1995，7，1113-1116)。(5)用HCOONH4作为NAD+的还原剂，在甲酯脱氢酶不可逆的氧化作用下，使NAD+转变成NADH继续循环使用冈，并且生成CO2，得到L-叔亮氨酸的收率为85％，e.e值为99％(Meth.Enzymol，1988，136，34-45)。
目前德国Degussa公司采用生产工艺(5)，得到e.e.值达99％的L-叔亮氨酸，该工艺成熟，反映条件温和。但是所使用的辅酶价格较贵，并且不易保存和回收，比较容易失活。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供一种基于采用生物酶制剂的双酶体系动力学拆分N-酰化叔亮氨酸类化合物制备手性化合物L-叔亮氨酸类化合物的方法。该方法反应条件温和、收率高、环境友好、成本低。
一种双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，所述的方法为以式II所示的N-酰化叔亮氨酸类化合物在双酶体系下，于水或缓冲溶剂中15-60℃下反应制备式III所示手性L-叔亮氨酸类化合物，所述生物酶为酰化氨基酸消旋酶(丙氨酸消旋酶)和水解酶的混合酶，其制备反应方程式为：

其中，X＝OH，NH₂，NR₁R₂，OR₃(其中R₁，R₂，R₃＝C₁～C₅直链，支链，一、二或者三卤素取代的烷烃)的任一基团。
所述水解酶为脂肪酶或酯酶。其中脂肪酶为：Lipase from Thermomyceslanuginosus，Lipase B from Candida antarctica，Lipase from Candide Rugosa(CRL)，Lipase PS“Amano”SD，Lipase AS“Amano”，Lipase AK“Amano”，LipaseAYS“Amano”的一种或多种；酯酶为Esterase from Escherichia coli.K12(esterasefrom locus tag b3412)的一种或多种；所述的酰化氨基酸消旋酶为Alanineracemase from Pseudomonas putida KT2440(rascemase from locus tagNC002947)。
进一步的，所述式I化合物与混合酶的质量之比为1∶0.005～0.1。
进一步的，所述缓冲溶剂为Tris盐酸缓冲液、PBS磷酸缓冲溶液或者混合溶液，所述混合溶液为叔丁醇、乙醇、甲醇、丙酮或丁酮与水、Tris盐酸缓冲液、PBS磷酸缓冲溶液任一种的混合液，体积比为1∶20-1∶2。
进一步的，所述反应温度为15-60℃，控制反应温度波动幅度为±5℃；所述反应的反应时间为2-15小时。
进一步的，所述反应是以TLC小板跟踪监测反应，展开剂是乙酸乙酯与石油醚体积比为1～2∶5的混合试剂；通过监测反应中新产生的点的浓度和剩下的点的浓度来判断反应终点。
进一步的，所述反应用液相监测反应进度，通过监测液相色谱中式II化合物的形成和式I化合物的消失来判断反应终点。
进一步的，所述反应完毕后，用有机溶剂萃取产物，所使用的有机溶剂为：乙醚、甲苯、氯苯、乙酸乙酯，异丙醚，正己烷，甲酸乙酯，环己烷之中的任一种。并且溶剂经简单处理后可以重复套用。
进一步的，所述反应体系中所使用的混合酶为消旋酶与酯(脂肪)酶的质量之比为：1∶3-2∶1；反应完毕后，将缓冲溶液的pH值调节到前相同值，酶体系可重复使用。
进一步的，所述反应的是按照以下步骤进行：
a.将化合物(I)投放到水溶液中，然后加入助溶剂。再加入按照一定比例组成双酶制剂。于摇床中或者动力搅拌装置中充分搅拌反应。
b.按照化合物(I)：混合酶制剂，质量之比为1∶0.0001-1∶1进行投料。
c.控制温度于15～60℃进行反应，期间用TLC硅胶板或液相色谱进行跟踪监测，直至反应基本进行完毕；反应完毕，用有机溶剂萃取反应液。然后减压除去有机溶剂，即可得到粗化合物(II)。
d.将反应溶液调节pH值于一定的值，可重复利用该反应溶液。
本发明利用双酶体系进行动力学拆分叔亮氨酸得到单一手性L-叔亮氨酸的生产工艺，理论收率是100％，即消旋叔亮氨酸可完全转化为目标产物。该工业能在室温下进行，并且操作简单，无污染，能显著降低生产成本。该生产方法革除了原有工艺中使用有毒，有污染性的化学原料。基本无污染。通过酶工程技术可以改造酶制剂，使之能更加适合对特定底物的拆分。从而达到预计目标。具有良好的技术应用和产业化前景。
具体实施方式
以下具体实例来说明本发明的技术方案，但保护的范围并不仅限于此。
本专利所涉及到的脂肪酶购于天野酶制品公司(Amano Enzyme Inc.China)，酯酶和酰化氨基酸消旋酶由本申请单位实验室制备。其余反应物及试剂均为市场购买所得。如未加特别说明，该方法所使用的生物酶均为游离酶粉末。
实施例1
将20mL PBS磷酸缓冲溶液(5mM，Ph＝8.5)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料(I)(此处X＝NH₂)3.44g加入到锥形瓶中。继续加入消旋酶Alanineracemase from Pseudomonas putida KT2440(rascemase from locus tag NC002947)和CRL共0.13g(二者质量之比为2∶1)，加入完毕，将温度固定在35℃，摇床中反应12小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。反应完毕后，加入20mL乙酸乙酯萃取，然后将溶剂减压出去，即可得到白色固体L-2-氨基-3，3-二甲基丁酰胺。
