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1、10申请公布号CN102080128A43申请公布日20110601CN102080128ACN102080128A21申请号201010562955822申请日20101129C12Q1/6820060171申请人山东农业大学地址271018山东省泰安市岱宗大街61号72发明人白吉刚林荣呈代爱华李倩张静54发明名称甲基化敏感扩增多态性技术在转基因植物毒性分析的应用57摘要本发明涉及甲基化敏感扩增多态性技术在转基因植物毒性分析的应用，具体提供了一种转基因植物非预期毒性的分析预测方法，其检测方法为1、获得转基因植株甲基化敏感多态性差异片段；2、转基因植株甲基化差异DNA片段的回收、克隆及测序；3。
2、、利用转基因植株甲基化差异DNA片段分析转基因植株的非预期毒性。本发明将甲基化敏感扩增多态性技术用于分析转基因植物的非预期毒性，建立了分析转基因植株中是否具有非预期毒性的技术体系，有助于转基因植株的监测和推广应用，具有重要的经济效益和社会效益。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书4页附图1页CN102080131A1/2页21一种转基因植物非预期毒性的分析方法，其特征在于包括以下步骤1转基因植株甲基化敏感多态性差异片段的获得11转基因植株基因组DNA的提取在相同栽培条件下，培养转基因植株以及野生型受体，采用传统的CTAB法分别提取其基因组DNA；1。
3、2转基因植株基因组DNA的酶切及连接合成以下引物序列ECORI接头15CTCGTAGACTGCGTACC3；ECORI接头25AATTGGTACGCAGTC3；MSPI/HPAII接头15GATCATGAGTCCTGCT3；MSPI/HPAII接头25CGAGCAGGACTCATGA3；将ECORI接头1与ECORI接头2用蒸馏水溶解并混匀后，置于955MIN，然后在室温冷却，制得5PMOLECORI接头；将MSPI/HPAII接头1与MSPI/HPAII接头2用蒸馏水溶解并混匀后，置于955MIN，然后在室温冷却，制得50PMOLMSPI/HPAII接头；选取两个对甲基化敏感的同位酶HPAI。
4、I/MSPI分别与限制性内切酶ECORI进行组合，对转基因植株以及野生型植株的基因组DNA在37双酶切6H；25L酶切体系包括1BUFFER，1G基因组DNA，1UECORI，1UHPAII/MSPI；把基因组DNA的酶切片段与10L连接混合物混匀后，在16连接过夜，然后在65保温15MIN终止反应；10L连接混合物包括5PMOLECORI接头，50PMOLHPAII/MSPI接头，1UT4DNALIGASE，1BUFFERFORT4DNALIGASE；13预扩增分别以转基因植株以及野生型植株基因组DNA的酶切连接产物为模板，利用ECORI预扩增引物5GACTGCGTACCAATTCA3和HP。
5、AII/MSPI预扩增引物5ATCATGAGTCCTGCTCGG3进行预扩增；25L反应体系包括1PCRBUFFER，04MMDNTP，12MMMGCL2，2L酶切连接产物，50NGECORI预扩增引物，50NGHPAII/MSPI预扩增引物，1UTAQ聚合酶；预扩增条件为94变性2MIN后，按以下参数扩增30轮循环9430SEC，5630SEC，7260SEC，最后在72延伸10MIN；用TEBUFFER按110的比例稀释预扩增产物；14选择性PCR扩增以稀释的预扩增产物为模板，利用ECORI选择性扩增引物在序列5GACTGCGTACCAATTCA3的3端增加23个碱基和HPAII/MSPI。
6、选择性扩增引物在序列5ATCATGAGTCCTGCTCGG3的3端增加24个碱基进行选择性PCR扩增；25L反应体系包括1PCRBUFFER，04MMDNTP，12MMMGCL2，4L预扩增产物，50NGECORI选择性扩增引物，50NGHPAII/MSPI选择性扩增引物，1UTAQ聚合酶；按下列参数进行PCR循环在94变性2MIN后，按以下参数先扩增13轮循环9430SEC，6530SEC，每轮循环温度递减07，7260SEC；最后按下列参数扩增23轮循环9430SEC，5530SEC，7260SEC；15变性聚丙烯酰胺凝胶电泳使用BIORAD公司的测序电泳装置SEQUIGENGT，对选择性。