L-2-氨基-3，3-二甲基丁酰胺，收率74％，纯度98％，e.e.值96％。
L-2-氨基-3，3-二甲基丁酰胺：[α]_D²⁰，+6.4(c＝5％in 5M HCl)；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ1.03(9H)，3.24(S，1H)，5.40(S，2H)，6.98(S，2H).¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ29.6，40.3，81.0，170.3.
实施例2
将20mL PBS磷酸缓冲溶液(5mM，Ph＝8.5)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料(I)(此处X＝NH₂)3.44g加入到锥形瓶中。加入2mL甲醇后继续加入Alanine racemase from Pseudomonas putida KT2440(rascemase from locustag NC002947)和CRL共0.3g(二者质量之比为2∶1)，加入完毕，将温度固定在35℃，摇床中反应10小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。反应完毕后，加入20mL乙酸乙酯萃取，然后将溶剂减压出去，即可得到白色固体L-2-氨基-3，3-二甲基丁酰胺。
L-2-氨基-3，3-二甲基丁酰胺，收率79％，纯度98％，e.e.值98％。
实施例3
将20mL PBS磷酸缓冲溶液(10mM，pH＝9.0)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料(I)(此处X＝NH₂)3.44g加入到锥形瓶中。继续加入Alanineracemase from Pseudomonas putida KT2440(rascemase from locus tag NC002947)和CRL共0.5g(二者质量之比为1∶1)，加入完毕，将温度固定在40℃，摇床中反应8小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。反应完毕后，加入20mL乙酸乙酯萃取，然后将溶剂减压出去，即可得到白色固体L-2-氨基-3，3-二甲基丁酰胺。
L-2-氨基-3，3-二甲基丁酰胺，收率69％，纯度92％，e.e.值94％。
实施例4
将20mL普通水(pH＝8.5)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料(I)(此处X＝NH₂)3.44g加入到锥形瓶中。再加入叔丁醇3mL后继续加入Alanineracemase from Pseudomonas putida KT2440(rascemase from locus tag NC002947)和CRL共0.2g(二者质量之比为1∶2)，加入完毕，将温度固定在25℃，摇床中反应8小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。反应完毕后，加入20mL乙酸乙酯萃取，取有机相然后将溶剂减压除去，即可得到白色固体L-2-氨基-3，3-二甲基丁酰胺。
L-2-氨基-3，3-二甲基丁酰胺，收率73％，纯度95％，e.e.值94％。
实施例5
将20mL PBS磷酸缓冲溶液(5mM，pH＝9.0)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料(I)(此处X＝OH)3.44g加入到锥形瓶中。再加入叔丁醇2mL后继续加入Alanine racemase from Pseudomonas putida KT2440(rascemase fromlocus tag NC002947)和CRL共0.5g(二者质量之比为1∶3)，加入完毕，将温度固定在35℃，摇床中反应10小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。反应完毕后，加入20mL乙酸乙酯萃取，取有机相然后将溶剂减压除去，即可得到白色固体L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率83％，纯度95％，e.e.值97％。
L-叔亮氨酸：：[α]_D²⁰，+7.3(c＝5％in 5M HCl)；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ0.97(9H)，3.41(S，1H)，5.18(S，2H)，10.91(S，1H).¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ26.3，39.1，76.0，176.5.