7、PCR扩增产物进行变性聚权利要求书CN102080128ACN102080131A2/2页3丙烯酰胺凝胶电泳；上样6L，恒功率70W电泳3H；电泳结束后，进行银染；对酶切片段进行MSAP分析能够反应酶切位点的甲基化状态及程度，将ECORIHPAII和ECORIMSPI酶切产物的扩增条带划分为4种类型类型I，ECORIHPAII和ECORIMSPI两条泳道均有带，无甲基化发生；类型II，ECORIHPAII泳道有带而ECORIMSPI泳道无带，单链DNA外部甲基化；类型III，ECORIHPAII泳道无带而ECORIMSPI泳道有带，双链DNA内部甲基化；类型IV，ECORIHPAII和ECOR。
8、IMSPI两条泳道均无带，双链DNA的外部甲基化；比较转基因植株以及野生型植株ECORIHPAII和ECORIMSPI双泳道的带型，重点分析转基因植株中无甲基化、野生型植株中甲基化的DNA差异片段，用一次性手术刀片从聚丙烯酰胺凝胶挖取转基因植株甲基化敏感多态性差异片段；2转基因植株甲基化差异DNA片段的回收、克隆及测序21甲基化差异DNA片段的回收将挖取的转基因植株甲基化敏感多态性差异片段置于30L双蒸水中，煮沸5MIN；缓慢降至室温后离心，收集上清液；取4L上清液为模板进行PCR扩增，PCR反应条件与预扩增PCR反应一致；按照上海生工生物工程技术服务有限公司DNA回收纯化试剂盒说明书对PCR。
9、产物回收纯化；22甲基化差异DNA片段的克隆按照上海生工生物工程技术服务有限公司连接试剂盒说明书，将回收纯化的PCR产物连接到PUCMT载体，转化大肠杆菌菌株DH5；23甲基化差异DNA片段的测序3转基因植株非预期毒性的分析31打开KEGG数据库，输入转基因植株中无甲基化、而野生型植株中甲基化的DNA序列，分析该序列所涉及的代谢途径是否与毒性物质的合成有关；若序列所涉及的代谢途径与毒性物质的合成有关，说明转基因植株可能具有非预期毒性；32SOUTHERN杂交验证采用传统的CTAB法，分别提取转基因植株、野生型植株基因组DNA；若转基因植株甲基化差异DNA片段的序列所涉及的代谢途径与毒性物质的合。
10、成有关，将该序列按照ROCHE公司地高辛标记与检测试剂盒说明书标记成探针后，分别与转基因植株、野生型植株基因组DNA进行杂交；若杂交结果呈阳性，说明转基因植株甲基化差异DNA片段是PCR扩增的特异性产物，转基因植株具有非预期毒性。权利要求书CN102080128ACN102080131A1/4页4甲基化敏感扩增多态性技术在转基因植物毒性分析的应用一技术领域0001本发明将甲基化敏感扩增多态性技术用于分析转基因植物的非预期毒性，属于分子生物学和生物技术领域。二背景技术0002新一代转基因植物中常导入多个外源基因，为复合性状转基因植物。外源基因之间、外源基因与野生型受体植物内源基因之间可能存在互作。
11、，使一些在野生型受体植株中甲基化的DNA序列在新一代转基因植株中去甲基化，进而使这些DNA序列中的基因在新一代转基因植株中表达，使新一代转基因植物中出现非预期的毒性，所以有必要建立转基因植物非预期毒性的分析预测方法。甲基化敏感扩增片多态性技术是在1995年ZABEAU等发明的扩增片段长度多态性技术基础上改进的。自1999年该技术被XIONG等证明是一种可靠的检测植物DNA甲基化方法以来，甲基化敏感扩增多态性技术已被广泛用于水稻、棉花等多种植物的研究。但是，目前国内外尚未将甲基化敏感扩增多态性技术用于分析转基因植物是否具有非预期毒性。0003本发明人将甲基化敏感扩增多态性技术用于分析转基因植物的。
12、非预期毒性，建立了分析转基因植株中是否具有非预期毒性的技术体系，有助于转基因植物的监测和推广应用，具有重要的经济效益和社会效益。三发明内容0004本发明涉及甲基化敏感扩增多态性技术在转基因植物毒性分析的应用，具体提供了一种转基因植物非预期毒性的分析预测方法，该方法包括以下步骤00051、获得转基因植株甲基化敏感多态性差异片段0006分别提取转基因植株以及野生型受体的基因组DNA。对基因组DNA进行酶切并连接接头后，进行预扩增。以预扩增产物为模板，进行选择性PCR扩增，并对选择性PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在变性聚丙烯酰胺凝胶上挖取转基因植株的甲基化差异DNA片段。00072、转基因植。
13、株甲基化差异DNA片段的回收、克隆及测序00083、利用转基因植株甲基化差异DNA片段分析转基因植株的非预期毒性0009根据测序结果，利用KEGG数据库分析这些差异片段所涉及的代谢途径，分析转基因植株中是否具有非预期毒性。0010根据上述技术体系，提取转基因植株以及野生型受体的基因组DNA后，能够分析转基因植株中是否具有非预期毒性，有助于转基因植株的监测和推广应用，具有重要的经济效益和社会效益。四附图说明0011图1是转基因植株甲基化敏感多态性片段在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离后拍摄说明书CN102080128ACN102080131A2/4页5的部分图片0012H1代表转基因植株基因组DNA经E。
14、CORIHPAII双酶切后获得的部分甲基化敏感多态性片段，0013M1代表转基因植株基因组DNA经ECORIMSPI双酶切后获得的部分甲基化敏感多态性片段，0014H2代表非转基因植株基因组DNA经ECORIHPAII双酶切后获得的部分甲基化敏感多态性片段，0015M2代表非转基因植株基因组DNA经ECORIMSPI双酶切后获得的部分甲基化敏感多态性片段，0016箭头所指为部分甲基化敏感多态性差异片段，0017S4、S6、S7、S12、S13、S15、S17、S23为部分甲基化敏感多态性差异片段名称。0018图2是部分转基因植株甲基化敏感多态性差异片段从变性聚丙烯酰胺凝胶回收后再扩增的结果00。
15、19S4、S6、S7、S12、S13、S15、S17、S23为部分甲基化敏感多态性差异片段，0020M为DNA分子量标记。0021五具体发明实施方式0022实施例1转基因植株甲基化敏感性多态性差异片段的获得00231、转基因植株基因组DNA的提取0024在相同栽培条件下，培养转FHY3、GUS基因拟南芥以及野生型拟南芥幼苗，采用传统的CTAB法分别提取其基因组DNA。00252、转基因植株基因组DNA的酶切及连接0026委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成以下引物序列ECORI接头15CTCGTAGACTGCGTACC3、ECORI接头25AATTGGTACGCAGTC3、MSPI/HPA。
16、II接头15GATCATGAGTCCTGCT3、MSPI/HPAII接头25CGAGCAGGACTCATGA3。将ECORI接头1与ECORI接头2用蒸馏水溶解并混匀后，置于955MIN，然后在室温冷却，制得5PMOLECORI接头。将MSPI/HPAII接头1与MSPI/HPAII接头2用蒸馏水溶解混匀后，置于955MIN，然后在室温冷却，制得50PMOLMSPI/HPAII接头。选取两个对甲基化敏感的同位酶HPAII/MSPI分别与限制性内切酶ECORI进行组合，对转FHY3、GUS基因拟南芥以及野生型拟南芥基因组DNA在37双酶切6H。25L酶切体系包括1BUFFER，1G模板基因组DN。
17、A，1UECORI，1UHPAII/MSPI。把基因组DNA酶切片段与10L连接混合物混匀后，在16连接过夜，然后在65保温15MIN终止反应。10L连接混合物包括5PMOLECORI接头，50PMOLHPAII/MSPI接头，1UT4DNALIGASE，1BUFFERFORT4DNALIGASE。00273、预扩增0028分别以转基因拟南芥和野生型拟南芥基因组DNA的酶切连接产物为模板，利用ECORI预扩增引物5GACTGCGTACCAATTCA3和HPAII/MSPI预扩增引物5ATCATGAGTCCTGCTCGG3进行预扩增。25L反应体系包括1PCRBUFFER，04MMDNTP，12。