实施例6
将20mL PBS磷酸缓冲溶液(5mM，pH＝8.5)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料(I)(此处X＝OH)3.44g加入到锥形瓶中。再加入叔丁醇3mL后继续加入生物酶Alanine racemase from Pseudomonas putida KT2440(rascemasefrom locus tag NC002947)和Lipase AS“Amano”共0.4g(二者质量之比为1∶1)，加入完毕，将温度固定在35℃，摇床中反应10小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。
其他操作如同实施例6纯化处理得到白色固体L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率89％，纯度97％，e.e.值98％。
实施例7
将20mLPBS缓冲溶液(5mM，pH＝8.0)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料(I)(此处X＝OH)3.44g加入到锥形瓶中。再加入乙醇3mL后继续加入生物酶Alanine racemase from Pseudomonas putida KT2440(rascemase fromlocus tag NC002947)和Lipase PS“Amano”共0.5g(二者质量之比为1∶1)，加入完毕，将温度固定在35℃，摇床中反应7小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。
其他操作如同实施例6纯化处理得到白色固体L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率82％，纯度97％，e.e.值99％。
实施例8
将20mL PBS磷酸缓冲溶液(10mM，pH＝10.0)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料(I)(此处X＝OH)3.44g加入到锥形瓶中。再加入丙酮2mL后继续加入生物酶Alanine racemase from Pseudomonas putida KT2440和LipasePS“Amano”共0.5g(二者质量之比为1∶3)，加入完毕，将温度固定在35℃，摇床中反应9小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。
其他操作如同实施例6纯化处理得到白色固体L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率85％，纯度97％，e.e.值99％。
实施例9
将20mL Tris盐酸缓冲液(10mM，pH＝8.0)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料(I)(此处X＝OH)3.44g加入到锥形瓶中。再加入丙酮2mL后继续加入Alanine racemase from Pseudomonas putida KT2440和Lipase AYS“Amano”共0.5g(二者质量之比为1∶2)，加入完毕，将温度固定在35℃，摇床中反应6小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。
其他操作如同实施例6纯化处理得到白色固体L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率44％，纯度97％，e.e.值95％。
实施例10
将20mL Tris盐酸缓冲液(10mM，pH＝8.0)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料(I)(此处X＝OH)3.44g加入到锥形瓶中。再加入丙酮2mL后继续加入生物酶Lipase AYS“Amano”，加入完毕，将温度固定在30℃，摇床中反应8小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。
其他操作如同实施例6纯化处理得到白色固体L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率92％，纯度97％，e.e.值94％。
实施例11
将20mL20mLTris盐酸缓冲液(10mM，pH＝10.0)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料(I)(此处X＝OH)3.44g加入到锥形瓶中。再加入丙酮2mL后继续加入生物酶Alanine racemase from Pseudomonas putida KT2440和Esterase from Escherichia coli.K12共0.1g(二者质量之比为1∶1)，加入完毕，将温度固定在45℃，摇床中反应8小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。
其他操作如同实施例6纯化处理得到白色固体L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率82％，纯度97％，e.e.值96％。
实施例12
将20mL20mL Tris盐酸缓冲液(10mM，pH＝10.0)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料(I)(此处X＝OH)3.44g加入到锥形瓶中。再加入丁酮2mL后继续加入生物酶Alanine racemase from Pseudomonas putida KT2440和LipaseB from Candida antarctica共0.1g(二者质量之比为1∶3)，加入完毕，将温度固定在40℃，摇床中反应8小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。
其他操作如同实施例6纯化处理得到白色固体L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率70％，纯度97％，e.e.值99％。
序列表
<110>浙江大学
<120>双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1230
<212>PRT
<213>Pseudomonas putida
<400>1
Thr Cys Ala Gly Thr Cys Gly Ala Cys Gly Ala Gly Thr Ala Thr Cys
1                 5                      10                     15
Thr Thr Cys Gly Gly Gly Thr Thr Gly Gly Ala Ala Thr Thr Gly Cys
             20                      25                      30
Cys Cys Cys Ala Thr Ala Cys Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys Ala Ala
         35                     40                     45
Ala Thr Cys Gly Gly Cys Gly Ala Gly Cys Ala Ala Cys Gly Cys Gly
     50                    55                     60
Cys Cys Gly Thr Thr Gly Ala Thr Thr Thr Cys Thr Thr Cys Cys Ala
65                    70                      75                    80
Thr Cys Thr Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Thr Gly Ala Thr
                  85                     90                    95
Thr Thr Cys Gly Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly Cys
             100                    105                   110
Thr Thr Gly Cys Cys Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys Ala
         115                    120                    125
Cys Thr Thr Cys Gly Thr Thr Ala Cys Cys Cys Cys Cys Cys Thr Thr
    130                     135                      140
Cys Ala Cys Ala Thr Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Gly Thr Cys Gly
145                    150                    155                   160
Gly Thr Gly Ala Cys Ala Thr Cys Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala
                  165                    170                     175
Gly Cys Gly Thr Gly Thr Thr Cys Ala Thr Cys Gly Ala Cys Ala Cys
             180                     185                    190