18、MMMGCL2，2L酶切连接产物，50NGECORI预扩增引物，50NGHPAII/MSPI预扩增引物，1UTAQ聚合酶。预扩增条件为94变性2MIN后，按以下参数扩增30个循说明书CN102080128ACN102080131A3/4页6环9430SEC，5630SEC，7260SEC，最后72延伸10MIN。用TEBUFFER按110的比例稀释预扩增产物。00294、选择性PCR扩增0030以稀释的预扩增产物为模板，利用ECORI选择性扩增引物在序列5GACTGCGTACCAATTCA3，的3端增加23个碱基和HPAII/MSPI选择性扩增引物在序列5，ATCATGAGTCCTGCTCGG。
19、3的3端增加24个碱基进行选择性PCR扩增。25L反应体系包括1PCRBUFFER，04MMDNTP，12MMMGCL2，4L预扩增产物，50NGECORI选择性扩增引物，50NGHPAII/MSPI选择性扩增引物，1UTAQ聚合酶。按下列参数PCR循环在94变性2MIN后，按以下参数先扩增13轮循环9430SEC，6530SEC每轮循环温度递减07，7260SEC；最后按下列参数扩增23轮循环9430SEC，5530SEC，7260SEC。00315、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳0032使用BIORAD公司的测序电泳装置SEQUIGENGT，对选择性PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。上样6。
20、L，恒功率70W电泳3H。电泳结束后，进行银染。对酶切片段进行MSAP分析能够反应酶切位点的甲基化状态及程度，将ECORIHPAII和ECORIMSPI酶切产物的扩增条带划分为4种类型类型I，ECORIHPAII和ECORIMSPI两条泳道均有带，无甲基化发生；类型II，ECORIHPAII泳道有带而ECORIMSPI泳道无带，单链DNA外部甲基化；类型III，ECORIHPAII泳道无带而ECORIMSPI泳道有带，双链DNA内部甲基化；类型IV，ECORIHPAII和ECORIMSPI两条泳道均无带，双链DNA的外部甲基化。比较转基因拟南芥和野生型拟南芥ECORIHPAII和ECORIMS。
21、PI双泳道的带型，重点分析转基因拟南芥中无甲基化、野生型拟南芥中甲基化的DNA差异片段，用一次性手术刀片从聚丙烯酰胺凝胶挖取转基因植株甲基化敏感多态性差异片段。0033实施例2转基因植株甲基化差异DNA片段的回收、克隆及测序00341、甲基化差异DNA片段的回收0035将挖取的转基因植株甲基化敏感多态性差异片段置于30L双蒸水中，煮沸5MIN。缓慢降至室温后离心，回收上清液。取4L上清液为模板进行PCR扩增，PCR反应条件与预扩增PCR反应一致。按照DNA回收纯化试剂盒上海生工生物工程技术服务有限公司产品说明书对PCR产物回收纯化。00362、甲基化差异DNA片段的克隆0037按照连接试剂盒上。
22、海生工生物工程技术服务有限公司产品说明书，将回收纯化的PCR产物连接到PUCMT载体，转化大肠杆菌菌株DH5。00383、甲基化差异DNA片段的测序0039本工作在上海生工生物工程技术服务有限公司进行。0040实施例3转基因植株非预期毒性的分析00411、打开KEGG数据库，输入转基因拟南芥中无甲基化、而野生型拟南芥中甲基化的DNA序列，分析该序列所涉及的代谢途径是否与毒性物质的合成有关。若序列所涉及的代谢途径与毒性物质的合成有关，说明转基因植株可能具有非预期毒性。00422、SOUTHERN杂交验证0043采用传统的CTAB法，分别提取转基因拟南芥、野生型拟南芥基因组DNA。若转基因说明书CN102080128ACN102080131A4/4页7植株甲基化差异DNA片段的序列所涉及的代谢途径与毒性物质的合成有关，将该序列按照地高辛标记与检测试剂盒ROCHE公司产品说明书标记成探针后，分别与转基因拟南芥、野生型拟南芥基因组DNA进行杂交。若杂交结果呈阳性，说明转基因植株甲基化差异DNA片段是PCR扩增的特异性产物，转基因植株具有非预期毒性。说明书CN102080128ACN102080131A1/1页8图1图2说明书附图CN102080128A。