Cys Thr Thr Gly Cys Cys Cys Ala Cys Gly Ala Cys Cys Gly Gly Cys
         195                    200                   205
Ala Cys Ala Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys Cys Gly Thr Thr GlyA la
    210                   215                     220
Thr Cys Ala Gly Cys Ala Cys Ala Thr Gly Gly Cys Cys Cys Thr Thr
225                    230                    235                  240
Gly Thr Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Thr Ala Cys Cys Cys Gly Gly
                  245                     250                   255
Cys Gly Gly Thr Ala Gly Cys Cys Ala Thr Cys Gly Gly Ala Gly Thr
             260                    265                     270
Ala Cys Cys Cys Gly Ala Cys Cys Gly Thr Ala Ala Thr Gly Thr Thr
         275                   280                     285
Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Gly Cys Gly Ala Ala Thr Cys Ala
    290                    295                    300
Cys Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly
305                   310                     315                   320
Thr Gly Cys Gly Gly Thr Cys Ala Thr Ala Gly Cys Cys Cys Ala Cys
                 325                     330                   335
Gly Gly Thr Gly Thr Thr Gly Cys Cys Gly Gly Cys Cys Gly Gly Ala
             340                    345                    350
Thr Ala Gly Cys Thr Gly Thr Gly Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Gly
         355                    360                   365
Cys Cys Ala Cys Gly Thr Gly Cys Gly Ala Thr Thr Thr Gly Ala Ala
     370                   375                    380
Cys Thr Gly Cys Ala Thr Cys Gly Cys Ala Cys Gly Thr Thr Thr Gly
385                   390                    395                   400
Thr Ala Cys Thr Cys Gly Gly Thr Gly Cys Gly Cys Gly Cys Cys Gly
                  405                    410                   415
Gly Cys Ala Cys Gly Gly Thr Gly Thr Cys Gly Cys Cys Gly Ala Ala
             420                     425                    430
Cys Ala Gly Cys Gly Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Cys Gly Thr Thr
         435                    440                   445
Cys Gly Thr Ala Cys Cys Ala Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Gly Cys
    450                    455                    460
Gly Cys Gly Cys Thr Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys Thr Thr Cys
465                   470                    475                  480
Cys Ala Gly Cys Gly Thr Ala Gly Cys Gly Ala Ala Cys Gly Ala Gly
                 485                     490                    495
Thr Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys Ala Gly Gly Gly
             500                    505                     510
Thr Gly Ala Gly Cys Thr Thr Gly Cys Thr Gly Cys Gly Gly Thr Cys
         515                    520                   525
Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys Thr Thr Gly
    530                       535                 540
Ala Thr Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Thr Cys Gly Gly Thr Cys Thr
545                    550                    555                  560
Gly Cys Thr Cys Gly Thr Thr Gly Ala Ala Thr Gly Cys Cys Gly Cys
                  565                    570                    575
Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Thr Thr Gly Cys Gly Thr Ala Cys Ala
              580                   585                     590
Thr Cys Gly Thr Cys Cys Thr Thr Gly Thr Cys Thr Thr Cys Cys Ala
         595                    600                    605
Cys Gly Gly Cys Gly Ala Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys Ala Thr
    610                     615                   620
Cys Ala Gly Cys Gly Cys Gly Ala Cys Cys Ala Gly Cys Thr Thr Gly
625                   630                    635                      640
Ala Gly Gly Thr Gly Cys Thr Thr Cys Thr Gly Gly Thr Cys Gly Gly
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Thr Gly Ala Thr Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Gly Cys Thr Thr Cys
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Gly Cys Cys Ala Cys Gly Gly Cys Cys Gly Gly Ala Cys Cys Ala Gly
         675                    680                   685
Gly Thr Gly Gly Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Cys
    690                    695                    700
Cys Gly Thr Thr Gly Cys Gly Gly Cys Thr Cys Ala Thr Gly Cys Cys
705                   710                    715                   720
Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Thr Gly Ala Gly Cys Gly Cys Cys
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Ala Thr Gly Thr Gly Ala Ala Thr Gly Cys Gly Cys Ala Ala Gly Gly
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Thr Cys Thr Thr Gly Cys Cys Ala Thr Gly Gly Cys Gly Cys Gly Cys
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Gly Gly Cys Gly Ala Thr Gly Gly Cys Ala Thr Cys Gly Gly Cys Cys
    770                       775                 780
Thr Gly Gly Cys Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ala Thr Thr Cys Cys Gly
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Cys Gly Cys Thr Gly Cys Cys Cys Ala Cys Cys Ala Gly Cys Thr Cys
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Thr Thr Cys Cys Ala Thr Gly Thr Cys Gly Thr Ala Cys Thr Gly Cys
              820                   825                    830
Ala Ala Gly Cys Cys Ala Thr Cys Thr Thr Cys Cys Ala Gly Cys Thr
         835                    840                   845
Cys Gly Cys Thr Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala Gly
    850                    855                    860
Gly Cys Gly Thr Ala Cys Cys Cys Gly Cys Ala Cys Cys Ala Gly Thr
865                   870                    875                  880
Thr Gly Cys Cys Cys Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gly Cys Cys Ala Cys
                 885                     890                    895
Thr Gly Gly Cys Gly Cys Gly GlyAla Cys Cys Ala Cys Gly Cys Gly
             900                   905                    910
Gly Gly Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Gly Thr Thr Gly Cys Thr Gly
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Gly Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Gly Cys Ala Gly Gly
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Gly Cys Ala Cys Gly Cys Cys Thr Thr Gly Gly Gly Cys Gly Ala Thr
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Gly Ala Thr Cys Gly Ala Thr Gly Gly Cys Ala Thr Thr Ala Cys Cys
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Ala Gly Gly Cys Cys Gly Ala Thr Ala Cys Cys Gly Thr Gly Gly Cys
             980                     985                    990
Cys Ala Thr Ala Gly Gly Cys Ala  Thr Cys Gly Gly Cys  Cys Thr Thr
         995                    1000                  1005
Gly Ala  Gly Cys Ala Cys Gly  Gly Cys Gly Cys Ala  Cys Ala Gly
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Cys Thr  Thr Gly Gly Ala Cys  Thr Thr Gly Cys Cys  Gly Gly Cys
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Cys Ala  Gly Cys Thr Cys Gly  Gly Cys Cys Thr Gly  Cys Ala Gly
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Cys Gly  Thr Gly Cys Gly Gly  Ala Thr Gly Thr Thr  Gly Thr Gly
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Cys Thr  Gly Cys Ala Gly Gly  Gly Cys Gly Cys Thr  Gly Gly Cys
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Gly Cys  Thr Gly Ala Cys Thr  Thr Cys Gly Ala Cys  Cys Cys Ala
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Gly Gly  Cys Ala Thr Thr Gly  Cys Thr Gly Thr Thr  Thr Thr Gly
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Cys Ala  Cys Gly Gly Thr Cys  Ala Gly Gly Gly Thr  Gly Thr Thr
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Gly Gly  Thr Gly Cys Cys Gly  Thr Thr Gly Thr Cys  Cys Ala Thr
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Cys Gly  Ala Cys Ala Ala Cys  Gly Gly Thr Gly Gly  Thr Gly Cys
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Cys Gly  Cys Ala Thr Ala Cys  Ala Gly Gly Gly Gly  Gly Gly Cys
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Cys Thr  Gly Thr Cys Cys Gly  Gly Thr Gly Ala Thr  Cys Ala Gly
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Ala Ala  Gly Thr Gly Cys Cys  Ala Gly Gly Gly Ala  Thr Gly Cys
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Ala Gly  Cys Cys Ala Gly Ala  Ala Gly Gly Gly Thr  Ala Cys Gly
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Gly Cys  GlyAlaAlaAla Gly  Gly Gly Cys Ala Thr
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<210>2
<211>771
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>2
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ggatggggac tgaatgccga agtgtggcgt tgcattgacg aggaacttag ctcgcatttt    120
acgctgcacc ttgttgacct gcccggcttc gggcgtagcc ggggatttgg tgcgctgtca    180
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gcgctggtca ccgtggcgtc gtcaccttgt tttagtgctc gtgacgagtg gccggggata    360
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